Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết rong sagassum swartzii thu hoạch tại vùng biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT TỪ RONG SARGASSUM SWARTZII THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA Giảng viên hướng dẫn: TS Phan Thị Khánh Vinh TS Nguyễn Thế Hân Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Khuê Mã số sinh viên: 57130052 Khánh Hòa - 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT TỪ RONG SARGASSUM SWARTZII THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA GVHD: TS Phan Thị Khánh Vinh TS Nguyễn Thế Hân SVTH: Phạm Thị Khuê MSSV: 57130052 Khánh Hịa – 7/2019 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đồ án cơng trình nghiên cứu thực tôi, thực hướng dẫn khoa học TS Phan Thị Khánh Vinh TS Nguyễn Thế Hân Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận án cịn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Khánh Hịa, tháng năm 2019 Phạm Thị Khuê ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp mình, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy cô bạn Lời xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, thầy khoa tận tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hồn thành đề tài Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn TS Phan Thị Khánh Vinh TS Nguyễn Thế Hân tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, thầy phụ trách phịng thí nghiệm tạo điều kiện tốt sở vật chất, dụng cụ phịng thí nghiệm để tơi thực tốt đề án tốt nghiệp Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới thầy cô giúp đỡ, trang bị cho nhiều điều bổ ích, hành trang q báu giúp thêm vững bước đường tới Xin kính chúc thầy giáo thật nhiều sức khỏe để tiếp tục sứ mệnh trồng người Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt ý nghĩa tới gia đình, người thân bạn bè bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên để vượt qua khó khăn q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng năm 2019 Sinh viên thực Phạm Thị Khuê iii MỤC LỤC Đề mục Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn .ii Mục lục iii Danh mục hình vi Danh mục bảng viii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ix LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer rong biển 1.1.1 Bệnh Alzheimer 1.1.1.1 Khái niệm bệnh Alzheimer 1.1.1.2 Thực trạng bệnh 1.1.1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh Alzheimer 1.1.1.4 Các thuốc điều trị bệnh Alzheimer 1.1.2 Acetylcholine, enzyme acetylchoinesterase giả thuyết cholinergic 1.1.2.1 Acetylcholine 1.1.2.2 Enzyme acetylchoinesterase 1.1.2.3 Giả thuyết cholinergic .8 1.1.3 Tổng quan rong biển rong mơ Sargassum swartzii 1.1.3.1 Rong biển 1.1.3.2 Rong mơ Sargassum swartzii 1.2 Cơ sở lý thuyết 10 1.2.1 Một số phương pháp thường dùng nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 10 1.2.1.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman .11 1.2.1.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B 12 1.2.2 Cơ sở khoa học trình chiết 13 1.2.2.1 Một số phương pháp chiết truyền thống .14 1.2.2.2 Một số phương pháp tách chiết khác .15 iv 1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 16 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước có liên quan đến lĩnh vực đề tài 17 1.3.1 Nghiên cứu nước 17 1.3.2 Nghiên cứu giới 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Mẫu rong biển 21 2.1.1 Thu mẫu 21 2.1.2 Xử lý bảo quản mẫu 21 2.2 Hóa chất, dung mơi máy thiết bị 21 2.2.1 Hóa chất thuốc thử 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22 2.3.2 Giải thích sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23 2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng điều kiện chiết đến hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase dịch chiết rong Sargassum swartzii 24 2.3.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết .24 2.3.3.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết 26 2.3.3.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian chiết 27 2.3.3.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi 28 2.3.4 Bố trí thí nghiệm tách phân đoạn đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase phân đoạn .29 2.4 Phương pháp phân tích .30 2.4.1 Xác định số thành phần hóa học rong 30 2.4.2 Định tính số hợp chất tự nhiên có dịch chiết rong 31 2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme acetylcholinesterase .31 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết định lượng định tính số thành phần có rong Sargassum swartzii 35 3.1.1 Kết định lượng số thành phần hóa học rong .35 3.1.2 Kết định tính số hợp chất có dịch chiết rong 36 v 3.2 Kết ảnh hưởng điều kiện chiết đến hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase rong Sargassum swartzii 37 3.2.1 Kết ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết .37 3.2.2 Kết ảnh hưởng nhiệt độ chiết .39 3.2.3 Kết ảnh hưởng thời gian chiết 42 3.2.4 Kết ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi .44 3.3 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase rong Sargassum swartzii điều kiện thích hợp 46 3.4 Kết đánh giá khả ức chế enzyme acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết từ rong Sargassum swartzii 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 63 Phụ lục 1: Xác định số thành phần hóa học rong 63 Phụ lục 2: Cách tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 66 Phụ lục 3: Kết đo quang xác định ảnh hưởng điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase mơ sargassum swartzii .68 Phụ lục 4: Kết xác định khả ức chế enzyme acetylcholinesterase rong mơ Sargassum swartzii nồng độ khác chiết điều kiện thích hợp chọn 70 Phụ lục 5: Kết đo quang xác định khả ức chế enzyme acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết từ rong Sargassum swartzii .71 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1: Quá trình tổng hợp acetylcholine Hình 1.2: Rong Sargassum swartzii Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22 Hình 2.2: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase .25 Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 26 Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 27 Hình 2.5: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 28 Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm tách phân đoạn dịch chiết dung mơi khác hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 29 Hình 2.7: Quá trình phản ứng diễn phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 32 Hình 3.1: Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase rong (Chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05) .38 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase dịch chiết rong (Chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 40 Hình 3.3: Ảnh hưởng thời gian chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase dịch chiết rong (Chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 42 vii Hình 3.4: Ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase dịch chiết rong (Chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê p < 0.05) 44 Hình 3.5: Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase dịch chiết rong nồng độ khác 46 Hình 3.6: Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase phận đoạn dung môi chiết từ dịch chiết rong 49 viii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Phản ứng nhận biết số hợp chất dịch chiết rong 31 Bảng 3.1: Thành phần hóa học có rong 35 Bảng 3.2: Định tính số hợp chất có dịch chiết rong 36 Bảng 3.3: Giá trị IC50 số lồi rong có khả ức chế enzyme acetylchoinesterase 47 Bảng 3.4: Khối lượng chất khô hiệu suất chiết phân đoạn 48 Bảng 3.5: Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết rong .50 58 49 Janarthanan, M., Kumar, M S (2013), “Qualitative and quantitative analysis of phytochemical studies on selected seaweeds acanthopora spicifera and Sargassum wightii”, International Journal of Engineering Research and Development, 7(3), 11-5 50 Ji, N K., Kumar, R N., Bora, A., Amb, M K., & Chakraborthy, S (2009), “An evaluation of the pigment composition of eighteen marine macroalgae collected from Okha coast, Gulf of Kutch, India”, Our nature, 7(1), 48-55 51 Kang, K., Park, Y., Hwang, H J., Kim, S H., Lee, J G., & Shin, H C (2003), “Antioxidative properties of brown algae polyphenolics and their perspectives as chemopreventive agents against vascular risk factors”, Archives of pharmacal research, 26(4), 286-293 52 Kanimozhi, A S., Johnson, M., Malar, T R (2015), “Phytochemical composition of Sargassum Polycystum C Agardh and Sargassum Duplicatum J Agardh” Int J Pharm Pharm Sci, 7, 393-7 53 Kannan, R R., Aderogba, M A., Ndhlala, A R., Stirk, W A., & Van Staden, J (2013), “Acetylcholinesterase inhibitory activity of phlorotannins isolated from the brown alga, Ecklonia maxima (Osbeck) Papenfuss”, Food Research International, 54(1), 1250-1254 54 Khanavi, M., Toulabi, P B., Abai, M R., Sadati, N., Hadjiakhoondi, F., Hadjiakhoondi, A., & Vatandoost, H (2011), “Larvicidal activity of marine algae, Sargassum swartzii and Chondria dasyphylla, against malaria vector Anopheles stephensi”, Journal of vector borne diseases, 48(4), 241 55 Khanavi, M., Nabavi, M., Sadati, N., Shams Ardekani, M., Sohrabipour, J., Nabavi, S M B., & Ostad, S N (2010), “Cytotoxic activity of some marine brown algae against cancer cell lines”, Biological Research, 43(1), 31-37 56 Koutsaviti, A., Ioannou, E., Roussis, V (2018), “Bioactive Seaweeds for Food Applications”, Natural Ingredients for Healthy Diets, 25-52 57 Kumar, M., Kumari, P., Trivedi, N., Shukla, M K., Gupta, V., Reddy, C R K., & Jha, B (2011), “Minerals, PUFAs and antioxidant properties of some tropical 59 seaweeds from Saurashtra coast of India”, Journal of Applied Phycology, 23(5), 797-810 58 Lawrence, J F., Niedzwiadek, B., Menard, C., Lau, B P., Lewis, D., KuperGoodman, T., & Holmes, C (2001), “Comparison of liquid chromatography/mass spectrometry, ELISA, and phosphatase assay for the determination of microcystins in blue-green algae products”, Journal of AOAC International, 84(4), 1035-1044 59 Li, Y., Fu, X., Duan, D., Liu, X., Xu, J., & Gao, X (2017), “Extraction and identification of phlorotannins from the brown alga, Sargassum fusiforme (Harvey) Setchell”, Marine drugs, 15(2), 49 60 Machado, L P., Carvalho, L R., Young, M C M., Cardoso-Lopes, E M., Centeno, D C., Zambotti-Villela, L., & Yokoya, N S (2015), “Evaluation of acetylcholinesterase inhibitory activity of Brazilian red macroalgae organic extracts”, Revista Brasileira de Farmacognosia, 25(6), 657-662 61 Marinho-Soriano, E., Fonseca, P C., Carneiro, M A A., & Moreira, W S C (2006), “Seasonal variation in the chemical composition of two tropical seaweeds”, Bioresource Technology, 97(18), 2402-2406 62 McDermid, K J., Stuercke, B (2003), “Nutritional composition of edible Hawaiian seaweeds”, Journal of Applied Phycology, 15(6), 513-524 63 Mikiciuk-Olasik, E., Szymański, P., Żurek, E (2007), “Diagnostics and therapy of Alzheimer’s disease” 64 Murakami, K., Yamaguchi, Y., Noda, K., Fujii, T., Shinohara, N., Ushirokawa, T., & Katayama, M (2011), “Seasonal variation in the chemical composition of a marine brown alga, Sargassum horneri (Turner) C Agardh”, Journal of Food Composition and Analysis, 24(2), 231-236 65 Murugan, A C., Vallal, D., Karim, M R., Govidan, N., Yusoff, M B M., & Rahman, M M (2015), “In vitro antiradical and neuroprotective activity of polyphenolic extract from marine algae Padina autralis”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research”, 7(8), 355-362 60 66 Nakai, M., Kageyama, N., Nakahara, K., & Miki, W (2006), “Phlorotannins as Radical Scavengers from the Extract of Sargassum ringgoldianum”, Marine Biotechnology, 8(4), 409-414 67 Natarajan, S., Shanmugiahthevar, K P., Kasi, P D (2009), “Cholinesterase inhibitors from Sargassum and Gracilaria gracilis: seaweeds inhabiting South Indian coastal areas (Hare Island, Gulf of Mannar)”, Natural product research, 23(4), 355-369 68 Neethu, P V., Suthindhiran, K., Jayasri, M A (2017), “Antioxidant and antiproliferative activity of Asparagopsis taxiformis” Pharmacognosy research, 9(3), 238 69 Nurjanah, N M., Anwar, E., Luthfiyana, N., & Hidayat, T (2017), “Identification of bioactive compounds of seaweed Sargassum sp and Eucheuma cottonii doty as a raw sunscreen cream”, Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences: B Life and Environmental Sciences, 54(4), 311-318 70 Peng, L., Rong, Z., Wang, H., Shao, B., Kang, L., Qi, H., & Chen, H (2017), “A novel asay to determine Acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer’s disease”, Biomedical Chromatography, Mar 10 71 Peng, Y., Xie, E., Zheng, K., Fredimoses, M., Yang, X., Zhou, X., & Liu, Y (2013), “Nutritional and chemical composition and antiviral activity of cultivated seaweed Sargassum naozhouense Tseng et Lu”, Marine drugs, 11(1), 20-32 72 Rao, S P V., Reriyasamy, C., Kumar, K S., & Anantharaman, p (2018), “Seaweeds: distribution, production and uses”, Bioprospecting of algae, 6, 59-79 73 Renaud, S M., Luong-Van, J T (2006), “Seasonal variation in the chemical composition of tropical Australian marine macroalgae”, In Eighteenth International Seaweed Symposium, 155-161 74 Rengasamy, K R., Amoo, S O., Aremu, A O., Stirk, W A., Gruz, J., Šubrtová, M., & Van Staden, J (2015), “Phenolic profiles, antioxidant capacity, and acetylcholinesterase inhibitory activity of eight South African seaweeds”, Journal of applied phycology, 27(4), 1599-1605 61 75 Robledo, D., Freile-Pelegrin, Y (1997), “Chemical and mineral composition of six potentially edible seaweed species of Yucata´n”, Botanica Marina, 40, 301-306 76 Ryu, G., Park, S H., Kim, E S., Choi, B W., Ryu, S Y., & Lee, B H (2003), “Cholinesterase inhibitory activity of two farnesylacetone derivatives from the brown alga Sargassum sagamianum”, Archives of pharmacal research, 26(10), 796-799 77 Suffiness, M (1989), “Development of antitumor natural products at the National Cancer Institute”, Gann Monograph on Cancer Research, 36, 21-44 78 Suganthy, N., Pandian, S K., Devi, K P (2010), “Neuroprotective effect of seaweeds inhabiting South Indian coastal area (Hare Island, Gulf of Mannar Marine Biosphere Reserve): Cholinesterase inhibitory effect of Hypnea valentiae and Ulva reticulata”, Neuroscience Letters, 468(3), 216-219 79 Spigno, G., Tramelli, L., Faveri, D M (2007), “Effects of extraction time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics”, Journal of Food Engineering, 8(1), 200-208 80 Stirk, W A., Reinecke, D L., Van Staden, J (2007), “Seasonal variation in antifungal, antibacterial and acetylcholinesterase activity in seven South African seaweeds”, Journal of Applied Phycology, 19(3), 271-276 81 Subramaniam, D., Menon, T., Elizabeth, H L., & Swaminathan, S (2014), “AntiHIV-1 activity of Sargassum swartzii a marine brown alga”, BMC Infectious Diseases 82 Tang, Z M., Wang, Z Y, Kang, J W (2007), “Screening of Acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophortically mediated microanalysis techique”, Electrophoresis, (28), 360-365 83 Thoudam, B T., Kirithika, T., Kamala, S K., & Usha, D K (2011), “Phytochemical screening and antioxidant activity of various extracts of Sargassum muticum”, 3(10), 25-30 84 Torres, M R., Sousa, A P., Silva Filho, E A., Melo, D F., Feitosa, J P., De Paula, R C., & Lima, M G (2007), “Extraction and physicochemical characterization of 62 Sargassum vulgare alginate from Brazi”, Carbohydrate research, 342(14), 20672074 85 Trigui, M., GasmiImen, L., Zouari, T., & Tounsi, S (2013), “Seasonal variation in phenolic composition, antibacterial and antioxidant activities of Ulva rigida (Chlorophyta) and assessment of antiacetylcholinesterase potential”, Journal of Applied phycology, 25(1), 319-328 86 Tung, B T., Son, P K., Thu, D K., Hai, N T., Bach, N X., & Thu, N T K (2017), “Evaluation of Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Fractions from Mahonia nepalensis (Berberidaceae) Extract”, VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, 33(2) 87 Van Asperen, K (1962), “A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method”, Journal of Insect Physiology, 8(4), 401-416 88 Vijayabaskara, P., Vaseelaa, N., Thirumaranb, G (2012), “Potential antibacterial and antioxidant properties of a sulfated polysaccharide from the brown marine algae Sargassum swartzii”, Chinese Journal of Natural Medicines, 10(6), 421-428 89 Whitehouse, P J (1982), “Alzheimer‟s disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain”, 1(1), 45 90 Wong, B Y., Tan, C P., Ho, C W (2013), “Effect of solid-to-solvent ratio on phenolic content and antioxidant capacitics of Dukung Anak”, International Food Research Journal, 20(1) 91 Yadav, M., Chatterji, S., Gupta, S K., & Watal, G (2014), “Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine”, Int J Pharm Pharm Sci, 6(5), 539-542 92 Yoon, N Y., Chung, H Y., Kim, H R., & Choi, J S (2008), “Acetyl‐and butyrylcholinesterase inhibitory activities of sterols and phlorotannins from Ecklonia stolonifera”, Fisheries Science, 74(1), 200-207 63 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Xác định số thành phần hóa học rong 1.1 Thí nghiệm xác định hàm ẩm Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Dùng cốc sấy, rửa sạch, úp khô, sấy nhiệt độ 105 °C giờ, làm nguội bình hút ẩm mang cân, sau sấy tiếp nhiệt độ trên, lấy làm nguội đem cân lần 2, sấy đến khối lượng lần cân liên tiếp sai khác không 5.10-4 g (khối lượng không đổi) Tiến hành: Cân xác khoảng g mẫu bột rong cho vào cốc sấy đến khối lượng không đổi Dàn mẫu cốc, cho cốc vào tủ sấy, sấy 60 °C Sau nâng nhiệt độ lên 105 °C, sấy liên tục Sau sấy, lấy mẫu làm nguội bình hút ẩm cân cân phân tích, sau sấy tiếp đến khối lượng khơng đổi Công thức xác định hàm ẩm: W = 𝐺1−𝐺2 𝐺1− 𝐺 × 100% Trong đó: W: độ ẩm ngun liệu (%) G: Khối lượng cốc sau sấy đến khối lượng không đổi (g) G1: Khối lượng cốc mẫu trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi (g) * Kết xác định hàm lượng ẩm Số lần lặp Khối Khối lượng cốc lượng cốc + mẫu trước sấy sấy (G) (G1) 37,5494 40,5594 30,2171 33,2171 Khối lượng cốc + mẫu sau sấy (G2) 40,1026 32,7603 Kết hàm ẩm (%) 15,18 15,23 Trung bình lần lặp (%) 15,21 ± 0.03 1.2 Thí nghiệm xác định hàm lượng tro Nung cốc sứ rửa lò nung 550 °C – 600 °C đến khối lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm mang cân cân phân tích xác đến 5.10-4 g Tiến hành: Cân xác khoảng g rong cho vào cốc nung đến khối lượng khơng đổi Cân tất cân phân tích với độ xác 5.10-4 g Dàn mẫu cốc, cho cốc chứa mẫu vào tủ nung, tăng nhiệt độ từ từ đến 550 °C – 600 °C Nung cho 64 đến tro trắng, thông thường khoảng - Trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích có độ xác Tiếp tục nung thêm 30 phút để nguội bình hút ẩm cân, lặp lặp lại khối lượng không đổi Kết lần nung cân liên tiếp không cách 5.10-4 g Công thức xác định hàm ẩm: X = 𝐺2−𝐺 𝐺1− 𝐺 × 100% Trong đó: X: Hàm lượng tro (%) G: Khối lượng cốc sau nung (g) G1: Khối lượng cốc mẫu trước nung (g) G2: Khối lượng cốc nung tro trắng (g) * Kết xác định hàm lượng tro Số lần lặp Khối Khối lượng cốc Khối lượng lượng cốc + mẫu trước cốc + mẫu nung (G) nung (G1) sau nung (G2) 37,5491 30,2173 40,5591 33,2173 38,4248 31,0830 Kết hàm lượng tro (%) 29,09 28,86 Trung bình lần lặp (%) 28,97 ± 0,16 1.3 Thí nghiệm xác định hàm lượng lipid Nguyên lý: Dùng hỗn hợp dung môi Chloroform methanol với tỉ lệ 2:1 để hòa tan tất chất béo mẫu, tách lớp chiết qua phễu lọc nhiều lần Sau làm bay hết dung môi, cân chất béo cịn lại tính hàm lượng lipid 100 gam mẫu Tiến hành: Chuẩn bị mẫu: Cân g mẫu bột rong cho vào bình tam giác, thêm 600 µl nước cất, ml methanol, ngâm mẫu khoảng 10 phút Đồng hóa mẫu phút Lọc, lấy dịch lọc Cho thêm ml methanol 10 ml chloroform, đồng hóa mẫu 20 giây Lọc lấy dịch lọc cho vào phễu chiết Hút 7,5 ml NaCl 0,9% cho vào dung dịch mẫu, đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần giữ mẫu oC khoảng để dịch mẫu phân chia thành lớp Chiết rút dung dịch: Tách lớp (chứa hàm lượng lipit hịa tan dung mơi) vào phễu chiết thể tích 50 ml Loại bỏ lớp dịch phía (chứa tạp chất loại 65 nước, muối, protein …) Xác định thể tích dịch chiết thu (Vdm) Cho ml CH3OH 50% cho vào phễu chiết, đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần Cho phân chia thành lớp lắng qua đêm oC Định lượng lipid: Lớp rút chảy xuống bình cầu 100 ml Cô quay chân không đuổi dung môi đến thể tích cịn khoảng ml Hịa tan mẫu lại với lượng thể tích nhỏ chloroform Chuyển mẫu qua bình định mức ml, tráng sửa bình cầu nhiều lần định mức chloroform vừa đủ ml Xác định hàm lượng lipid: Lấy xác ml (Vm) dung dịch mẫu cho vào cốc thủy tinh có nắp ml sấy khô đến khối lượng không đổi Cho cốc vào sấy đến khối lượng khơng đổi Cơng thức tính hàm lượng Lipit tổng số: (𝑚1 − 𝑚0 ) × 𝑉𝑑𝑚 𝑔 %𝑋 ( ) = × 100 𝑔 𝑚 × 𝑇 × 𝑉𝑚 Trong đó: X: Hàm lượng lipit tổng số tính theo trọng lượng khơ mẫu (%) m1: Khối lượng cân cốc mẫu sau sấy (g) m0: Khối lượng cân cốc khối lượng không đổi (g) m: Khối lượng cân mẫu (g) Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (ml) Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml) T: Thành phần khô mẫu, T = (100-W)/100 * Kết xác định hàm lượng lipid Khối lượng cốc sấy (m0) Khối lượng cốc + mẫu sau sấy (m1) 37,5493 37,5507 Khối lượng cân mẫu (m) 1,0 Thể tích định mức sau xử lý (Vdm) 3,6 Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (Vm) 2,0 Thành phần khô mẫu (T) 0,85 Kết (%) 0,29 66 Phụ lục 2: Cách tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase  Chuẩn bị hóa chất + Pha dung dịch đệm: (được pha muối) 0,35g NaH2PO4 1,65g Na2HPO4 1000 ml nước cất lần + Pha chất Acetylthiocholine iodid (ATCI) [3Mm] 𝑚 = 𝐶𝑀 ∗ 𝑉 ∗ 𝑀 Trong đó: m: khối lượng chất cần pha (g) CM: nồng độ chất ACTI (mM) V: tích cần pha chất ACTI (ml) M: khối lượng mol chất ACTI (g/mol) + Pha enzyme AChE: Hút 10 ml dung dịch đệm cho vào lọ enzyme lắc nhẹ, để enzyme hòa tan dung dịch Sau chia làm phần: ml enzyme mang bảo quản tủ đơng, ml enzyme cịn lại pha loãng 100 ml nước cất lần pha để nồng độ 0,5 unit Hút enzyme pha cho vào ống nhỏ bảo quản tủ đơng sử sử dụng cho lần thí nghiệm + Pha chất thử DTNB: tương tự pha chất ACTI nồng độ mM + Pha Na2CO3: pha nồng độ 0,1 mol cách pha tương tự pha chất  Pha mẫu nồng độ + Dung dịch mẫu thử điều kiện chiết: Hút xác ml dịch chiết sau quay điều kiện chiết (nồng độ dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết tỷ lệ NL/DM), pha lỗng ml nước cất Sau tiến hành đánh giá hoạt tính cức chế enzyme dịch chiết + Dung dịch mẫu thử dịch chiết tối ưu: Dịch chiết sau sau cô quay pha loãng nồng độ 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 10,0 mg/ml theo công thức C1V1 = C2V2 Trong đó: C1: nồng độ mẫu cần pha (mg/ml), V1: thể tích dung dịch pha lỗng (ml), C2: nồng độ chất khơ rong (mg/ml), V2: thể tích rong cần hút (ml) + Dung dịch mẫu thử phân đoạn n-hexane, ethyl acetate, butanol, nước: Dịch chiết phân đoạn sau quay hịa tan lại DMSO pha loãng 67 nồng độ 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 3,0 mg/ml tương tự cách pha dung dịch mẫu thử dịch chiết tối ưu  Chuẩn bị mẫu đo quang + Mẫu rong: cho vào ống nghiệm dung dịch gồm: 2,2 ml đệm natri phosphat, 0,1 ml mẫu rong 0,1 ml enzyme Hỗn hợp dung dịch lắc ủ 37 °C phút Sau đó, thêm 0,1 ml chất ACTI, 0,1 ml thuốc thử DTNB vào hỗn hợp lắc Tiếp tục ủ hỗn hợp 30 phút 37 °C Sau đó, cho vào dung dịch ml Na2CO3, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm tính phần trăm ức chế Mỗi thử nghiệm lặp lại lần + Mẫu control (mẫu đối chứng): cho vào ống nghiệm dung dịch gồm: 2,2 ml đệm natri phosphat, 0,1 ml nước cất 0,1 ml enzyme Hỗn hợp dung dịch lắc ủ 37 °C phút Sau đó, thêm 0,1 ml chất ACTI, 0,1 ml thuốc thử DTNB vào hỗn hợp lắc Tiếp tục ủ hỗn hợp 30 phút 37 °C Sau đó, cho vào dung dịch ml Na2CO3, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm tính phần trăm ức chế Mỗi thử nghiệm lặp lại lần + Mẫu blank (mẫu trắng): cho vào ống nghiệm dung dịch gồm: 2,2 ml đệm natri phosphat, 0,1 ml mẫu rong 0,1 ml đệm natri phosphat Hỗn hợp dung dịch lắc ủ 37 °C phút Sau đó, thêm 0,1 ml dung dịch chất ACTI, 0,1 ml dung dịch thuốc thử DTNB vào hỗn hợp lắc Tiếp tục ủ hỗn hợp 30 phút 37 °C Sau đó, cho vào dung dịch 3ml Na2CO3, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm tính phần trăm ức chế Mỗi thử nghiệm lặp lại lần 68 Phụ lục 3: Kết đo quang xác định ảnh hưởng điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase mơ sargassum swartzii 3.1: Kết xác định ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết Nồng độ Lần lặp methanol lại (%) 25 50 75 100 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Mẫu Control Blank 0,427 0,601 0,094 0,434 0,590 0,097 0,414 0,589 0,103 0,331 0,595 0,059 0,322 0,605 0,061 0,318 0,587 0,055 0,281 0,601 0,073 0,296 0,613 0,073 0,287 0,597 0,077 0,253 0,586 0,084 0,244 0,603 0,085 0,259 0,591 0,089 0,399 0,603 0,021 0,407 0,595 0,028 0,413 0,612 0,025 Khả ức chế enzyme AChE (%) 44,59 43,39 47,20 54,29 56,86 55,20 65,39 63,62 64,82 71,16 73,63 71,24 37,31 36,30 36,60 Trung bình (%) 45,06 ± 1,94 55,45 ± 1,31 64,61 ± 0,90 72,01 ± 1,41 36,74 ± 0,52 3.2: Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết Nhiệt độ chiết (oC) 30 45 60 75 90 Lần lặp lại 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,301 0,305 0,297 0,288 0,275 0,290 0,245 0,265 0,251 0,344 0,351 0,339 0,451 0,459 0,460 0,585 0,595 0,601 0,605 0,612 0,590 0,594 0,585 0,602 0,603 0,601 0,598 0,609 0,587 0,597 0,059 0,053 0,051 0,067 0,061 0,069 0,084 0,091 0,085 0,081 0,079 0,076 0,075 0,069 0,070 Khả ức chế enzyme AChE (%) 58,84 57,65 59,07 63,47 65,03 62,54 72,90 70,26 72,43 56,38 54,74 56,02 38,26 33,56 34,67 Trung bình (%) 58,52 ± 0,76 63,68 ± 1,26 71,86 ± 1,41 55,72 ± 0,86 35,50 ± 2,45 69 3.3: Kết xác định ảnh hưởng thời gian chiết Thời gian chiết (phút) Lần lặp lại 30 60 90 120 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,299 0,315 0,309 0,252 0,249 0,265 0,257 0,249 0,263 0,301 0,289 0,299 0,612 0,587 0,596 0,597 0,589 0,603 0,591 0,598 0,603 0,589 0,593 0,601 0,071 0,074 0,069 0,089 0,084 0,090 0,095 0,097 0,102 0,105 0,107 0,103 Khả ức chế enzyme AChE (%) 62,75 58,94 59,73 72,70 71,99 70,98 72,59 74,58 73,30 66,72 69,31 67,39 Trung bình (%) 60,47 ± 2,01 71,89 ± 0,86 73,49 ± 1,01 67,81 ± 1,34 3.4: Kết xác định ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 1/20 1/30 1/40 Lần lặp lại 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,339 0,352 0,359 0,258 0,245 0,266 0,301 0,295 0,283 0,437 0,441 0,429 0,597 0,612 0,605 0,595 0,603 0,587 0,611 0,593 0,607 0,598 0,602 0,588 0,095 0,103 0,101 0,091 0,087 0,088 0,079 0,070 0,077 0,061 0,060 0,065 Khả ức chế enzyme AChE (%) 59,13 59,31 57,36 71,93 73,80 69,68 63,67 62,06 66,06 37,12 36,71 38,10 Trung bình (%) 58,60 ± 1,08 71,80 ± 2,06 63,93 ± 2,01 37,31 ± 0,71 70 Phụ lục 4: Kết xác định khả ức chế enzyme acetylcholinesterase rong mơ Sargassum swartzii nồng độ khác chiết điều kiện thích hợp chọn Nồng độ mg/ml 0,5 1,0 2,5 5,0 7,5 10,0 Lần lặp lại 3 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,585 0,579 0,568 0,555 0,551 0,543 0,512 0,497 0,524 0,451 0,441 0,438 0,368 0,349 0,358 0,285 0,278 0,271 0,607 0,611 0,589 0,593 0,605 0,588 0,605 0,596 0,611 0,612 0,604 0,593 0,601 0,611 0,595 0,586 0,607 0,597 0,005 0,008 0,008 0,017 0,012 0,015 0,035 0,029 0,032 0,045 0,048 0,044 0,062 0,063 0,067 0,086 0,081 0,083 Khả ức chế enzyme AChE (%) 4,45 6,55 4,92 9,27 10,91 10,20 21,16 21,48 19,48 33,66 34,93 33,56 49,08 53,19 51,09 66,04 67,55 68,51 Trung bình (%) 5,31 ± 1,10 10,13 ± 0,82 20,70 ± 1,07 34,05 ± 0,76 51,12 ± 2,05 67,37 ± 1,24 71 Phụ lục 5: Kết đo quang xác định khả ức chế enzyme acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết từ rong Sargassum swartzii  Phân đoạn n-hexane Nồng độ mg/ml 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Lần lặp lại 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,599 0,604 0,024 0,611 0,603 0,029 0,595 0,59 0,031 0,591 0,615 0,035 0,601 0,605 0,036 0,589 0,598 0,038 0,577 0,608 0,041 0,580 0,599 0,041 0,565 0,587 0,043 0,559 0,605 0,051 0,563 0,594 0,047 0,571 0,601 0,049 0,559 0,611 0,059 0,546 0,605 0,055 0,561 0,598 0,061 Khả ức chế enzyme AChE (%) 4,80 3,48 4,41 9,59 6,61 7,86 11,84 10,02 11,07 16,03 13,13 13,14 18,17 18,84 16,39 Trung bình (%) 4,23 ± 0,67 8,02 ± 1,49 10,98 ± 0,92 14,10 ± 1,67 17,80 ± 1,26  Phân đoạn ethyl acetate Nồng độ mg/ml 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Lần lặp lại 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,453 0,463 0,461 0,446 0,452 0,438 0,407 0,405 0,416 0,374 0,384 0,369 0,341 0,339 0,323 0,597 0,599 0,591 0,599 0,612 0,605 0,595 0,607 0,610 0,606 0,599 0,615 0,611 0,598 0,607 0,015 0,013 0,011 0,021 0,025 0,026 0,035 0,031 0,035 0,038 0,041 0,037 0,051 0,048 0,053 Khả ức chế enzyme AChE (%) 26,63 24,87 23,86 29,05 30,23 31,90 37,48 38,39 37,54 44,55 42,74 46,02 52,54 51,34 55.52 Trung bình (%) 25,12 ± 1,41 30,39 ± 1,43 37,80 ± 0,51 44,44 ± 1,64 53,13 ± 2,15 72  Phân đoạn n-butanol Nồng độ mg/ml 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Lần lặp lại 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,545 0,529 0,548 0,521 0,534 0,525 0,501 0,496 0,487 0,451 0,467 0,481 0,448 0,454 0,435 0,601 0,589 0,595 0,605 0,595 0,591 0,595 0,592 0,601 0,593 0,599 0,601 0,606 0,612 0,601 0,003 0,001 0,003 0,008 0,013 0,008 0,015 0,017 0,013 0,022 0,023 0,028 0,034 0,031 0,031 Khả ức chế enzyme AChE (%) 9,82 10,36 8,40 15,21 12,44 12,52 18,32 19,09 21,13 27,66 25,88 24,63 31,68 30,88 32,78 Trung bình (%) 9,53 ± 1,01 13,39 ± 1,57 19,51 ± 1,45 26,05 ± 1,52 31,78 ± 0,95  Phân đoạn nước Nồng độ mg/ml 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Lần lặp lại 3 3 Đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Rong Control Blank 0,586 0,591 0,001 0,590 0,595 0,002 0,593 0,601 0,002 0,589 0,595 0,004 0,584 0,591 0,005 0,590 0,601 0,004 0,578 0,589 0,008 0,583 0,594 0,010 0,588 0,601 0,007 0,570 0,586 0,011 0,573 0,591 0,013 0,571 0,590 0,011 0,569 0,593 0,015 0,577 0,601 0,017 0,564 0,589 0,015 Khả ức chế enzyme AChE (%) 1,02 1,18 1,66 1,68 2,03 2,50 3,23 3,54 3,33 4,61 5,25 5,08 6,58 6,82 6,79 Trung bình (%) 1,29 ± 0,34 2,07 ± 0,41 3,36 ± 0,15 4,98 ± 0,33 6,73 ± 0,13 ... PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT TỪ RONG SARGASSUM SWARTZII THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA GVHD: TS Phan Thị Khánh Vinh TS Nguyễn... Dịch chiết từ rong thành phần rong biển chứng minh nhiều nghiên cứu có hoạt tính ức chế mạnh enzyme AChE [43] [60] [67] [78] [92] Các nghiên cứu chiết xuất rong biển có tiềm ứng dụng ức chế enzyme. .. nguyên rong biển dồi đến Việt Nam cơng trình nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme AChE thực đối tượng rong biển hạn chế Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài ? ?Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase