Phân tích các peptide trong nọc độc ốc nón conus bandanus ở vùng biển khánh hòa bằng phương pháp RP LC off line MALDI TOF MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HÀ THỊ HẰNG PHÂN TÍCH CÁC PEPTIDE TRONG NỌC ĐỘC ỐC NĨN CONUS BANDANUS Ở VÙNG BIỂN KHÁNH HỊA BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP- LC OFF-LINE MALDI-TOF MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HÀ THỊ HẰNG PHÂN TÍCH CÁC PEPTIDE TRONG NỌC ĐỘC ỐC NĨN CONUS BANDANUS Ở VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP- LC OFF-LINE MALDI-TOF MS LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: Quyết định giao đề tài: 1539/QĐ-ĐHNT ngày 26/12/2018 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: 1: TS NGUYỄN BẢO 2: PGS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA Chủ tịch hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Phân tích peptide nọc độc ốc nón Conus bandanus vùng biển Khánh Hòa phương pháp RP-LC offline MALDI-TOF MS” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác mà khơng có tên đồng tác giả thời điểm Nha Trang, Ngày 15 tháng 10 năm 2019 Hà Thị Hằng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhà trường, tổ chức có liên quan tạo điều kiện; quý thầy (cô), bạn bè giúp đỡ hỗ trợ nhiệt tình Qua tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: - Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang Phòng, Ban, Khoa, Viện liên quan cho phép tạo điều kiện thuận lợi để đề tài thực - Các cán kỹ thuật Viện Công nghệ Sinh học Môi trường; Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành trường Đại học Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện trình tiến hành thực nghiên cứu - Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) - Mã số đề tài: 106-NN.022015.14 - Đã tài trợ cho nghiên cứu - Sự hợp tác giúp đỡ nhiệt tình học viên, sinh viên tham gia dự án - Đặc biệt hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Bảo PGS.TS Ngơ Đăng Nghĩa giúp tơi hồn thành tốt đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, Ngày 15 tháng 10 năm 2019 Hà Thị Hằng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN……………………………………………… ……………… i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .5 1.1 Tổng quan ốc nón Conus 1.1.1 Phân bố ốc nón Conus Việt Nam Thế giới 1.1.2 Hình thái, phân loại định danh ốc nón Conus 1.1.3 Đặc điểm sinh học, sinh sản 1.1.4 Cấu tạo ốc nón Conus 1.2 Tổng quan tuyến nọc độc độc tố ốc nón Conus .12 1.2.1 Tuyến nọc độc 12 1.2.2 Độc tố ốc nón 15 1.2.3 Giá trị dược liệu độc tố ốc nón 18 1.3 Tình hình nghiên cứu độc tố ốc nón Conus Việt Nam Thế giới 20 1.3.1 Ở Việt Nam 20 1.3.2 Trên Thế giới 23 1.4 Các phương pháp phân tích 25 1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 25 1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC) 27 1.4.3 Phương pháp khối phổ MALDI-TOF/TOF MS .30 iii CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu .36 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .36 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 36 2.1.3 Thiết bị hóa chất 37 2.2 Phương pháp nghiên cứu 38 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 38 2.2.2 Khảo sát chế độ tách chiết độc tố thô ốc nón C bandanus 39 2.2.3 Phân vùng sơ độc tố thơ ốc nón C bandanus kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo (RP- HPLC) .44 2.2.4 Phân tích phân đoạn peptide độc tố thơ ốc nón C bandanus kỹ thuật khối phổ MALDI - TOF MS 45 2.3 Phương pháp xử lý số liệu .47 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Kết xác định chế độ dung môi tách chiết độc tố thơ ốc nón C bandanus phù hợp 48 3.2 Kết xác định chế độ ly tâm tách chiết độc tố thơ ốc nón C bandanus phù hợp…………… ……49 3.3 Kết khảo sát lực ly tâm ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi dịch chiết công đoạn siêu lọc 10kDa cho độc tố thơ ốc nón C bandanus 49 3.4 Kết phân tích phổ khối (MS) theo cách thu mẫu nọc độc thô khác qua cột C18 ốc nón C bandanus kỹ thuật MALDI -TOF/TOF MS 50 3.4.1 Kết phân tích khối phổ MS nọc độc ốc nón C bandanus theo cách thu mẫu tồn độc tố (từ phút thứ 10 đến phút 55 ) qua cột Vy dac C18 (cách thu mẫu 1) 50 3.4.2 Kết phân tích khối phổ nọc độc thơ ốc nón C bandanus với cách thu mẫu theo phân vùng qua cột C18 (cách thu mẫu 2) 52 iv 3.4.3 Kết phân tích khối phổ (MS) nọc độc ốc nón C bandanus theo cách thu mẫu phân đoạn theo phút (từ phút thứ 10 - phút thứ 100) qua cột Vydac C18 (cách thu mẫu 3) 57 3.5 Kết so sánh conopeptides quan sát nọc độc ốc nón C bandanus vùng biển Khánh Hòa với liệu công bố ConoServer.org .65 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Kí hiệu Giải thích KLPT Khối lượng phân tử LC Liquid chromatography MALDI Matrix assisted Phương pháp sắc ký lỏng laser desorption/-ionization MS Mass spectrometry Khối phổ m/z mass/ electric charge Tỉ số khối lượng điện tích RP-HPLC Reversed Phase - High- Phương pháp sắc ký lỏng pha Liquid đảo hiệu cao Performance Chromatography S-S Liên kết disulfid TLTK Tài liệu tham khảo TOF Time of flight Thời gian bay vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại conopeptide theo khung cysteine…………………………… 17 Bảng 1.2 Một số ứng dụng trị liệu độc tố ốc nón 19 Bảng 3.1 Kết xác định hàm lượng protein dịch chiết độc tố thơ ốc nón C bandanus phương pháp chiết khác (chi tiết phụ lục 1) 48 Bảng 3.2 Mô tả trạng thái dịch ly tâm ảnh hưởng lực ly tâm .49 Bảng 3.3 Mô tả trạng thái dịch ly tâm ảnh hưởng thời gian ly tâm 3500xg 49 Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi dịch chiết ảnh hưởng lực ly tâm 10 phút công đoạn siêu lọc 10 kDa 50 Bảng 3.5 So sánh KLPT conopeptides quan sát nọc độc ốc nón C bandanus vùng biển Khánh Hịa với liệu cơng bố Conoserver.org 66 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ phân bố ốc nón Conus giới (Gao et al., 2017)… ….5 Hình 1.2 Hình thái hoa văn vỏ số lồi ốc nón Conus .6 Hình 1.3 Phân loại ốc nón Conus dựa hình thái vỏ Hình 1.4 Phân loại ốc nón Conus dựa vào màu sắc, hoa văn vỏ Hình 1.5 Các phận bên ngồi ốc nón Conus Hình 1.6 Cách săn mồi dạng móc câu ốc nón Conus 11 Hình 1.7 Cách săn mồi dạng lưới ốc nón Conus .11 Hình 1.8 Ốc nón ăn nhuyễn thể C bandanus 12 Hình 1.9 Ốc nón Conus ăn giun biển .12 Hình 1.10 Cấu tạo tuyến nọc độc ốc nón Conus .13 Hình 1.11 Cấu tạo kitin loài ăn cá 14 Hình 1.12 Cấu tạo kitin loài ăn nhuyễn thể .15 Hình 1.13 Cấu tạo kitin lồi ăn giun biển 15 Hình 1.14 Hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao 25 Hình 1.15 Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ 27 Hình 1.16 Cấu trúc cột ODS .28 Hình 1.17 Các giai đoạn diễn sắc ký pha đảo 30 Hình 1.18 Sơ đồ cấu tạo đơn giản hệ thống khối phổ 31 Hình 1.19 Khay đựng mẫu chất MALDI-TOF MS 33 Hình 1.20 Sơ đồ minh họa hoạt động hệ thống MALDI-TOF/TOF (Kenny D J et al., 2006) .34 Hình 2.1 Hình thái bên ngồi ốc nón C bandanus 36 Hình 2.2 Tuyến nọc độc ốc nón C bandanus 37 Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu độc tố ốc nón C bandanus 38 viii 17 Gao B., Peng C., Yang J., Yi J., Zhang J and Shi Q (2017), "Cone snails: A big store of conotoxins for novel drug discovery", Toxins, 9(12), pp 1–17 doi: 10.3390/toxins9120397 18 Guerrera I C., Kleiner O (2005), "Application of mass spectrometry in proteomics", Успехи Современного Естествознания, Bioscience Reports, 25(1-2): pp 71-93 19 Halai R (2009), "The story of alpha-conotoxins, Vc1.1 and RgIA, on their journey to becoming therapeutics" The University of Queensland 20 Hylleberg J (2003), "Marine Molluscs of Vietnam", Available at: https://www.forskningsdatabasen.dk/en/catalog/2389241592 (Accessed: August 2019) 21 Ekberga J., Craikb J D., Adams J D (2008), "Conotoxin modulation of voltage-gated sodium channels", The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, pp 2363-2368 Available at: http://cataleg.uab.cat/record=b1006214 22 Junior V H., Paula B J., Junior V J C (2006), "Venomous mollusks : the risks of human accidents by Conus snails (Gastropoda : Conidae) in Brazil", Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 39(5):498-500, set-out, 2006 22 Kantor Y (2007), "How much can Conus swallow? observations on molluscivorous species", Journal of Molluscan Studies, 73(2), pp 123–127 doi: 10.1093/mollus/eym005 23 Kaas Q., Westermann C., David, Craik J (2010), "Conopeptide characterization and classifications: An analysis using ConoServer", Toxicon, pp 1491–1509 https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2010.03.002Get rights and content 24 Kenny D J., Brown J M., Palmer M E., Snel M F., and Bateman R H (2006), "A parallel approach to post source decay MALDI-TOF analysis", Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 17(1), pp 60–66 doi: 10.1016/j.jasms.2005.09.006 25 Kohn A J (2001), "Maximal species richness in Conus: Diversity, diet and habitat on reefs of northeast Papua New Guinea", Coral Reefs, 20(1), pp 25– 38 doi: 10.1007/s003380100141 26 Kumar S P., Dhanabalan Senthil Kumar S D., Umamaheswari S., (2015), "A perspective on toxicology of Conus venom peptides Palanisamy", Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, pp 337-351 doi:10.1016/S19957645(14)60342-4 27 Kuzyk M A., Ohlund L B., Elliott M H., Smith D., Qian H., Delaney A., Hunter C L., Borchers C H (2009), "A comparison of MS/MS-based, stableisotope-labeled, quantitation performance on ESI-quadrupole TOF and MALDI-TOF/TOF mass spectrometers", Proteomics 2009 Jun, 9(12):332840 doi: 10.1002/p 27 Lau J L and Dunn M K (2018), "Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions", Bioorganic and Medicinal Chemistry The Authors, 26(10), pp 2700–2707 doi: 10.1016/j.bmc.2017.06.052 28 Lavergnea V., Harliwong I., Jonesa A., Millerb D., Taftb R J., and Alewooda P F (2015), "Optimized deep-targeted proteotranscriptomic profiling reveals unexplored Conus toxin diversity and novel cysteine frameworks", Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(29), pp E3782–E3791 doi: 10.1073/pnas.1501334112 29 Layer T R and Mcintosh J M (2006), "Conotoxins: Therapeutic Potential and Application", Marine Drugs, pp 119-142 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3663415 30 Lewis J R., Sébastien D., Irina V and MacDonald J., Christie A C D (2012) "Conus Venom Peptide Pharmacology" Pharmacological Reviews, April 2012, 64 (2), pp 259-298 31 Lusardi R., Chiavaro E., Cerretani L., Bendini A (2011), "Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using μm particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production working under current good manufacturing practice" Journal of Chromatography A, pp 7521–7527 doi: 10.1016/j.chroma.2011.07.078 32 McIntosh J M, Hasson A., Spira M E., Gray W R., Li W., Marsh M., Hillyard D R., Olivera B M (1995), "A New Family of Conotoxins That Blocks Voltage-gated Sodium Channels", The Journal of Biologycal chemistry, Vol 270, No.28, Issue of July 14, pp 16796–16802 33 McIntosh J M and Jones R M (2001), ‘Cone venom–from accidental stings to deliberate injection’, Toxicon Pergamon, 39(10), pp 1447–1451 doi: 10.1016/S0041-0101(01)00145-3 34 Duque M H., Dias C S and Franco L O (2019), ‘Structural and Functional Analyses of Cone Snail Toxins’, Marine Drugs, 17(6), p 370 doi: 10.3390/md17060370 35 Nguyen B., Molgó J., Lam T H., Benoit E., Khuc T A., Ngo D N., Nguyen N T., Millares P., Le Caer J (2013), "High accuracy mass spectrometry comparison of Conus bandanus and Conus marmoreus venoms from the South Central Coast of Vietnam", Toxicon Pergamon, 75, pp 148–159 doi: 10.1016/J.TOXICON.2013.06.005 35 Nguyen B., Le Caer J., Mourier G., Thai R., Lam T H., Benoit E., Molgó J (2014), "Characterization of a novel Conus bandanus conopeptide belonging to the M-superfamily containing bromotryptophan", Marine Drugs, 12(6), pp 3449–3465 doi: 10.3390/md12063449 36 Nguyen B., Le Caer J., Mourier G., Thai R., Lam T H., Benoit E., Molgó J (2014), "Isolation, purification and functional characterization of alpha-BnIA from Conus bandanus venom", Toxicon Pergamon, 91, pp 155–163 doi: 10.1016/J.TOXICON.2014.10.006 37 Olivera B M., Cruz L J and Yoshikami D (1999), "Effects of Conus peptides on the behavior of mice", Current Opinion in Neurobiology Elsevier Current Trends, 9(6), pp 772–777 doi: 10.1016/S0959-4388(99)00033-1 38 Olivera B M., Rivier J., Clark C., Ramilo C A., Corpuz G P., Abogadie F C., Mena E E., Woodward S R., Hillyard D R., C L (1990), "Olivera 1990 diversity of Conus neuropeptides.pdf", Science, pp 257–263 39 Prator C A., Murayama K M and Schulz J R (2014), "Venom variation during prey capture by the cone snail, Conus textile", PLoS ONE, 9(6), pp 1– doi: 10.1371/journal.pone.0098991 40 Puillandre N., Duda F T., Meyer C., OliveraM B and Bouchet P (2015), "One, four or 100 genera? A new classification of the cone snails", Journal of Molluscan Studies, 81(1), pp 1–23 doi: 10.1093/mollus/eyu055 41 Rajendra W., Armugam A and Jeyaseelan K (2004), "Neuroprotection and peptide toxins", Brain Research Reviews Elsevier, 45(2), pp 125–141 doi: 10.1016/J.BRAINRESREV.2004.04.001 42 Rivera-Ortiz J A., Cano H and Marí F (2011), "Intraspecies variability and conopeptide profiling of the injected venom of Conus ermineus", Peptides.Elsevier, 32(2), pp 306–316 doi: 10.1016/J.PEPTIDES.2010.11.014 44 Santos A D., McIntosh J M., Hillyard D R., Cruz L J., Olivera B M (2004), "The A-superfamily of conotoxins: structural and functional divergence", J Biol Chem 279:pp 17596-17606 45 Satheeshkumar N., Shantikumarm S and Srinivas R (2014), "Pioglitazone: A review of analytical methods", Journal of Pharmaceutical Analysis Xi’an Jiaotong University, 4(5), pp 295–302 doi: 10.1016/j.jpha.2014.02.002 46 Siddiqui M R., AlOthman Z A and Rahman N (2017), "Analytical techniques in pharmaceutical analysis", Arabian Journal of Chemistry King Saud University, 10, pp S1409–S1421 doi: 10.1016/j.arabjc.2013.04.016 47 Silva R., Lopes N P and Silva D B (2016), "Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis", Planta Medica, 82(8), pp 671-689 doi: 10.1055/s-0042-104800 48 Singhal N., Singhal N., Kumar M., Kanaujia P K., Virdi J S (2015), "MALDI-TOF mass spectrometry: An emerging technology for microbial identification and diagnosis", Frontiers in Microbiology, 6(AUG), pp 1–16 doi: 10.3389/fmicb.2015.00791 49 Sriveena T., Srividya A., Ajitha A and Uma A., Maheswara R (2015), "Time of flight mass spectrometr", World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical sciences, 4(7), pp 614–625 50 Staats P S., Yearwood T., Steven G S., Presley W R., Wallace S M., ByasSmith M., Fisher R., Bryce A D., Mangieri A E., Luther R R., Mayo M., McGuire D., Ellis D (2004), "Intrathecal ziconotide in the treatment of refractory pain in patients", Journal of American medical association, 291(1), pp 63–70 https://jamanetwork.com/ on 08/09/2019 51 Terlau H and Olivera B M (2004), "Conus Venoms: A rich source of novel ion channel-targeted peptides", Physiological Reviews, 84(1), pp 41–58 doi: 10.1152/physrev.00020.2003 53 Tosti E., Boni R and Gallo A (2017), "µ-Conotoxins modulating sodium currents in pain perception and transmission: A therapeutic potential", Marine Drugs, 15(10), pp 1–18 doi: 10.3390/md15100295 54 Vetter I and Lewis J R (2012), "Therapeutic Potential of Cone Snail Venom Peptides (Conopeptides)", Current Topics in Medicinal Chemistry, 12(14), pp 1546–1552 doi: 10.2174/156802612802652457 55 Wright B A., Norimatsu Y., McIntosh J M and Elmslie E K (2015), "RgIA , To Inhibit Sensory Neuron Ca V", Department of Pharmacology, 2(February), pp 1–8 DOI:http://dx.doi.org/10.1523/ENEURO.0057-14.2015 56 Yong Yang, Sheng Zhang, Kevin Howe, David B Wilson, Felix Moser, Diana Irwin and Theodore W Thannhauser (2012), "A Comparison of nLC-ESIMS/MS and nLC-MALDI-MS/MS for GeLC-Based Protein Identification and iTRAQ-Based Shotgun Quantitative Proteomics", Carbohydrate Polymers, p J Biomol Tech 2007 Sep; 18(4): 226–237 Các trang Web 56 http://www.conoserver.org 57 https://vi.wikipedia.org 58 http://baochinhphu.vn/Bien-Viet-Nam/Da-xac-dinh-danh-muc-gan-12000loai-sinh-vat-bien-Viet-Nam/330856.vgp 59 https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/noncommunicable-diseases PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số trang Xác định hàm lượng protein nọc độc thơ ốc nón C Bandanus sau tách chiết cut-off 10kDa theo phương pháp Bradford Các bước thực sắc ký lỏng pha đảo (RP- HPLC) để phân vùng sơ độc tố thơ ốc nón C bandanus Bảng tổng hợp KLPT conopeptide nhận diện nọc độc thơ ốc nón C bandanus với cách thu mẫu (thu mẫu toàn bộ) Bảng tổng hợp KLPT conopeptide nhận diện nọc độc thơ ốc nón C bandanus với cách thu mẫu (thu mẫu theo vùng) Bảng tổng hợp KLPT conopeptide nhận diện nọc độc thô ốc nón C bandanus với cách thu mẫu (thu mẫu theo phút) PHỤ LỤC Xác định hàm lượng protein nọc độc thơ ốc nón C Bandanus sau tách chiết cut-off 10kDa theo phương pháp Bradford * Nguyên tắc: Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, chưa kết nối với protein thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm, kết hợp với protein thuốc nhuộm hấp thu cực đại bước sóng 595 nm Độ hấp thụ bước sóng 595 nm có liên hệ cách trực tiếp tới nồng độ protein Để xác định protein mẫu, ta xây dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn thường bovine serum albumin (BSA) Sau cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu xuất sau pht bền tới Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch máy quang phổ kế * Cách tiến hành thí nghiệm: Bước 1: Pha thuốc thử Bradford dung dịch albumin 0.1% + Pha thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử cho 1000ml sau: Coomassie Brilliant Blue: 50 mg, Methanol: 50 ml, H3PO4 85%: 100 ml Coomassie Brilliant Blue hòa tan methanol, bổ sung acid phosphoric chỉnh đến 1000 ml nước cất, lắc bảo quản chai tối màu 4oC Pha dung dịch dịch albumin (BSA) 0.1%: cân 10 mg BSA pha 10 ml nước cất Hút ml dung dịch BSA mg/ml định mức đến 10 ml nước cất Bước Dựng đường chuẩn: Để dựng đường chuẩn Bradford, lấy ống nghiệm đánh dấu thứ tự từ 1-6, dùng micropipet để hút dung dịch BSA 0,1mg/ml, nước cất, thuốc thử Bradford mô tả bảng 1.1 Bảng kết đo OD để dựng đường chuẩn theo phương pháp Bradford Ống nghiệm Dung dịch BSA 1mg/ml Nước cất (ml) Thuốc thử (ml) Kết đo OD 595nm 0 2 0.01 0.025 0.05 0.1 0.25 0.5 0.99 0.975 0.95 0.9 0.75 0.5 2 2 2 0.144 0.358 0.576 0.749 0.926 0.978 0.989 Lắc để yên khoảng phút Sau tiến hành đem ống nghiệm để xác định giá trị OD ống bước sóng 595 nm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Dựng đồ thị biểu diễn tương quan mật độ quang học nồng độ BSA Đồ thị đường chuẩn theo phương pháp Bradford Bước 3: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm Dịch chiết thô (hoặc dịch cut-off 10 kDa) pha loãng phù hợp để xác định nồng độ protein Bước 4: Ghi nhận kết giá trị OD xác định nồng độ mẫu đo thông qua phương trình đường chuẩn BSA dựng hệ số pha loãng Kết 1: Hàm lượng protein dịch chiết thô theo phương pháp chiết Phương pháp Lần (mg/mL) Lần (mg/mL) Lần (mg/mL) [Protein]±SD Phương pháp 0.371 0.365 0.382 0.373±0.005 Phương pháp 0.431 0.452 0.422 0.435±0.009 Phương pháp 0.431 0.483 0.462 0.459±0.015 Kết 2: Hàm lượng protein dịch chiết cut-off 10 kDa Mẫu Lần (mg/mL) Lần (mg/mL) Lần (mg/mL) [Protein]±SD Mẫu 10kDa 0.155 0.161 0.165 0.16±0.003 PHỤ LỤC Các bước thực sắc ký lỏng pha đảo (RP- HPLC) để phân vùng sơ độc tố thơ ốc nón C bandanus - Chuẩn bị pha động: Trong sắc kí, hóa chất sử dụng phải chuẩn tinh khiết Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi sử dụng hóa chất chuẩn Đức (Merck) để pha pha động A pha động B + Pha động A: 1000 mL H2O/1 ml TFA + Pha động B: 900 ml CH3CN/100 ml H2O/1 ml TFA Pha động A B đựng bình thủy tinh, sau tiến hành đuổi khí hịa tan cách đánh siêu âm thật kỹ Pha động kết nối với máy HPLC thông qua dây nối - Rửa cột: Trong kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo, cột sắc ký (C18, C8, C4, Phenyl…) sau thời gian sử dụng, cột thường có dấu hiệu bị giảm hiệu năng, gây khó khăn cho trình phân tích hợp chất khơng mong muốn mẫu như: muối, dầu, chất béo, protein … tạo liên kết vật lý hóa học với cột sắc ký, màng lọc đầu vào cột sắc kí … suốt q trình sử dụng Vì vậy, để giữ tuổi thọ cho cột pha đảo, giữ nguyên hiệu chúng, tránh để mẫu phân tích khơng bị nhiễm, Vì vậy, rửa cột sắc kí bước bắt buộc kỹ thuật sắc kí Cột sắc kí rửa với Acetonitrile : H2O tinh khiết (tỉ lệ 1:9), Ethanol : H2O tinh khiết (với tỉ lệ 1:9) rửa với pha động Trong nghiên cứu rửa cột sắc kí Ethanol : H2O tinh khiết (cất lần khử ion) với tỉ lệ 1:9 30 phút Bước Chạy pha động Để kết sắc kí ổn định đối chứng, trước chạy mẫu thực, tiến hành lấy đường (baseline) chương trình chạy pha động 70 phút với chương trình gradient gồm 0% pha động B 10 phút đầu, tăng từ 0-60% B 60 phút với tốc độ dòng 1mL.min-1 (rửa giải với 1%B.min-1) Bước Tiêm mẫu vào pha động Tiêm khoảng 0.9 mL dịch độc ốc nón (sau cut-off 10kDa) vào pha động xilanh qua van tiêm có vịng chứa mẫu Bước Chạy máy Trước chạy máy cần thiết lập thông số nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, bước sóng hấp thu (với đầu dò UV) Bước Thu mẫu Lấy ống nghiệm đánh dấu thứ tự tương ứng với phân đoạn để thu (hứng) mẫu Tùy vào trường hợp có cách thu mẫu khác nhau, mơ tả cụ thể phần phương pháp Bước Rửa lại cột phân tích Rửa lại cột phân tích pha động 100% B với lượng dịch 10 lần thể tích cột Bước Tái sinh cột pha động A lần chạy phân tách PHỤ LỤC Bảng tổng hợp KLPT conopeptide nhận diện nọc độc thơ ốc nón C bandanus với cách thu mẫu (thu mẫu toàn bộ) Thu mẫu Toàn từ phút thứ 10 – phút thứ 55 Số lượng conopeptide KLPT quan sát (Da) 1095.41; 1663.69; 1678.73; 1853.53; 2765.26; 2947.24 PHỤ LỤC Bảng tổng hợp KLPT conopeptide nhận diện nọc độc thơ ốc nón C bandanus với cách thu mẫu (thu mẫu theo vùng) Phân vùng Z1 (từ phút 25 – phút 33) Số lượng conopeptide KLPT quan sát (Da) 1854.67; 1857.68; 1838.68; 1451.55; 1147.58 1042.50; 1095.39; 1130.56; 1227.29; 1368.60; Z2 (từ phút 34 - phút 39) 1500.68; 1588.74; 1663.68; 1679.67; 1715.55; 20 1717.56; 1719.57; 1745.52; 1773.56; 1811.53; 1860.67; 1918.64; 1970.59; 2012.59; 3107.29 Z3 (từ phút 40 - phút 44) Z4 (từ phút 45 - phút 53) 11 1678.68; 1743.58; 1795.47; 1853.48; 1968.64; 2096.73; 2318.76; 2765.16; 2947.14; 3005.15; 3332.47 1678.64; 2022.78; 2109.81; 2743.03; 2822.94 Lưu ý: KLPT conopeptide in đậm (trong phụ lục 4) trùng với KLPT (sai số khoảng 0.5 Da) conopeptide cách thu mẫu (Phụ lục 3) PHỤ LỤC Bảng tổng hợp KLPT conopeptide nhận diện nọc độc thô ốc nón C bandanus với cách thu mẫu (thu mẫu theo phút – từ phút thứ 10 đến phút thứ 100) Thời gian lưu (phút) 17 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 46 50 61 65 Số lượng KLPT (Da) quan sát conopeptides 1158.58; 2166.04 1359.73; 1582.76 1102.34; 1147.61; 1235.65 1060.51; 1084.32; 1210.57; 1325.64; 1668.83 1018.61; 1119.62; 1477.7; 1550.76 1224.57 1302.56; 1872.64 1067.57; 1450.62; 1494.68; 1856.62; 1870.61; 1892.59 1040.55; 1854.61 1451.52; 1838.62 1087.35; 1679.62; 1695.66; 1860.62; 1863.61 1118.66; 1613.61; 1880.66 1052.41; 1268.49; 1371.65 1221.46; 1399.55; 1682.52; 1726.81; 1864.71; 1886.7; 1961.48; 2019.48 1095.41; 1715.58; 1759.57 1773.58; 2760.18 1795.5; 3005.2 1678.68; 1853.47; 1897.46; 3019.16 1743.57; 1765.53 1754.49; 1812.49 3332.35 2022.75; 2109.78 1754.49 1776.65; 2338.91; 3633.45 2823.03 1566.92; 2732.48 1065.09 1029.13 Lưu ý: KLPT conopeptide in đậm (trong phụ lục 5) trùng với KLPT [sai số khoảng 0.5 Da theo phân đoạn (phân vùng)] conopeptide cách thu mẫu (Phụ lục 4) CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ... bandanus vùng biển Khánh Hịa phương pháp RP- LC off- line MALDI- TOF MS? ?? nghiên cứu Việt Nam giới phân tích khối lượng phân tử conopeptide độc tố thơ ốc nón C bandanus phương pháp RP- LC off- line MALDI- TOF. .. phương pháp phân tích RP- LC off- line MALDI- TOF MS phân tích thành phần nọc độc thơ ốc nón Conus - So sánh khối lượng phân tử conopeptide độc tố thơ lồi ốc nón C bandanus thu vùng biển Khánh Hòa. .. lợi ốc nón Mục tiêu nghiên cứu - Phân tích thành phần conopeptide độc tố thơ ốc nón C bandanus thu vùng biển Khánh Hòa phương pháp MALDI- TOF MS - Đánh giá hiệu phương pháp phân tích RP- HPLC offline