Đồ án Khảo sát độc tố tetrodotoxins ở một số loài trong họ ốc bùn Nassariidae tại vùng biển Khánh Hòa bằng phương pháp sắc ký HPLC

Đề tài: Khảo sát độc tố tetrodotoxins số loài họ ốc bùn Nassariidae vùng biển Khánh Hòa phương pháp sắc ký HPLC Lời cảm ơn Trong khoảng thời gian thực tập, để có buổi thực tập bổ ích hiệu quả, tơi nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhà trường, q thầy cơ, bạn bè gia đình tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành báo cáo Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo, quý thầy cô trường đại học Nha Trang, đặc biệt quý thầy cô viện công nghệ sinh học môi trường tạo sở vật chất, truyền đạt kiến thức, tận tình giúp đỡ suốt thời gian qua Đồng thời xin chân thành cảm ơn GVHD Th.s Chính đóng góp ý kiến tận tình dẫn để tơi hồn thành báo cáo Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ban lãnh đạo, cán bộ, nhân viên Viện Hải dương học Nha Trang tạo điều kiện để tơi có hội tiếp cận với thực tế Và đặc biệt xin cảm ơn đến cử nhân Đặng Quốc Minh, TS Phạm Xn Kỳ tập thể phịng hóa sinh tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực tập hoàn thành tốt báo cáo Và cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên, giúp đỡ điều kiện tốt vật chất lẫn tinh thần suốt thời gian học tập Trong q trình thực tập khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp ý kiến quý báu quý thầy cô bạn để báo cáo hoàn thiện Nha Trang, ngày tháng năm Người thực Đỗ Thị Li Na Mở Đầu Hiện nước ta tình hình ngộ độc ăn phải lồi ốc biển có độc ngày tăng, thời gian gần đây, rải rác nhiều địa phương vùng ven biển ghi nhận số vụ ngộ độc sử dụng ốc biển làm thức ăn ảnh hưởng đến sức khỏe, tính mạng người ăn Điển trường hợp tử vong huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa vào ngày 26/10/2014 ăn ốc bùn bống; trường hợp tử vong huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên vào ngày 23/11/2014 ăn ốc biển lạ chưa xác định loài; trường hợp tử vong xã Phước Diêm, huyện Thuận Nam, tỉnh Ninh Thuận ngày 15/12/2014 ăn ốc bùn cưa Mới ngày 05/1/2015 có 03 ngư dân tỉnh Thanh Hóa tử vong ăn ốc biển thuyền đánh bắt thủy sản vùng biển tỉnh Hà Tĩnh Theo khảo sát sơ đa số loài ốc gây vụ ngộ độc thuộc họ Nassariidae triệu chứng đa số nạn nhân trường hợp có triệu chứng ngộ độc Tetrodotoxin( viết tắc TTX), loại độc tố thần kinh cực mạnh gây tử vong người trưởng thành với liều thấp từ 1-2mg Hiện nguồn gốc độc tố lồi ốc chưa biết rõ ràng Đặc biệt, khơng phải tất cá thể loài chứa độc tố, độc tính khác biệt theo cá thể Để biết thêm thông tin loài ốc độc họ bổ sung liệu độc tố loài sinh vật biển nhằm góp phần cho việc sử dụng thực phẩm biển cách an tồn Chính chọn đề tài “ Khảo sát độc tố tetrodotoxins số loài họ ốc bùn Nassariidae vùng biển Khánh Hòa phương pháp sắc ký HPLC” Với mục tiêu: Cung cấp liệu độc tố số lồi thuộc họ ốc bùn Nassariidae nhằm góp phần an toàn thực phẩm Chương 1: Tổng quan 1.1 Tìm hiểu chung viện hải dương học 1.1.1 Giới thiệu viện hải dương học Trải qua 90 năm hoạt động phát triển, Viện Hải Dương Học đóng góp khối lượng lớn cơng trình nghiên cứu cho cơng chinh phục khai thác bảo vệ biển Đông, bao gồm 1100 ấn phẩm cơng bố, nghiên cứu tính đa dạng sinh học chiếm 62,6%, vật lý hải dương chiếm 11,6%, sinh thái môi trường chiếm 7,6%, địa chất địa mạo biển chiếm 5,4%, hóa học biển hóa sinh chiếm 4,4% Qua đó, thấy Viện Hải Dương Học góp phần vào việc thực mục tiêu khoa học đất nước Chức năng: Viện Hải dương học có chức nghiên cứu bản, điều tra bản, phát triển công nghệ đào tạo nguồn nhân lực có trình độ cao lĩnh vực hải dương học lĩnh vực khác có liên quan theo quy định pháp luật Nhiệm vụ:  Nghiên cứu trình, quy luật hải dương học sinh thái học, tượng đặc biệt biển đại dương, tương tác thủy - khí - thạch tác động biến đổi khí hậu tồn cầu Biển Đơng;  Điều tra điều kiện tự nhiên, đa dạng sinh học, đặc điểm sinh học sinh thái - sinh hóa thủy sinh vật, nguồn lợi sinh vật - phi sinh vật môi trường biển Việt Nam;  Nghiên cứu ứng dụng thành tựu khoa học vào thực tiễn quản lý sử dụng hợp lý tài nguyên, nuôi trồng thủy sản bền vững, bảo tồn đa dạng sinh học, bảo vệ môi trường chủ quyền quốc gia biển, dự báo trình hải dương, khảo sát phục vụ thiết kế cơng trình biển ven bờ;  Xây dựng mẫu sinh vật phi sinh vật, trao đổi mẫu vật nước, chuyển giao kỹ thuật bảo tàng biển;  đ) Triển khai kết nghiên cứu ứng dụng công nghệ lĩnh vực hải dương học lĩnh vực khoa học có liên quan;  Dịch vụ khoa học công nghệ lĩnh vực hải dương học lĩnh vực khoa học khác có liên quan;  Đào tạo nguồn nhân lực khoa học cơng nghệ có trình độ cao lĩnh vực hải dương học lĩnh vực khác có liên quan;  Hợp tác quốc tế lĩnh vực hải dương học lính vực khác có liên quan;  Quản lý tổ chức, máy; quản lý sử dụng công chức, viên chức đơn vị theo quy định Nhà nước Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam;  Quản lý tài chính, tài sản đơn vị theo quy định Nhà nước;  Thực nhiệm vụ khác Chủ tịch Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giao 1.1.2 Quy mô cấu tổ chức Ban lãnh đạo Hội Đồng Khoa học Đơn vị quản lý nghiệp vụ Bảo tàng hải dương học Phòng Quản lý tổng hợp Phòng Truyền thơng Giáo dục mơi trường Các phịng chun mơn Phịng Quản lý chun mơn Bảo tàng Phịng Vật lý biển Phịng Kỹ thuật ni sinh vật biển Phịng Địa chất - Địa mạo biển Các đơn vị chức Phịng Sinh thái biển Phịng Thơng tin - Thư viện Phịng Thủy - Địa hóa Trung tâm Quan trắc tài ngun mơi trường biển Phịng Thực vật biển Trạm Nha Trang Phòng Nguồn lợi thủy sinh Trạm Cần Giờ Phịng Động vật có xương sống biển Trạm quan trắc phân tích mơi trường biển Miền Nam Phịng Công nghệ nuôi trồng Trung tâm Tư vấn, Ứng dụng chuyển giao khoa học, cơng nghệ biển Phịng Hóa sinh biển Đội tàu Nghiên cứu khảo sát biển Trung tâm Dữ liệu GIS - Viễn thám Tổ Tàu thuyền Phòng Sinh vật phù du Đội lặn 1.1.3 Các lĩnh vực hoạt động  Nghiên cứu khoa học bản, khoa học ứng dụng lĩnh vực hải dương học tài nguyên - môi trường biển  Dịch vụ KH&CN: Cung cấp dịch vụ thông tin, truyền thông đào tạo liên quan đến khoa học công nghệ biển  Thực hợp đồng tư vấn, dịch vụ, knh tế khoa học biển chuyển giao thành tựu khoa học, giải pháp công nghệ vào thực tiễn  Xây dựng tiêu sinh vật phi sinh vật biển; Quy hoạch, hướng dẫn chuyển giao kỹ thuật bảo tàng biển  Hợp tác quốc tế lĩnh vực hải dương học tài nguyên - môi tường biển 1.2 Tổng quan tài liệu 1.2.1 Tổng quan độc tố TETRODOTOXINS (TTXs)  Khái niệm: Tetrodotoxin (TTX) chất độc thần kinh cực mạnh, chất hữu phi protein, có khả tác động trực tiếp lên kênh trao đổi ion Na + màng tế bào Ở liều thấp 1-2 mg gây tượng tê liệt nặng dẫn đến tử vong người trưởng thành nặng khoảng 75-100 kg [5]  Hiện nay, TTX 30 dẫn xuất (hình 1) phát [9] với mức độ độc tính khác nhau[6] Các dẫn xuất thường gặp sinh vật biển TTX, 4epi-TTX 4,6-anhydroTTX R1 R2 R3 R4 R5 TTX H OH OH CH2OH OH 4-epiTTX OH H OH CH2OH OH 6-epiTTX H OH CH2OH OH OH 11-deoxyTTX H OH OH CH3 OH 6,11-dideoxyTTX H OH H CH3 H 8,11-dideoxyTTX H OH OH CH3 H 11-oxoTTX H OH OH CH(OH)2 OH 11-norTTX-6,6-diol H OH OH OH OH 11-norTTX-6(R)-ol H OH H OH OH 11-norTTX-6(S)-ol H OH OH H OH Chiriquitoxin H OH OH H OH TTX-8-O-hemisuccinate H OH OH CH2OH OOC(CH2)2COO- TTX-11-carboxylic acid H OH OH COO- OH Hình 1: Cơng thức cấu tạo số dẫn xuất TTX theo Bane cs, 2014  Nguồn gốc: Tetrodotoxin tìm thấy da, gan, thịt số lồi như: cá nóc, số lồi động vật thân mềm (bạch tuộc, ốc phổi - Pleurobranchaea maculate), giun dẹp [5] động vật cạn sa giơng[7] TTXs biết tích lũy sinh vật biển thông qua chuỗi lưới thức ăn [14] vi sinh vật cộng sinh[13] Người ta cho rằng, tetrodotoxin sinh ký sinh số loài phiêu sinh động vật lên thể thủy sản Tuy nhiên, nguồn gốc sinh tetrodotoxin chưa biết rõ  Công thức cấu tạo: hợp chất dị vịng, có cơng thức phân tử C11H17N3O8 [2]  Cấu trúc : Octahydro-12-(hydroxymethyl)-2-imino-5,9:7,10a-dimethano- 10aH[1,3]dioxocino[6,5-d]pyrimidine-4,7,10,11,12-pentol  Đặc tính: chất rắn kết tinh màu trắng, sẫm màu nhiệt độ 220 C khơng nóng chảy [2] , độc tố tan nước, bền nhiệt pH Không bền môi trường kiềm môi trường axit mạnh, có trọng lượng phân tử: 319.27g/mol[2]  Liều lượng gây độc : Tetrodotoxin có khả gây độc cao, tỉ lệ tử vong gấp 10.000 so với cyanua - Liều gây độc xác định 1- 4mg - LD 50 8–20 mg/kg lượng sử dụng   Cơ chế tác động: Vận chuyển ion thần kinh, tetrodotoxin ngăn cản tăng điện áp gây Na tế bào thần kinh, truyền dẫn xung thần kinh Guanidinium độc tố làm nghẽn mạch,vì gây thay Na việc phát điện màng tế bào bị kích thích, vật cịn lại phân tử máu mạch Triệu chứng: Tê, ngứa mơi phía miệng, sau yếu, liệt hoành, ngực cuối hạ huyết áp Các triệu chứng xảy sau 10 phút dẫn đến tử vong vòng 30 phút.[3]  Đường xâm nhập: Ăn phải, hít phải, dính da  Biện pháp phịng ngừa : Khơng nên dùng loại thực phẩm chứa độc tố tetrodotoxin làm thức ăn lẽ chế độ xử lý nhiệt thông thường không loại trừ độc tố Hiện chưa có thuốc giải độc đặc hiệu cho trường hợp ngộ độc độc tố Tetrodotoxin Biện pháp cấp cứu, điều trị hữu hiệu kích thích cho bệnh nhân nôn sớm tốt; rửa dày; uống than hoạt tính để thải loại bớt chất độc; điều trị triệu chứng kịp thời: hỗ trợ hô hấp, truyền dịch, trợ tim mạch… 1.2.2 Vài nét ốc bùn Ốc bùn loại ốc thuộc họ Nassariidae, chủ yếu sống đáy bùn cát, phân bố rộng từ vùng triều đến vùng triều Họ Nassariidae có đa dạng sinh học cao khu vực Ấn Ðộ - Tây Thái Bình Dương, gồm có 211 lồi[8] Ở Việt Nam, có 64 lồi ghi nhận , 15 lồi bước đầu phát vùng biển Khánh Hịa[1] Trong số có số lồi chứa độc tố TTX N sufflatus[12], N papillosus[11], N siquijorensis [10]và N albescens[9], Hình 2: Một số loại ốc bùn có tiền sử gây độc vùng biển Khánh Hòa Những loại ốc bùn thường sinh sống đáy biển ven bờ Việt Nam, chúng có độc tố Tetrodotoxin loại độc tố thần kinh cực mạnh, có trọng lượng phân tử thấp , có cấu trúc tính chất hóa học đặc biệt (bền nhiệt, bền pH ) nên không bị phân hủy, biến tính q trình xử lý nhiệt độ cao chế biến, độc tố tồn sản phẩm thức ăn chế biến chín xào, luộc, hấp , chí kể sản phẩm cấp đơng, đóng hộp.[3] Để dự phòng ngộ độc ốc biển độc, Cục An tồn thực phẩm khuyến cáo: - Tuyệt đối khơng khai thác, đánh bắt tuyệt đối không sử dụng, khơng “thử nghiệm” loại ốc biển nghi ngờ có độc, loài ốc biển lạ, màu sắc sặc sỡ (ốc ma) để chế biến thành thức ăn - Đối với loại ốc biển sử dụng làm thức ăn phải sơ chế, chế biến bảo đảm an tồn: ngâm, thả vào mơi trường để nước để kích thích đào thải hết bã, chất tiết ruột, tuyến bọt (nước muối nhạt, nước vôi nhạt, dấm ăn…); rửa nước sạch, để nước, đun chín kỹ ăn sau chế biến Tuyệt đối không ăn sống, ăn tái, không qua sơ chế, vệ sinh - Và tuyệt đối không nên ăn lồi ốc có tiền sử gây ngộ độc chưa kiểm chứng chắn an toàn thực phẩm - Nếu sau ăn ốc biển mà có biểu hiện, triệu chứng khác thường tê, rát bỏng môi đầu lưỡi, đau đẩu, đau bụng, buồn nôn… cần đến sở y tế để khám điều trị kịp thời 1.2.3 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) HPLC chữ viết tắt chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography), trước gọi phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Phương pháp ngày sử dụng rộng rãi phổ biến nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt 1.2.3.1 Khái niệm: HPLC phương pháp tách hóa lý dựa vào lực khác chất khác với hai pha tiếp xúc không đồng tan với pha động pha tĩnh Trong pha động chất lỏng chảy qua cột với tốc độ định pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến đổi liên kết hóa học với nhóm chức hữu Quá trình sắc ký xảy dựa chế : hấp phụ, phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) 1.2.3.2 Nguyên lý hoạt động HPLC: Hỗn hợp cần phân tích hịa tan dung mơi thích hợp, tiêm thể tích xác vào phận tiêm mẫu mang vào cột dịng chảy liên tục dung mơi (pha động) mẫu hịa tan Sự tách diễn cột có chứa hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh) Các cấu tử mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh Pha động (còn gọi chất rửa giải) bơm qua cột nhồi chặt hạt sắc kí Với việc chọn pha động vật liệu nhồi cột thích hợp, cấu tử mẫu di chuyển dọc cột với tốc độ khác tách khỏi hỗn hợp chất phân tích, cấu trúc phân tử tính chất hóa lý chất khác nên khả tương tác chúng với pha động pha tĩnh thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý thơng số liên quan đến kết phân tích 1.2.3.3.8 In liệu Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển 1.2.3.4 Thời gian lưu HPLC Thời gian thực cho hợp chất đặc biệt qua cột phát gọi thời gian lưu giữ Thời gian tính từ thời điểm mẫu bơm đến thời điểm sắc ký đồ hiển thị độ cao, cao điểm tối đa cho hợp chất Các hợp chất khác có thời gian lưu khác Đối với hợp chất đặc biệt, thời gian lưu giữ khác tùy thuộc vào:  Áp lực sử dụng (bởi ảnh hưởng đến tốc độ dịng chảy dung mơi)  Bản chất pha tĩnh, tính chất cấu trúc chất phân tích  Bản chất thành phần pha động để rửa giải chất phân tích khỏi cột sắc kí(pha tĩnh)  Nhiệt độ cột Hình : Thời gian lưu cấu tử phân tích tR : thời gian lưu cấu tử từ vào cột đến tách ngồi cột tO : thời gian chất khơng có lực với pha tĩnh qua cột; thời gian pha động từ đầu cột đến cuối cột gọi thời gian lưu chết tR' : thời gian lưu thật cấu tử Thời gian lưu đại lượng đặc trưng cho tách sắc ký chất hệ pha chọn Trong hệ pha điều kiện tách HPLC chọn chất phân tích có thời gian lưu khác cố định Chính đại lượng tính chất hay thơng số để định tính chất hỗn hợp mẫu [4] Vì vậy, sau chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ mẫu phân tích, xác định thời gian lưu peak ứng với chất sắc ký đồ Sau so sánh thời gian lưu chất phân tích với thời gian lưu chất chuẩn, từ xác định mẫu phân tích có chất nào.[4] Mặc khác dựa vào diện tích chiều cao peak ta định lượng hàm lượng chất phân tích 1.2.3.5 Vài nét HPLC với detector huỳnh quang [4] Quang phổ huỳnh quang việc áp dụng để định tính, định lượng chất máy đo quang phổ huỳnh quang cịn dùng để chế tạo phận phát máy HPLC Detector huỳnh quang đóng vai trị máy huỳnh quang kết nối với sắc ký lỏng để phát phân tích định tính hay định lượng chất sau khỏi cột sắc ký Detector huỳnh quang có độ chọn lọc nhạy lớn(có thể đến 1000 lần) detector hấp phụ UV HPLC-detector huỳnh quang phát tới 10-12 g Do có độ nhạy cao nên detector huỳnh quang sử dụng phân tích vết nhiều lĩnh vực kiểm sốt mơi trường, giám định pháp y, định lượng hợp chất dịch sinh học,… Tùy theo chất cần định lượng có khả phát quang hay khơng mà tiến hành định lượng trực tiếp hay gián tiếp thông qua dẫn chất có khả phát quang Người ta cho chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo dẫn chất phát huỳnh quang mạnh trước đến đầu detector huỳnh quang 1.2.3.6 Ứng dụng HPLC: - Trong y học:  Phát nồng độ vitamine D huyết  Phân tích hoạt chất, tạp chất dược phẩm theo dược điển BP, USP, EP, JP,…  Phân tích chất kháng sinh kháng khuẩn, có thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia súc,… - Trong thực phẩm:  Phân tích đa lượng vitamin, chất bảo quản phụ gia thực phẩm, loại đường,…  Phân tích vi lượng vitamin trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản  phân tích độc tố Mycotoxin thực phẩm, nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,… - Trong pháp luật:  Phát thuốc làm tăng lực nước tiểu - Trong nghiên cứu:  Tinh khiết chất từ mẫu sinh học phức hợp, tách chất tổng hợp giống từ chất khác  Phân tích dộc tố sinh học biển nghêu (ASP), ốc bùn, cá nóc,…  Phân tích acid hữu - Trong sản xuất:  Sản xuất chế phẩm sinh học dược phẩm Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các loại ốc bùn Nassariidae thu mẫu vùng biển Khánh Hòa Mẫu thu tự nhiên cách dùng lưới cào đáy bùn ven bờ vùng biển Vạn Ninh - Khánh Hòa Mẫu sau thu rửa bên bảo quản đá lạnh, sau vận chuyển phịng thí nghiệm Mẫu bảo quản nhiệt độ -20 oC đến chiết tách phân tích độc tố Các loại ốc bùn thu bao gồm : N glans glans, N livescens N conoidalis conoidalis với số lượng cá thể lần lược 30, 30, 15 Hình 5: lồi ốc bùn thu vùng biển Khánh Hòa Theo thứ tự từ trái qua phải, từ xuống lần lươt có tên : N glans glans, N Conoidalis conoidalis, N livescens Bảng 1:Khối lượng trung bình cá thể lồi ốc bùn Loài Số lượng cá thể Khối lượng vỏ Khối lượng tươi bỏ (g) vỏ (g) N glans glans 30 5,12 ± 1,24 2,66 ± 0,68 N livescens 30 2,97 ± 1,03 1,77 ± 0,47 N.conoidalis conoidalis 15 3.28 ± 0,30 1,10 ± 0,40 2.2 Hóa chất thiết bị Bảng : Hóa chất thiết bị Hóa chất Thiết bị Mobil phase Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu, cột Wakosil-II 5C18 (4,6mm x 250mm) gắn với đầu dò huỳnh quang Axit acetic 1% Bộ lọc dung mơi NaOH 4N Cân phân tích Washing Solvent-1 Máy đo pH Washing Solvent-2 Máy ly tâm Nước cất Nồi cách thủy Pipet ống nghiệm Bình định mức 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Tách chiết độc tố Quy trình tách chiết: Mẫu ốc Mô mềm Xay nhuyễn Chiết với axit acetid 1%(1:4) Đun sôi Ly tâm (3000g x 30 phút) Thu dịch Ban đầu ta loại bỏ phần vỏ ốc thu phần mô mềm ốc Mô mềm sau thu ta đem cân khối lượng sau xay nhuyễn Mẫu mơ mềm sau xay nhuyễn chiết với axit acetic 1% (theo thể tích) với tỷ lệ : (g : ml) Sau đem đun sôi 15 phút, sau đun sôi hỗn hợp ly tâm (3000g x 30 phút) để thu dịch chiết Dịch chiết lọc qua Millipore 10k Da để xác định độc tố HPLC 2.3.3 Phân tích độc tố HPLC Độc tố phân tích hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao, sử dụng cột Wakosil-II 5C18 (4,6mm x 250mm) gắn với đầu dị huỳnh quang với thể tích mẫu tiêm 20 µl Độc tố chuẩn: độc tố chuẩn TTXs (hỗn hợp TTX: 12,3 µM, 4-epiTTX (4epi): 7,5 µM, 4,6-anhydroTTX (anh): 13,1 µM), STX (5µg/ml) Phân tích TTXs: theo phương pháp Yotsu cs (1989) [6] với số điều chỉnh Pha động gồm 60mM axít heptafluorobutyric (Aldrich 164-194-100G) 50mM ammonium acetate (pH 5,0) bơm với tốc độ 0,5 ml/phút, nhiệt độ cột 40 oC NaOH 4N bơm phản ứng sau cột với tốc độ 0,5 ml/phút, nhiệt độ lò phản ứng 100 oC, đầu dò huỳnh quang cài đặt bước sóng kích thích bước sóng phát xạ 381 nm 505 nm Tiến hành Sau cài đặt phần mềm vào máy tính có kết nối với hệ thống sắc ký, ta tiến hành cài đặc thông số điều kiện tối ưu cho q trình sắc kí thực q trình rửa giải để trình sắc ký diễn triệt để nhất, ta rửa giải đến nhìn thấy máy tính hiển thị peak ổn định, ta tiến hành tiêm 20µl mẫu độc tố TTXs chuẩn trước để xác định peak thời gian lưu TTXs chuẩn sau tiêm mẫu cần phân tích Chương 3: kết nghiên cứu Sắc ký đồ mẫu phân tích TTXs Tetrodotoxins chuẩn (TTX, 4epiTTX, anhTTX) N glans glans N glans glans N glans glans N glans glans N glans glans N glans glans N glans glans N glans glans 10 N glans glans N glans glans N conoidalis conoidalis N conoidalis conoidalis N conoidalis conoidalis N conoidalis conoidalis N conoidalis conoidalis N livescens N livescens N livescens N livescens N livescens N livescens N livescens Dựa vào sắc ký đồ cho thấy : Ba loài N glans glans, N conoidalis conoidalis N livescens chứa độc tố TTXs Trong lồi N glans glans, N conoidalis conoidalis với hàm lượng cao Trong tổng số 10 mẫu phân tích loài N livescens mẫu phát có N livescens N livescens N livescens 10 chứa TTXs Đề xuất: Mở rộng nghiên cứu thành phần độc tố loài khác thuộc họ ốc bùn Nassaridae loài khảo sát vùng biển Việt Nam Phân tích chuyên sâu thành phần độc tố LC-MS nghiên cứu mối tương quan hàm lượng độc tố phân tích HPLC với độc tính xác định thử nghiệm sinh học chuột Tuyên truyền rộng rãi loài ốc: N glans glans N conoidalis conoidalis đến người dân để nhận biết không sử dụng chúng làm thức ăn Tài liệu tham khảo Bùi Quang Nghị, 2005 Thành phần loài động vật thân mềm thuộc lớp chân bụng (Gastropoda) vùng biển tỉnh Khánh Hòa Báo cáo khoa học Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Hội thảo Quốc gia lần thứ NXB Nông Nghiệp, tr 172-185 GS.TS Lê Xuân Tú, 1996 Nghiên cứu nâng cao công nghệ sản xuất tetrodotoxin, chiết xuất Amobocyte từ máu Sam nghiên cứu sử dụng sinh dược chúng Báo cáo khoa học Đề tài cấp nhà nước KC-08-05 Đặng Quốc Minh, (2015) Khảo sát độc tố saxitoxins tetrodotoxins số loài họ ốc bùn Nassaridae vùng biển khánh hòa Đề tài sở 2015, phịng hóa sinh viện hải dương học Nha Trang Dương Hải Thuận,(2008) Xây dựng phương pháp định lượng Azithromycin huyết tương Luận văn thạc sĩ dược học Đại học dược Hà Nội Noguchi T., O Arakawa, 2008 Tetrodotoxin - Distribution and accumulation in aquatic organisms, and cases of human intoxication Mar Drugs, 6, 220-242 Yotsu M, Endo A, Yasurnoto T,1989 An lmproved tetrodotoxin analyzer Agric Biol Chem 53.893-895 Chau R., J A Kalaitzis, B A Neilan, 2011 On the origins and biosynthesis of tetrodotoxin Aquatic Toxicology, volume 104, issues 1-2, p 61-72 Cernohorsky W O., 1984 Systematics of the family Nassariidae (Mollusca: Gastropoda) Bulletin of the Auckland Institute and Museum, 14: 1-356 Taniyama S, Takatani T, Sorimachi T, Sagara T, Kubo H, Oshiro N, Ono K, Xiao N, Tachibana K, Arakawa O, 2013 Toxicity and Toxin Profile of Scavenging and Carnivorous Gastropods from the Coastal Waters of Okinawa Prefecture, Japan Food Hygiene and Safety Science (Shokuhin Eiseigaku Zasshi) Vol 54 (2013) No p 49-55 10 Narita H, Noguchi T, Maruyama J, Nara M, Hashimoto K, 1984 Occurence of tetrodotoxin-associated substance in a gastropod, ‘hanamushirogai’ Zeuxis siquijorensis Bull Jpn Soc Sci Fish 50, 85–89 11 Liu FM, Fu YM and Shih DYC, 2004 Occurrence of Tetrodotoxin Poisoning in Nassarius Papillosus Alectrion and Nassarius Gruneri Niotha Journal of Food and Drug Analysis, Vol 12, No 2, 2004, Pages 189-192 12 Hwang P A., T Noguchi, D F Hwang, 2004 Neurotoxin tetrodotoxin as attractant for toxic snails Fisheries Science, 70: 1106-1112 13 Yasumoto T, Yasumura D, Yotsu M, Michishita T, Endo A and Kotaki Y, 1986 Bacterial production of tetrodotoxin and anhydrotetrodotoxin Agricultural and Biological Chemistry 50: 793–795 14 Matsui T, Sato H, Hamada S, Shimizu C, 1982 Comparison of toxicity of the cultured and wild puffer fish Fugu niphobles Bull Jpn Soc Sci Fish, 48, 253 15 Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), hóa phân tích, tập 2, Trung tâm thông tin-thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tr 107-124, tr173-210 http://tuoitre.vn/tin/song-khoe/20150108/nguy-co-ngo-doc-chet-nguoi-tu-ocbien/696075.html Phụ lục Pha hóa chất Pha mobil phase Pha 1000ml mobil phase tiến hành: - cân 13(g) HFBA( Heptafluoro butyric axit) Cho 3ml axit axetit+900ml nước cất Sau chuẩn pH =5 NH4OH 25% Chuẩn độ lên thành 1000ml Pha NaOH 4N: Cân 80g NaOH cho vào 500ml nước cất Pha washing Solvent-1: Cho 500ml nước cất lọc vào 500ml MeCN Pha washing Solvent-2: Cho 6ml axit acetid thêm nước cất lọc vào đến 1000ml ... Chính chọn đề tài “ Khảo sát độc tố tetrodotoxins số loài họ ốc bùn Nassariidae vùng biển Khánh Hòa phương pháp sắc ký HPLC? ?? Với mục tiêu: Cung cấp liệu độc tố số lồi thuộc họ ốc bùn Nassariidae. .. albescens[9], Hình 2: Một số loại ốc bùn có tiền sử gây độc vùng biển Khánh Hòa Những loại ốc bùn thường sinh sống đáy biển ven bờ Việt Nam, chúng có độc tố Tetrodotoxin loại độc tố thần kinh cực... chúng Báo cáo khoa học Đề tài cấp nhà nước KC-08-05 Đặng Quốc Minh, (2015) Khảo sát độc tố saxitoxins tetrodotoxins số loài họ ốc bùn Nassaridae vùng biển khánh hòa Đề tài sở 2015, phịng hóa sinh