Nghiên cứu phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (black queen cell virus) trên ong mật ở miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH THỊ THU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH THỐI ĐEN MŨ CHÚA (BLACK QUEEN CELL VIRUS) TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH THỊ THU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH THỐI ĐEN MŨ CHÚA (BLACK QUEEN CELL VIRUS) TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đồng Văn Quyền TS Trần Thị Thanh Huyền Hà Nội, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, nhận nhiều động viên, giúp đỡ cá nhân tập thể Trước tiên xin gửi lời biết ơn chân thành tới TS Đồng Văn Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho nghiên cứu thực luận văn phòng Vi sinh vật học phân tử Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới NCS Hà Thị Thu cô chú, anh chị em cơng tác phịng VSVHPT ln nhiệt tình giúp đỡ, tạo cho tơi mơi trường nghiên cứu làm việc nghiêm túc Tôi xin gửi lời biết ơn tới ban lãnh đạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện tốt cho học tập phát triển Đồng thời xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.Trần Thị Thanh Huyền, thầy cô môn Vi sinh vật học giúp đỡ tơi suốt q trình tơi học tập trường Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, người thân, người sát cánh tôi, chia sẻ động viên không ngừng nỗ lực vươn lên học tập sống Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Trịnh Thị Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA LOÀI ONG 1.1.1 Nguồn gốc ong 1.1.2 Hình thái cấu tạo ngồi ong 1.1.3 Vị trí phân loại ong 1.1.4 Các loài ong Việt Nam 1.1.5 Miễn dịch học ong 1.2 TÌNH HÌNH THỊ TRƯỜNG MẬT ONG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 1.2.1 Tình hình thị trường mật ong giới 1.2.2 Tình hình thị trường mật ong Việt Nam 10 1.3 MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP Ở ONG 12 1.3.1 Bệnh ong tác nhân gây bệnh virus 12 1.3.2 Bệnh ong virus gây 16 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÁT HIỆN VIRUS Ở ONG MẬT 23 1.4.1 Phương pháp ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) 23 1.4.2 Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) 24 1.4.3 Phương pháp RT – PCR 25 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG VIỆT NAM 25 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 27 2.2 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 27 2.2.1 Vật liệu 27 2.2.2 Hóa chất sinh phẩm 27 2.2.3 Trang thiết bị 28 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Phương pháp thu mẫu 30 2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30 2.3.3 Xác định nồng độ RNA máy quang phổ nanodrop 31 2.3.4 Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số 31 2.3.5 Khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho BQCV từ cDNA phản ứng PCR 33 2.3.6 Điện di kiểm tra gel agarose 1% 34 2.3.7 Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 35 2.3.8 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli 36 2.3.9 Tách chiết plasmid 37 2.3.10 Cắt kiểm tra plasmid với enzyme giới hạn EcoRI 38 2.3.11 Tinh plasmid tái tổ hợp 39 2.3.12 Giải trình tự gen máy xác định trình tự tự động ABI 3100 40 2.3.13 Nhân dịng gen mã hóa helicase xây dựng phát sinh loài 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 PHÁT HIỆN SỰ LÂY NHIỄM BQCV TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM 44 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số 44 3.1.2 Phát BQCV kỹ thuật RT-PCR 44 3.1.3 Tách dòng sản phẩm RT-PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV 46 3.1.4 Kết giải trình tự đoạn DNA đặc hiệu BQCV 48 3.2 SỰ PHÂN BỐ CỦA BQCV TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM 51 3.3 XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA BQCV LƯU HÀNH TRÊN ONG MẬT TẠI CÁC TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên Tiếng Anh đầy đủ Tên Tiếng Việt BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair BQCV Black queen cell virus Virus gây bệnh thối đen mũ chúa cDNA Complementary DNA DNA bổ sung DEPC Diethyl pyrocacbonate DNA Deoxyribonleotide acid DTT Dithiothreito dNTP Deoxyribonleotide triphosphate Et - Br Ethidium bromide IPTG Isopropylthio-β-D-glactoside kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani NCBI National Centre for Biotechnology Information Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học OD Optical Density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Rnase Ribonuclease RT-PCR Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction Cơng cụ tìm kiếm trình tự Cặp bazơ Phản ứng chuỗi trùng hợp chép ngược DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ong chúa đàn ong nội Hình 1.2 Ong chúa đàn ong ngoại Hình 1.3 Tốp 10 nước đạt kim ngạch xuất mật ong lớn giới năm 2013 Hình 1.4 Ấu trùng bị nhiễm BQCV 17 Hình 1.5 Nhộng bị nhiễm BQCV 17 Hình 1.6 Ong chúa khỏe mạnh với mũ chúa mở nắp 17 Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc genom BQCV 18 Hình 2.1 Sơ đồ mô tả bước thực nghiên cứu 29 Hình 2.2 Vector tách dòng pCR2.1 36 Hình 3.1 Kết điện di gel agarose xác định mẫu dương tính với 45 BQCV từ mẫu ong miền Bắc Việt Nam 45 Hình 3.2 Kết tách chiết plasmid từ khuẩn lạc màu trắng khuẩn lạc màu xanh 47 Hình 3.3 Kết điện di gel agarose 1% sản phẩm cắt plasmid 48 tái tổ hợp EcoRI 48 Hình 3.4 Trình tự đoạn DNA ngoại lai gắn vector pCR2.1 tái tổ hợp 49 Hình 3.5: Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn DNA đặc hiệu BQCV lưu hành Việt Nam với trình tự nucleotide BQCV từ Nam Phi 51 Hình 3.6 Tỷ lệ nhiễm BQCV tỉnh miền Bắc Việt Nam 53 Hình 3.7 Cây phát sinh lồi BQCV dựa trình tự gen mã hóa Helicase 55 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình nhập mật ong vào Mỹ năm 2013 11 Bảng 2.1.Thành phần phản ứng hỗn hợp A 32 Bảng 2.2.Thành phần phản ứng hỗn hợp B 32 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA 32 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu 33 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn nối DNA vào vector tách dòng 36 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid 39 Bảng 2.7.Thành phần phản ứng giải trình tự gen 40 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA mã hóa helicase 42 Bảng 3.1 Kết so sánh trình tự nuclotide đoạn DNA tách dịng với trình tự gen BQCV Genbank 49 MỞ ĐẦU Từ xa xưa, ong sản phẩm từ ong quà quý thiên nhiên ban tặng cho người Ong có mặt khắp nơi trái đất đặc biệt nơi có thảm thực vật phong phú đa dạng Nghề nuôi ong đóng vai trị quan trọng đời sống người Ong cung cấp cho sản phẩm có giá trị cao mật ong, phấn hoa, sữa chúa, keo ong, nọc ong Mật ong, phấn hoa sản phẩm thu từ ong mật, khơng có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho người mà phương thuốc quý chữa bệnh Sáp ong, keo ong, nọc ong sản phẩm có giá trị dùng để chữa bệnh nguyên liệu cho số ngành công nghiệp [6] Ngoài việc cung cấp sản phẩm quý kể ong cịn có vai trị quan trọng nơng nghiệp, góp phần làm tăng suất cho nhiều loại trồng thơng qua q trình thụ phấn cho hoa Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, thảm thực vật phong phú đa dạng Đó điều kiện tốt để nước ta phát triển nghề nuôi ong mật, điều kiện thuận lợi cho bệnh ong phát triển [1] Hiện nay, Việt Nam có khoảng 1.500.000 đàn ong với sản lượng 37.000 mật ong Đây 10 sản phẩm xuất hàng đầu nước có xu hướng tăng theo năm Tuy nhiên năm gần đây, ngành ong nước ta phải đối mặt với việc xuất không ổn định tình hình dịch bệnh vấn đề tồn dư kháng sinh có mật ong Ong mật thường bị công nhiều tác nhân gây bệnh bao gồm virus, vi khuẩn, nấm ký sinh trùng… Các liệu nghiên cứu bệnh ong năm gần cho thấy, nguyên nhân gây tổn thất cho nghề nuôi ong nước ta virus, đặc biệt virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) Do thiếu kiến thức bệnh ong mật, khơng biết xác ngun nhân gây bệnh, người nuôi ong thường sử dụng kháng sinh để kiểm soát tất loại bệnh bao gồm virus Tuy nhiên, bệnh ong virus điều trị kháng sinh Việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh điều trị dự phịng cho bệnh khơng xác dẫn đến xuất vi khuẩn kháng kháng sinh, đồng thời dẫn đến tồn dư kháng sinh sản phẩm ong Vì vậy, nghiên cứu phát virus gây bệnh ong mật có virus gây bệnh thối đen mũ chúa cần thiết sở khoa học cho việc phòng chống bệnh, đề biện pháp khoanh vùng dập tắt dịch bệnh góp phần phát triển bền vững ngành nuôi ong Xuất phát từ sở trên, thực đề tài: "Nghiên cứu phát virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) ong mật miền Bắc Việt Nam" với mục đích nghiên cứu sau: - Chẩn đốn Black queen cell virus ong mật - Xác định phân bố Black queen cell virus trại nuôi ong mật miền Bắc Việt Nam - Xác định nguồn gốc tiến hóa Black queen cell virus gây bệnh ong mật miền Bắc Việt Nam Đề tài thực Phòng Vi sinh vật học Phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 45 EF517510.1- Hungary 38 EF517502 Ao 59 EF517501.1 - Ao 94 EF517512.1 Hungary EF717517 Balan 36 EF517518 Balan2 96 34 T272 30 14 60 100 T309 T320 T285 T329 T287 61 JQ434127 - Han Quoc JQ434128.1 Han Quoc JQ434129.1 - Han Quoc 97 JQ434130 Han Quoc 79 JQ434131 - Han Quoc 0.2 Hình 3.7 Cây phát sinh lồi BQCV dựa trình tự gen mã hóa Helicase Kết cho thấy, phát sinh lồi chia làm nhánh Trong BQCV Việt Nam nước Balan, Hugary, Áo lập thành nhánh thứ BQCV từ Hàn Quốc lập thành nhánh riêng biệt thứ Qua thấy BQCV lưu hành Việt Nam có nguồn gốc từ nước châu Âu mà khơng phải có nguồn gốc từ châu Á (Hàn Quốc) Nguyên nhân điều người nuôi ong nhập ong chúa từ nước châu Âu dẫn đến mang theo mầm bệnh BQCV xâm nhập vào loài ong địa Tuy nhiên, nhánh thứ chủng BQCV Việt Nam tạo thành phân nhánh riêng biệt Điều chứng tỏ BQCV Việt Nam có biến đổi đáng kể so với chủng có nguồn gốc từ châu Âu Một số nghiên cứu cho enzyme liên quan đến khác biệt độc lực chủng BQCV khác nhau, thấy độc lực BQCV lưu hành miền Bắc Việt Nam có mức độ khác biệt so với chủng BQCV từ châu Á châu Âu Mặc dù vậy, cần có thêm nghiên cứu để làm sáng tỏ giả thuyết 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu q trình điều tra, nghiên cứu chúng tơi rút số kết luận sau:  Đã thu thập 90 đàn ong bao gồm mẫu ấu trùng ong truởng thành từ trại nuôi ong tỉnh miền Bắc Việt Nam: Hưng Yên, Điện Biên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ An  Thiết kế cặp mồi đặc hiệu BQCV phát triển kỹ thuật RTPCR để phát BQCV gây bệnh ong mật miền Bắc Việt Nam dựa trình tự gen mã hóa protein cấu trúc có chiều dài 701bp trình tự gen mã hóa Helicase có chiều dài 729 bp  Kết khảo sát cho thấy, Bắc Giang tỉnh phát số trường hợp ong nhiễm BQCV cao (36%), Điện Biên có tỷ lệ nhiễm BQCV cao thứ hai (29%), tỉnh Hưng Yên Nghệ An có số trường hợp nhiễm BQCV 21% 14% Hịa Bình khơng phát trường hợp bị nhiễm BQCV  Xây dựng phát sinh lồi BQCV dựa trình tự thu 11 trình tự BQCV quốc gia khác (Balan, Hungary, Áo Hàn Quốc) Kết phân tích cho thấy chủng BQCV lưu hành Việt Nam có nguồn gốc từ nước châu Âu Kiến nghị:  Tiếp tục nghiên cứu phát khảo sát phân bố BQCV mở rộng nghiên cứu virus khác gây bệnh ong mật tỉnh khác Việt Nam để có tranh tổng thể phân bố virus gây bệnh ong Việt Nam  Giải mã toàn hệ gen BQCV lưu hành Việt Nam 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phùng Hữu Chính (2008), Cẩm nang nuôi ong, Nhà xuất Hà Nội Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Duy Hoan, Phùng Đức Tồn, Ngơ Nhật Thắng (2008), Giáo trình kỹ thuật nuôi ong mật, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Lê Thanh Hồ, Phạm Viết Liên, Phạm Cơng Hoạt (2004), “Giám định virut gây bệnh "nhộng bọc" (Sacbrood) ong mật Việt Nam phương pháp sinh học phân tử”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11(2), tr.19-26 Võ Thị Thương Lan (2011), Giáo trình sinh học phân tử tế bào ứng dụng, Nhà xuất giáo dục Việt Nam Nguyễn Văn Long, Nguyễn Huy Trí, Bùi Thị Điểm, Trần Thị Ngọc (2005), Giáo trình dâu tằm – ong mật, Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Phạm Hồng Thái, Hà Viết Cường, Nguyễn Văn Giang, Trần Đình Chiến, Nguyễn Văn Đĩnh, Hà Quang Hùng (2011), “Molecular detections of sacbrood and deformed wing virus infected on Apis mellifera in the northern Vietnam”, Science and technology journal of agriculture and rural development,165, pp 33 – 36 Trương Văn Tuấn, Đinh Quyết Tâm, Trần Văn Toàn, Lê Quang Trung, Phùng Quốc Chướng, Nguyễn Chi Mai (2012), “Virus ong Apis Mellifera Apis Cerana Việt Nam”, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thôn kỳ tháng 12 năm 2012, tr 28-33 10 Phạm Văn Ty (2013), Virut học, Nhà xuất giáo dục Việt Nam 11 Nguyễn Ngọc Vững (2010), “Điều tra, đánh giá thực trạng sản xuất ngành ong Việt Nam”, Báo cáo kết thực dự án điều tra 57 Tiếng Anh 12 Alippi, A.M (1999), “Bacterial diseases”, CIHEAM - Options Mediterraneennes, pp 31-46 13 Anderson, D L (1993), “Pathogens and queen bees”, Australasian Beekeeper 94, pp 292- 296 14 Anderson D.L, Gibbs A.J (1988), “Inapparent virus infections and their interactionsin pupae of honey bee (Apis mellifera Linnaeus) in Australia”, J.Gen Virol, 69, pp 1617-1625 15 Allen and Ball (1996), “The incidence and word distribution of honeybee viruses”, Bee World, 77, pp 141 – 162 16 Aubert M., Ball B V., Fries I., Moritz R., Milani N., Bernardinelli I (2008), Virology and the honey bee Directorate - General for Research EUR, European Community 17 Bailey L., Wood LD., (1977), “Two small RNA viruses from honeybees and further obervations on sacbrood and acture bee paralysis viruses”, J Gen Virol 37,pp 175 – 182 18 Bailey L., Ball B.V., Perry J.N, (1981a), “The prevalence of viruses of honey bees in Britain”, Ann Appl Biol, 97, pp 109-118 19 Bailey L., Ball B.V., Perry J.N, (1983a), “Association of viruses with two protozoal pathogens of the honey bee”, Ann Appl Biol ,103, pp 13-20 20 Bailey L and Ball BV, (1991), “Honeybee pathology”, 2nd end, Academic, London 21 Ball and Gosh, et al (1999 ), “The nucleotide sequence of sacbrood virus of the honey bee: an insect picorna-like virus ”, Journal of General Virology, 80, pp.1541 -1549 22 Byoung-Su Yoon, Lien Thi Kim Nguyen, Thuy Thi Dieu Nguyen, Dong Van Quyen, Suk-Chan Jung, Ki-Yoon Chang, Seung Won Kang (2012) “Phylogenetic 58 analysis of black queen cell virus genotypes in South Korea”, Springer Science+Business Media New York 23 Bakonyi, T., Farkas, R., Szendroi, A., Dobos-Kovacs, M., Rusvai, M (2002), “Detection of acute bee paralysis virus by RT-PCR in honeybee and Varroa destructor field samples” rapid screening of representative Hungarian apiaries Apidologie, 33, pp 63-74 24 Chen Y.P Pettis J.S., Collins A., and Feldlaufer M.F (2006a), “Prevalence and Transmission of Honeybee Viruses”, Applied and Enviromental microbiology, Vol 72, No 1, pp 606-611 25 David Stone, M.S (2005), “An Introduction to Bee Biology”, Prepared for the UIUC BeeSpace Project, pp 13-14 26 Elize Lindsay Topley (2009), Molecular detection and characterisation of RNA viruses of honeybees, University of the Western Cape 27 Ellis, J.D and Munn, P (2005), “The worldwide health status of honey bees”, Bee World 86, pp.88-101 28 FAO, (2006), “Honey bee diseases and pests: a practical guide”, Agricultural and Food Engineering Technical reports, pp – 29 Glinski, Z., and Buczek, K (2003), “Response of the Apoidea to fungal infections”, Apiacta,38, pp.183–189 30 Grabensteiner E., Bakonyi T., Ritter W., Pechhacker H and Nowotny N (2007), “Development of a multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of three viruses of the honeybee (Apis mellifera L.): Acute bee paralysis virus, Black queen cell virus and Sacbrood virus”, Journal of Invertebrate Pathology, Vol 94, No 3, March 2007, pp 222-225 31 Genersch,E., C.Yue, I.Fries, and J.R.Miranda (2006), “Detection of Deformed wing virus (DWV), a honeybee viral pathogen, in bumble bees (Bombus terrestris and Bombus pascuorum) with wing deformities”, J.Inver-tebr.Pathol,91, pp.61–63 59 32 Kondreddy Eswar Reddy, Jin Hyeong Noh, Se Eun Choe, Chang Hee Kweon, Mi Sun Yoo, Huong Thi Thanh Doan, Mummadireddy Ramya, Byoung-Su Yoon, Lien Thi Kim Nguyen, Thuy Thi Dieu Nguyen, Dong Van Quyen, Suk-Chan Jung, Ki-Yoon Chang, Seung Won Kang (2013), “Analysis of the complete genome sequence and capsid region of black queen cell viruses from infected honeybees (Apis mellifera) in Korea”, Springer Science+Business Media New York 33 Kilani, M (1999), “Nosemosis”, CIHEAM - Options Mediterraneennes, pp 99106 34 Moore, N, F., Reavy, B & King, L.A (1985) “General characteristic gene organization and expression of small RNA viruses of insects”, Journal of Gennal Virology, 66, pp.647459 35 Mayo, M A (2002), “Virus Taxonomy- Houston”, Arch Virol 147, pp.1071– 1076 36 Mongi Benjeddou (2002), Molecular detection and genetic manipulation of the black queen cell virus, University of the Western Cape 37 Mongi Benjeddou, Neil Leat, Mike Allsopp, and Sean Davision, “Detection of Acute Bee Paralysis Virus and Black Queen Cell Virus from Honeybees by Reverse Transcriptase PCR” Appl Environ Microbiol May 2001; 67(5),pp 2384–2387 38 M Higes, F Esperón and J M Sánchez-Vizcaíno (2007), “Short communication First report of black queen-cell virus detection in honey bees (Apis mellifera) in Spain”, Spanish Journal of Agricultural Research 39 Neil Leat, Brenda Ball, Vandana Govan, and Sean Davision, “Analysis of the complete genome sequence of black queen-cell virus, a picorna-like virus of honey bees”, Journal of General Virologyvir.sgmjournals.org, 81, pp.2111–2119 40 Olivier V., Blanchard P., Chaouch S., Lallemand P., Schurr F., Celle O., Dubios E., Tordo, N., Thiéry, R., Houglgatte, R & Ribière, M., (2008), “Molecular Characterisation and phylogenetic analysis of chronic bee paralysis virus, a honey bee virus”,Virus Res, 132, pp 59-68 60 41 Rinderer T.E., Rothenbuhler W.C (1975a) “Responses of three genetically different stocks of the honeybee to a virus from bees with hairless-black syndrome”, J Invertebr Pathol 25, pp 297-300 42 Shimanuki H., and Knox D.A (2000), “Diagnosis of Honey Bee Diseases, U.S Department of Agriculture”, Agriculture Handbook, AH–690 43 Siede R., Büchler R (2003), “Symptomatic black queen cell virus infection of drone brood in Hessian apiaries”, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 116, pp 130-133 44 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork 45 Tentcheva D., Gauthier L., Zappulla N., Dainat B., Cousserans F., Colin M.E and Bergoin M (2004) “Prevalence and Seasonal Variations of Six Bee Viruses in Apis mellifera L and Varroa destructor Mite Populations in France, Appl Environ Microbiol, 70, pp 7185-7191 46 Yanping Chen, Yan Zhao, John Hammond, Hei-ti Hsu, Jay Evans, Mark Feldlaufer, “Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses”, Journal of Invertebrate Pathology, 87 (2004),pp 84–93 47 Yang X., and Cox-Foster D L (2005), “Impact of an ectoparasite on the immunity and pathology of an invertebrate: Evidence for host immunosuppression and viral amplification”, Proc Nat Acad Sci USA 102, pp.7470–7475 Các website: 48 Agriculture and Agri-Food Canada 49 Báo Kinh tế Việt Nam, http://ven.vn/ 50 http://ongmiennui.com/ 61 PHỤ LỤC Phụ luc Kết tách RNA tổng số trại ong tỉnh miền Bắc STT Mẫu C ng/ul A260/A280 STT ĐB.T255 800 1.94 91 ĐB.A255 1896.3 2.01 ĐB.T256 384.9 1.93 92 ĐB.A256 816.6 1.88 ĐB.T257 1879.8 2.11 93 ĐB.A257 1631.5 2.05 ĐB.T258 356.2 1.94 94 ĐB.A258 511.2 1.82 ĐB.T259 264.1 1.94 95 ĐB.A259 882.2 1.86 ĐB.T260 581.8 96 ĐB.A260 1879.2 2.03 ĐB.T261 1149.1 2.05 97 ĐB.A261 811.4 ĐB.T262 1149.1 2.05 98 ĐB.A262 810.6 1.92 ĐB.T263 556.3 1.77 99 ĐB.A263 420.2 1.88 10 ĐB.T264 733.6 1.9 100 ĐB.A264 2184.4 1.49 11 ĐB.T265 804.1 1.91 101 ĐB.A265 648.5 1.86 12 ĐB.T266 600.8 1.82 102 ĐB.A266 1996.9 1.96 13 ĐB.T267 724.2 1.93 103 ĐB.A267 1942.5 2.04 14 ĐB.T268 336.8 104 ĐB.A268 1402.3 1.98 15 ĐB.T269 1737.4 2.07 105 ĐB.A269 1073.7 1.99 16 ĐB.T270 2332.5 1.88 106 ĐB.A270 1340 1.94 17 ĐB.T271 806.1 2.08 107 ĐB.A271 1821.7 0.86 18 ĐB.T272 1130.4 1.9 108 ĐB.A272 763.8 1.63 19 HY.T273 381 1.85 109 HY.A273 1137 0.52 20 HY.T274 507 1.94 110 HY.A274 1568 1.49 21 HY.T275 420 1.89 111 HY.A275 2270 1.43 22 HY.T276 1286 1.95 112 HY.A276 2006 1.02 23 HY.T277 664 1.73 113 HY.A277 2169 1.18 62 Mẫu C ng/ul A260/A280 STT Mẫu C ng/ul A260/A280 STT 24 HY.T278 1578 2.08 114 HY.A278 2247 1.84 25 HY.T279 2357 1.82 115 HY.A279 2114 1.98 26 HY.T280 315 1.61 116 HY.A280 1327 1.85 27 HY.T281 485 2.01 117 HY.A281 1401 1.87 28 HY.T282 927 1.95 118 HY.A282 2108 1.51 29 HY.T283 632 1.9 119 HY.A283 1832 1.79 30 HY.T284 1778 2.02 120 HY.A284 2179 1.66 31 HY.T285 2129 2.07 121 HY.A285 2255 1.8 32 HY.T286 723 122 HY.A286 2323 1.75 33 HY.T287 1872 2.14 123 HY.A287 1988 1.81 34 HY.T288 1506 2.03 124 HY.A288 2084 2.02 35 HY.T289 1170 1.99 125 HY.A289 1435 1.86 36 HY.T290 1639 1.95 126 HY.A290 1842 1.96 37 HB.T291 1595 2.03 127 HB.A291 1558 1.77 38 HB.T292 1191 2.05 128 HB.A292 2229 1.7 39 HB.T293 1293 1.84 129 HB.A293 1194 1.55 40 HB.T294 1802 2.01 130 HB.A294 1643 1.91 41 HB.T295 1629 2.05 131 HB.A295 926 1.78 42 HB.T296 1839 2.05 132 HB.A296 1872 1.79 43 HB.T297 1957 2.08 133 HB.A297 1577 2.09 44 HB.T298 632 1.94 134 HB.A298 2218 1.78 45 HB.T299 1200 135 HB.A299 1880 1.89 46 HB.T300 1353 2.06 136 HB.A300 2293 1.01 47 HB.T301 1780 2.15 137 HB.A301 210 1.04 48 HB.T302 375 1.84 138 HB.A302 1835 1.85 63 Mẫu C ng/ul A260/A280 STT Mẫu C ng/ul A260/A280 STT 49 HB.T303 1353 2.09 139 HB.A303 2285 1.69 50 HB.T304 1838 2.11 140 HB.A304 2058 1.06 51 HB.T305 1687 2.14 141 HB.A305 1937 1.89 52 HB.T306 887 2.07 142 HB.A306 1609 1.96 53 HB.T307 2426 1.71 143 HB.A307 2276 1.63 54 HB.T308 1428 2.09 144 HB.A308 2284 1.52 55 BG.T309 1393 1.99 145 BG.A309 773 1.94 56 BG.T310 1354 1.97 146 BG.A310 2051 2.05 57 BG.T311 1378 2.06 147 BG.A311 1304 2.01 58 BG.T312 2261 1.99 148 BG.A312 1797 2.05 59 BG.T313 2283 1.73 149 BG.A313 1174 60 BG.T314 2264 1.91 150 BG.A314 1421 1.81 61 BG.T315 1709 2.07 151 BG.A315 1445 1.93 62 BG.T316 2365 1.63 152 BG.A316 2246 1.92 63 BG.T317 2101 1.99 153 BG.A317 2229 1.78 64 BG.T318 2314 1.83 154 BG.A318 2269 1.68 65 BG.T319 1878 2.14 155 BG.A319 1564 1.84 66 BG.T320 2635 2.15 156 BG.A320 2075 2.01 67 BG.T321 1564 1.89 157 BG.A321 2265 1.78 68 BG.T322 1077 1.71 158 BG.A322 1938 0.97 69 BG.T323 2022 1.09 159 BG.A323 2285 1.76 70 BG.T324 1711 1.82 160 BG.A324 1867 1.9 71 BG.T325 406 1.7 161 BG.A325 1393 1.82 72 BG.T326 1044 1.94 162 BG.A326 1440 1.81 73 NA.T327 2294 1.86 163 NA.A327 1727 1.98 64 Mẫu C ng/ul A260/A280 STT Mẫu C ng/ul A260/A280 STT Mẫu C ng/ul A260/A280 74 NA.T328 1610 2.04 164 NA.A328 1878 1.97 75 NA.T329 640 1.08 165 NA.A329 2145 1.86 76 NA.T330 1203 1.91 166 NA.A330 1407 0.82 77 NA.T331 381 1.77 167 NA.A331 1511 1.88 78 NA.T332 2347 1.81 168 NA.A332 2260 1.78 79 NA.T333 1098.3 1.51 169 NA.A333 1016.1 2.01 80 NA.T334 684.5 1.75 170 NA.A334 1452.6 1.91 81 NA.T335 1007.6 1.92 171 NA.A335 2351.8 1.77 82 NA.T336 742.4 1.91 172 NA.A336 855.3 1.41 83 NA.T337 983.2 2.05 173 NA.A337 674.8 1.77 84 NA.T338 1195.1 2.22 174 NA.A338 1204 1.86 85 NA.T339 572.5 1.79 175 NA.A339 731 1.94 86 NA.T340 1152.4 2.04 176 NA.A340 127.7 1.86 87 NA.T341 791.7 2.01 177 NA.A341 1276 1.85 88 NA.T342 874.6 2.03 178 NA.A342 1300.5 1.85 89 NA.T343 1257.4 2.09 179 NA.A343 1302.6 90 NA.T344 656 1.92 180 NA.A344 929.6 1.72 Ghi chú: Kết tách RNA tổng số trại ong tỉnh miền Bắc theo thứ tự bao gồm: Điện Biên (ĐB.A 255-272 ĐB.T 290), 255-272), Hưng n (HY.A273- 290 HY.T273- Hịa Bình (HB.A291-308và HB.T291-308), Bắc Giang (BG.A309-326 BG.T309-326), Nghệ An (NA.A327-344 NA.T327-344) 65 Phụ lục Bảng thống kê kết RT-PCR phát BQCV từ mẫu ong mật thu thập miền Bắc Việt Nam Kết PCR Kết PCR STT Mẫu Kết Mẫu Kết STT Mẫu Kết Mẫu ĐB.T255 (-) ĐB.A255 (-) 46 HB.T300 (-) HB.A300 ( ĐB.T256 (+) ĐB.A256 (-) 47 HB.T301 (-) HB.A301 (-) ĐB.T257 (+) ĐB.A257 (-) 48 HB.T302 (-) HB.A302 (-) ĐB.T258 (-) ĐB.A258 (-) 49 HB.T303 (-) HB.A303 (-) ĐB.T259 (-) ĐB.A259 (-) 50 HB.T304 (-) HB.A304 (-) ĐB.T260 (-) ĐB.A260 (-) 51 HB.T305 (-) HB.A305 (-) ĐB.T261 (-) ĐB.A261 (-) 52 HB.T306 (-) HB.A306 (-) ĐB.T262 (-) ĐB.A262 (-) 53 HB.T307 (-) HB.A307 (-) ĐB.T263 (-) ĐB.A263 (-) 54 HB.T308 (-) HB.A308 (-) 10 ĐB.T264 (-) ĐB.A264 (-) 55 BG.T309 (+) BG.A309 (-) 11 ĐB.T265 (-) ĐB.A265 (-) 56 BG.T310 (-) BG.A310 (-) 12 ĐB.T266 (+) ĐB.A266 (-) 57 BG.T311 (-) BG.A311 (-) 13 ĐB.T267 (-) ĐB.A267 (-) 58 BG.T312 (-) BG.A312 (-) 14 ĐB.T268 (-) ĐB.A268 (-) 59 BG.T313 (-) BG.A313 (-) 15 ĐB.T269 (-) ĐB.A269 (-) 60 BG.T314 (-) BG.A314 (-) 16 ĐB.T270 (-) ĐB.A270 (-) 61 BG.T315 (-) BG.A315 (-) 17 ĐB.T271 (-) ĐB.A271 (-) 62 BG.T316 (-) BG.A316 (-) 18 ĐB.T272 (+) ĐB.A272 (-) 63 BG.T317 (-) BG.A317 (-) 19 HY.T273 (-) HY.A273 (-) 64 BG.T318 (-) BG.A318 (-) 20 HY.T274 (-) HY.A274 (-) 65 BG.T319 (-) BG.A319 (-) 21 HY.T275 (-) HY.A275 (-) 66 BG.T320 (+) BG.A320 (-) 22 HY.T276 (-) HY.A276 (-) 67 BG.T321 (+) BG.A321 (-) 23 HY.T277 (-) HY.A277 (-) 68 BG.T322 (+) BG.A322 (-) 24 HY.T278 (-) HY.A278 (-) 69 BG.T323 (-) BG.A323 (-) 25 HY.T279 (-) HY.A279 (-) 70 BG.T324 (-) BG.A324 (-) 26 HY.T280 (-) HY.A280 (-) 71 BG.T325 (-) BG.A325 (-) 27 HY.T281 (-) HY.A281 (-) 72 BG.T326 (+) BG.A326 (-) 28 HY.T282 (-) HY.A282 (-) 73 NA.T327 (-) NA.A327 (-) 29 HY.T283 (-) HY.A283 (-) 74 NA.T328 (-) NA.A328 (-) 66 Kết Kết PCR STT Mẫu 30 Kết PCR STT Mẫu HY.A284 Kết (-) 75 (+) HY.A285 (-) HY.T286 (+) HY.A286 33 HY.T287 (+) 34 HY.T288 35 HY.T284 Kết (-) NA.T329 Kết (+) NA.A329 Kết (-) 31 HY.T285 76 NA.T330 (-) NA.A330 (-) 32 (-) 77 NA.T331 (-) NA.A331 (-) HY.A287 (-) 78 NA.T332 (-) NA.A332 (-) (-) HY.A288 (-) 79 NA.T333 (-) NA.A333 (-) HY.T289 (-) HY.A289 (-) 80 NA.T334 (-) NA.A334 (-) 36 HY.T290 (-) HY.A290 (-) 81 NA.T335 (-) NA.A335 (-) 37 HB.T291 (-) HB.A291 (-) 82 NA.T336 (-) NA.A336 (-) 38 HB.T292 (-) HB.A292 (-) 83 NA.T337 (-) NA.A337 (-) 39 HB.T293 (-) HB.A293 (-) 84 NA.T338 (-) NA.A338 (-) 40 HB.T294 (-) HB.A294 (-) 85 NA.T339 (-) NA.A339 (-) 41 HB.T295 (-) HB.A295 (-) 86 NA.T340 (+) NA.A340 (-) 41 HB.T296 (-) HB.A296 (-) 87 NA.T341 (-) NA.A341 (-) 43 HB.T297 (-) HB.A297 (-) 88 NA.T342 (-) NA.A342 (-) 44 HB.T298 (-) HB.A298 (-) 89 NA.T343 (-) NA.A343 (-) 45 HB.T299 (-) HB.A299 (-) 90 NA.T344 (-) NA.A344 (-) Mẫu Ghi : (+): Là mẫu dương tính với BQCV (-): Là mẫu âm tính với BQCV Phụ lục Kết giải trình tự đoạn gen Helicase mẫu T272 67 Mẫu Phụ lục Kết giải trình tự đoạn gen Helicase mẫu T285 Phụ lục Kết giải trình tự đoạn gen Helicase mẫu T287 Phụ lục Kết giải trình tự đoạn gen Helicase mẫu T309 68 Phụ lục Kết giải trình tự đoạn gen Helicase mẫu T320 Phụ lục Kết giải trình tự đoạn gen Helicase mẫu T329 69 ... ni ong Xuất phát từ sở trên, thực đề tài: "Nghiên cứu phát virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) ong mật miền Bắc Việt Nam" với mục đích nghiên cứu sau: - Chẩn đoán Black queen. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH THỊ THU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH THỐI ĐEN MŨ CHÚA (BLACK QUEEN CELL VIRUS) TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số :... queen cell virus ong mật - Xác định phân bố Black queen cell virus trại nuôi ong mật miền Bắc Việt Nam - Xác định nguồn gốc tiến hóa Black queen cell virus gây bệnh ong mật miền Bắc Việt Nam Đề