Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm AH7N9 dùng cho người bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮC XIN CÚM A/H7N9 DÙNG CHO NGƯỜI BẰNG CÔNG NGHỆ NI CẤY TRÊN TRỨNG GÀ CĨ PHƠI ḶN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮC XIN CÚM A/H7N9 DÙNG CHO NGƯỜI BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TRÊN TRỨNG GÀ CĨ PHƠI ḶN VĂN THẠC SĨ Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 551/QĐ-ĐHNT ngày 21/06/2017 Quyết định thành lập HĐ: 196/QĐ-ĐHNT ngày 09/03/2018 Ngày bảo vệ: 22/03/2018 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS BS LÊ VĂN BÉ PGS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA Chủ tịch Hội đồng: PGS TS NGUYỄN VĂN DUY Phòng đào tạo sau đại học: KHÁNH HÒA – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm A/H7N9 dùng cho người công nghệ nuôi cấy trứng gà có phơi” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, ngày tháng năm Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tuyết iii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cảm ơn: Thầy cô Viện Công nghệ sinh học môi trường – Trường Đại học Nha Trang trang bị cho kiến thức sở, chun ngành q giá để tơi hoàn thành tốt luận văn Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Trưởng khoa sau Đại học lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học môi trường lời cảm ơn, niềm kính trọng, tự hào học tập năm qua Xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS BS Lê Văn Bé Viện Trưởng Viện Vắc xin sinh phẩm y tế, Thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa tận tình hướng dẫn giúp đỡ động viên tơi suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Hội đồng khoa học kỹ thuật đạo đức Viện vắc xin sinh phẩm y tế chia đóng góp ý kiến quý báu nhằm giúp đỡ động viên Xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ bạn phòng vắc xin cúm, phòng Kiểm định, phòng Đảm Bảo Chất Lượng anh chị em đồng nghiệp Viện Vắc xin sinh phẩm y tế nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn đến bạn học viên cao học chia sẻ, trao đổi kiến thức đóng góp ý kiến quý báu nhằm giúp đỡ động viên tơi hồn thành nghiên cứu Xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện, động viên, chia sẻ kịp thời tơi q trình nghiên cứu Nha Trang, ngày… Tháng….năm Học viên thực Nguyễn Thị Tuyết iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh cúm 1.2 Tình hình mắc bệnh cúm A/H7N9 người giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 người giới 1.2.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 người Việt Nam 1.3 Tổng quan Vi rút cúm A/H7N9 1.3.1 Cấu trúc vi rút cúm A/H7N9 1.3.2 Cấu trúc, chức kháng nguyên HA (Haemagglutinin) 1.3.3 Cấu trúc, chức kháng nguyên NA (neuraminidase) 10 1.3.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên 11 1.3.5 Cơ chế xâm nhiễm vào tế bào vật chủ 12 1.3.6 Khả gây bệnh 14 1.4 Tổng quan vắc xin cúm 14 1.4.1 Các loại vắc xin cúm 15 1.5 Tổng quan công nghệ sản xuất vắc xin cúm 19 1.5.1 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trứng gà có phơi 19 1.5.2 Một số phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác 21 1.6 Tổng quan Nghiên cứu sản xuất vắc xin H7N9 nước 21 1.6.1 Tình hình nghiên cứu vắc xin H7N9 nước 21 v 1.6.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin H7N9 nước 23 1.7 Tổng quan Công nghệ sản xuất vắc xin cúm IVAC 23 1.7.1 Cơ sở sản xuất vắc xin cúm IVAC 23 1.8 Kiểm định vắc xin cúm A/H7N9 32 1.8.1 Kiểm định nước cốt vắc xin cúm 32 1.8.2 Kiểm định thành phẩm 32 1.8.3 Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin cúm thành phẩm 33 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 35 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 35 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 35 2.2 Vật liệu 35 2.2.1 Chủng sản xuất 35 2.2.2 Trứng gà nguyên liệu 35 2.2.3 Hóa chất, sinh phẩm chuẩn, dung dịch đệm 35 2.2.4 Thiết bị, dụng cụ 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 37 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát tối ưu hóa quy trình ni cấy vi rút 37 2.3.3 Nghiên cứu thẩm định quy trình bất hoạt vắc xin cúm A/H7N9 41 2.3.4 Thiết lập thơng số nghiên cứu vào quy trình 42 2.3.5 Phương pháp kiểm định đánh giá kết 43 2.4 Phương pháp nghiên cứu đánh giá tính an tồn tính sinh miễn dịch: 46 2.4.1 Nghiên cứu tính an tồn 46 2.4.2 Nghiên cứu tính sinh miễn dịch 48 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Kết thiết lập thông số sản xuất 51 3.1.1 Xác định độ pha loãng chủng vi rút xác định nhiệt độ, thời gian nuôi cấy vi rút tối ưu trứng gà có phơi 51 vi 3.1.2 Thông số thẩm định quy trình bất hoạt vi rút 55 3.1.3 Thiết lập thông số sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 57 3.2 Kết áp dụng thông số thiết lập vào sản xuất 58 3.2.1 Sản xuất lô nước cốt kháng nguyên 58 3.2.2 Kết áp dụng thông số bất hoạt vào quy trình sản xuất: 59 3.2.3 Kết kiểm tra chất lượng lô kháng nguyên cúm A/H7N9 cô đặc 59 3.2.4 Kết kiểm tra chất lượng vắc xin lô vắc xin thành phẩm 61 3.3 Kết nghiên cứu tính an tồn tính sinh miễn dịch động vật 62 3.3.1 Nghiên cứu tính an tồn 62 3.3.2 Nghiên cứu tính sinh miễn dịch 64 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phịng ngừa kiểm sốt bệnh, Hoa kỳ) DĐVN Dược điển Việt Nam EU Endotoxin Unit (đơn vị nội độc tố) EID50 Egg Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50 % phôi gà) FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm, Hoa kỳ) GMP Good manufacturing Practice (Thực hành sản xuất tốt) HA Haemagglutinin (Kháng nguyên bề mặt vi rút cúm ) HI (HAI) Haemagglutinin Inhibition (Ức chế ngưng kết hồng cầu) IVAC Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế MSL Master seed lot (Loạt chủng gốc giống) NA Neuraminidase (enzyme bề mặt vi rút cúm) NIBSC National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia tiêu chuẩn kiểm định Sinh học, Vương quốc Anh) NC Nghiên cứu PBS Phosphate Buffer Saline (dung dịch đệm photphat) RIV Residual Infectious Virus (vi rút sống tồn lưu) SPF Specific Pathogen Free (Khơng có tác nhân gây bệnh đặc hiệu) SRID Single radial immuno diffusion (Khuếch tán miễn dịch vòng đơn) TCCS Tiêu chuẩn sở viii TCCL Tiêu chuẩn chất lượng TNLS Thử nghiệm lâm sàng TN Thử nghiệm VLP Virus like particle (vắc xin dạng hạt giống vi rút) WSL Working seed lot (Loạt chủng sản xuất) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) WHO-TRS World Health Organization – Technical Report Series (Tổ chức Y tế Thế giới – Báo cáo kỹ thuật) ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chất lượng nước cốt vắc xin cúm A/H7N9 (Ph Eur, 2008; WHO, Technical Report Series 927, 2005; Bộ Y tế, 2009) 33 Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin cúm IVACFLU-A/H7N9 thành phẩm (WHO, Technical Report Series 927, 2005; Bộ Y tế, 2009) 33 Bảng 2.1 Sơ đồ miễn dịch nghiên cứu tính sinh miễn dịch 48 Bảng 3.1 Kết trung bình EID50/ml, Hiệu giá HA, Hàm lượng HA tỉ lệ trứng sống sau gây nhiễm theo độ pha loãng chủng vi rút gây nhiễm 51 Bảng 3.2 Kết trung bình EID50/ml, Hiệu giá HA, Hàm lượng HA theo nhiệt độ thời gian nuôi cấy vi rút 53 Bảng 3.3 EID50 RIV theo thông số bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 55 Bảng 3.4 Kết sản xuất lô kháng nguyên cúm A/H7N9 thô 58 Bảng 3.5 Hiệu suất thu hồi kháng nguyên HA giai đoạn tinh chế 59 Bảng 3.6 Kết bất hoạt vi rút cúm formalin 0,02%, nhiệt độ 20-24 oC, thời gian 24 .59 Bảng 3.7 Kết sản xuất lô kháng nguyên cúm A/H7N9 nước cốt cô đặc 60 Bảng 3.8 Kết lô vắc xin thành phẩm 61 Bảng 3.9 Kết thử an toàn đặc hiệu vắc xin cúm IVACFLU-A/H7N9 62 Bảng 3.10 Trọng lượng chuột thử nghiệm an toàn chung 63 Bảng 3.11 Kết thử chất gây sốt thỏ 64 Bảng 3.12 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân với liều kháng ngun 3µgHA/chuột, .64 Bảng 3.13 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân với liều kháng nguyên 1,5µgHA/chuột .64 Bảng 3.14 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân với liều kháng nguyên 0,75µgHA/chuột 65 Bảng 3.15 Tỷ số hiệu giá kháng thể trung bình nhân so với máu (M0) 66 x 24h, ủ 34,5˚C± 0,5 24h, ủ 35,5˚C ±0,5 24h, ủ 36,5˚C±0,5 48h, ủ 34,5˚C±0,5 48h, ủ 35,5˚C±0,5 48h, ủ 36,5˚C±0,5 72h, ủ 34,5˚C±0,5 72h, ủ 35,5˚C±0,5 72h, ủ 36,5˚C±0,5 96h, ủ 34,5˚C±0,5 96h, ủ 35,5˚C±0,5 96h, ủ 36,5˚C±0,5 LÔ NC/06 MẪU THỬ LOG EID50 A1.1 3.2 A1.2 5.04 A1.3 2.98 B1.1 5.92 B1.2 7.95 B1.3 5.09 C1.1 8.13 C1.2 8.82 C1.3 7.92 D1.1 8.06 D1.2 8.54 D1.3 7.28 HIỆU GIÁ HA 160 320 160 320 640 320 640 640 640 640 640 640 HÀM LƯỢNG