NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT – THỬ NGHIỆM VẮC XIN ĐẬU GÀ TRÊN TẾ BÀO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT – THỬ NGHIỆM VẮC XIN ĐẬU GÀ TRÊN TẾ BÀO Sinh viên thưc : PHẠM THỊ ANH ĐÀO Lớp : TC03TYTP Mã số sinh viên : 03212029 Niên khóa : 2003-2009 Tp Hồ Chí Minh , năm 2009 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT – THỬ NGHIỆM VẮC XIN ĐẬU GÀ TRÊN TẾ BÀO Tác giả PHẠM THỊ ANH ĐÀO Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn: Th.S TRẦN THỊ BÍCH LIÊN Th.S KIM VĂN PHÚC Tháng 04 năm 2009 i LỜI CẢM ƠN Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến công ơn sinh thành dưỡng dục Ba Mẹ yêu thương nuôi dạy thành người Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:  Th.s Trần Thị Bích Liên  Th.s Kim Văn Phúc  BSTY Nguyễn Thị Lam Hương  Chị Bùi Anh Thy  Tập thể Cô Chú, Anh Chị làm việc Trung Tâm Nghiên Cứu phân xưởng Siêu Vi Trùng thuộc Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ương Đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn động viên truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em suốt q trình thực hồn tất khóa luận tốt nghiệp  Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM  Ban Chủ Nhiệm tồn thể q Thầy Cơ khoa Chăn Ni – Thú Y trường Đại học Nơng Lâm Tp.HCM tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho em trình học tập trường  Cảm ơn bạn bè toàn thể lớp TCTYTP-03 chung sức giúp đỡ tơi suốt q trình học tập ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Nghiên cứu sản xuất – thử nghiệm vắc xin Đậu gà tế bào” thực mơn Hóa Sinh thuộc Trung Tâm Nghiên Cứu trại chăn nuôi Công Ty Thuốc Thú y Trung Ương Thời gian thực từ ngày 15/04/2008 đến ngày 15/04/2009 Trong trình nghiên cứu, tiến hành tiêu theo dõi sau: - Thu nhận nuôi cấy tế bào xơ phôi gà sử dụng để tiếp đời chuẩn độ virus - Khảo sát tính ổn định chủng virus đậu gà thích ứng tế bào xơ phôi gà để sản xuất vắc xin - Kiểm tra vơ trùng, an tồn, hiệu lực thời gian bảo quản vắc xin sản xuất thử nghiệm Kết nghiên cứu: - Virus đậu gà nhược độc chủng Weybridge thích ứng tế bào tiếp tục truyền đời tế bào xơ phôi gà cho thấy có phát triển tốt ổn định qua thời gian xuất biểu bệnh tích tế bào đến 48 – 96 sau gây nhiễm virus đậu gà, đủ điều kiện thu hoạch hiệu giá virus từ 106,7 TCID50/ml - 107,3 TCID50/ml đủ điều kiện để sản xuất vắc xin - Vắc xin sản xuất thử nghiệm tế bào chế từ huyễn dịch virus thu lần tiếp đời thứ 14 chứa lượng virus tối thiểu cho liều 103,0 TCID50 đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm vơ trùng, an tồn, hiệu lực theo tiêu chuẩn Việt Nam (10 TCN 196 – 94), có tính an tồn cao có khả tạo miễn dịch tốt cho gà để phòng bệnh đậu cho gà - Vắc xin đơng khơ có thời gian bảo quản tối thiểu 12 tháng – 80C - Vắc xin thử nghiệm thực địa cho 4290 gà ri gà tre sau chủng không thấy biểu bất thường có phản ứng tốt với vắc xin, đạt tiêu chuẩn an toàn phòng bệnh đậu cho gà điều kiện chăn ni thơng thường ngồi thực địa iii MỤC LỤC Trang Trang tựa……………………………………………………………………………… i Lời cảm ơn…………………………………………………………………………… ii Tóm tắt luận văn………………………………………………………………………iii Mục lục……………………………………………………………………………… iv Danh mục từ viết tắt…………………………………………………………… vii Danh sách bảng………………………………………………………………… viii Danh sách hình………………………………………………………………… ix Danh sách sơ đồ - biểu đồ……………………………………………… .x Chương MỞ ĐẦU……………………………………………………………… 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………… 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU…………………………………………………… 1.2.1 Mục đích……………………………………………………………………… 1.2.2 Yêu cầu……………………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………… 2.1 VIRUS ĐẬU – BỆNH ĐẬU TRÊN GÀ……………………………………… 2.1.1 Virus đậu……………………………………………………………………… 2.1.2 Virus đậu gà…………………………………………………………………… 2.1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc virus đậu gà 2.1.2.2 Sự nhân lên virus đậu gà 2.1.2.3 Sức đề kháng virus đậu gà .5 2.1.2.4 Miễn dịch 2.1.3 Bệnh đậu gà .5 2.1.3.1 Cơ chế sinh bệnh đậu gà 2.1.3.2 Triệu chứng bệnh đậu gà 2.1.3.3 Bệnh tích bệnh đậu gà 2.1.3.4 Tính chất dịch tể học 2.1.3.5 Chẩn đoán bệnh đậu gà 2.1.3.6 Phòng bệnh đậu gà 11 2.2 KHÁI QUÁT VỀ CÁC LOẠI VẮC XIN ĐẬU GÀ 12 iv 2.2.1 Vắc xin vô hoạt 12 2.2.2 Vắc xin nhược độc 12 2.2.3 Vắc xin tái tổ hợp 12 2.3 SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ .13 2.3.1 Nguồn gốc nguyên bào sợi 13 2.3.2 Đặc điểm nguyên bào sợi 13 2.3.3 Vai trò nguyên bào sợi 14 2.3.4 Thu nhận nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 14 Chương NỘI DUNG – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .16 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 16 3.1.1 Thời gian 16 3.1.2 Địa điểm 16 3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 16 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 16 3.3.1 Vật liệu thí nghiệm 16 3.3.2 Dụng cụ thiết bị 17 3.3.3 Mơi trường - hóa chất 17 3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 19 3.4.1 Thu nhận nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 20 3.4.2 Khảo sát tính ổn định chủng virus đậu gà thích ứng tế bào xơ phơi gà để sản xuất vắc xin 21 3.4.2.1 Gây nhiễm virus lên tế bào .21 3.4.2.2 Tiếp đời virus tế bào .22 3.4.2.3 Chuẩn độ xác định hiệu giá virus 22 3.4.2.4 Sản xuất thử nghiệm vắc xin đậu gà tế bào .23 3.4.3 Kiểm tra vô trùng, an toàn, hiệu lực vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm 24 3.4.3.1 Lấy mẫu 24 3.4.3.2 Kiểm tra vô trùng 25 3.4.3.3 Kiểm tra an toàn hiệu lực vắc xin đậu gà thử nghiệm tế bào cho gà 25 v 3.4.4 Xác định thời gian bảo quản vắc xin đậu gà tế bào thử nghiệm 28 3.4.5 Thử nghiệm miễn dịch vắc xin đậu gà tế bào hộ chăn ni gia đình thực địa 28 3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ 29 4.2 KẾT QUẢ KIỂM TRA TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA CHỦNG VIRUS ĐẬU GÀ ĐÃ ĐƯỢC THÍCH ỨNG TRÊN TẾ BÀO XƠ PHƠI GÀ 30 4.2.1 Kết gây nhiễm truyền đời virus đậu gà tế bào xơ phôi gà 30 4.2.2 Kết chuẩn độ xác định hiệu giá virus tế bào 32 4.2.3 Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin đậu gà tế bào 33 4.3 KẾT QUẢ KIỂM TRA VÔ TRÙNG, AN TOÀN, HIỆU LỰC CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ THỬ NGHIỆM 33 4.3.1 Kết kiểm tra vô trùng 33 4.3.2 Kết chuẩn độ virus chứa vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm 34 4.3.3 Kết kiểm tra an toàn hiệu lực vắc xin sản xuất cho gà 35 4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ TẾ BÀO THỬ NGHIỆM 40 4.5 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ TẾ BÀO TRÊN HỘ CHĂN NI GIA ĐÌNH Ở THỰC ĐỊA .42 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 KẾT LUẬN 44 5.2 ĐỀ NGHỊ 44 PHỤ LỤC 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN (Acid Deoxyribonucleic): gen AND AGID (Agar Gel Immunodiffusion): Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch thạch CAM (Chorioallantoic Membrane): Màng nhung niệu CEF (Chicken Embryo Fibroblast): Tế bào xơ phơi gà CPE (Cytopathic Effect): Bệnh tích tế bào EID50 (Embryo Infective Dose): Liều gây nhiễm 50% phôi trứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym MEM (Minimum Essential Medium): Môi trường tăng trưởng NCS (Newborn Calf Serum): huyết bê PBSA (Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)): Muối đệm phosphate TCID50 (Tissue Culture Infective Dose): liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi VN (Virus Neutralisation) : Kỹ thuật trung hòa virus vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Phân loại giống thuộc họ Chordopoxvirinae……………………3 Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực vắc xin đậu gà thử nghiệm 26 Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm xác định hiệu miễn dịch cho gà chủng vắc xin 27 Bảng 4.1: Tỷ lệ thời gian xuất bệnh tích tế bào lần tiếp đời 30 Bảng 4.2: Kết chuẩn độ xác định hiệu giá virus tế bào mẫu ký hiệu từ P13 đến P15………………………………………………………… 32 Bảng 4.3: Kết chuẩn độ virus vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm sau đông khô……… 34 Bảng 4.4: Kết thí nghiệm xác định hiệu lực vắc xin đậu gà thử nghiệm ……… 35 Bảng 4.5: Kết xác định hiệu miễn dịch cho gà chủng vắc xin………… 38 Bảng 4.6: Kết theo dõi thời gian bảo quản vắc xin đậu gà tế bào – 80C 42 Bảng 4.7: Kết thử vắc xin đậu gà tế bào thực địa……………………… 43 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Hình thái virus đậu gà…………………………………………………… Hình 2.2: Gà mắc bệnh đậu thể da………………………………………………… Hình 2.3: Gà mắc bệnh đậu thể yết hầu (thể màng giả)…………………………… Hình 2.4: Hình nguyên bào sợi……………………………………………………… 16 Hình 4.1: Tế bào xơ phơi gà sau 24 ni cấy…………………………………… 29 Hình 4.2: Tế bào xơ phôi gà sau 48 nuôi cấy…………………………………… 30 Hình 4.3: Bệnh tích tế bào xơ phơi gà sau gây nhiễm virus đậu gà…………… 31 Hình 4.4: Tế bào xơ phơi gà đối chứng……………………………………………….31 Hình 4.5: Gà chủng vắc xin đậu gà NAVETCO (Gà đối chứng dương)… 36 Hình 4.6: Gà chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm……………………………… 37 Hình 4.7: Gà chủng dung dịch sinh lý ………………………………………….37 Hình 4.8: Gà đối chứng nốt đậu cơng thử thách…………………………… 39 Hình 4.9: Gà chủng vắc xin đậu gà NAVETCO cơng thử thách…………… 40 Hình 4.10: Gà chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm công thử thách…………… 40 ix 4.2.3 Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin đậu gà tế bào Từ kết thu qua bảng 4.1, 4.2 sau lần tiếp đời virus đậu gà tế bào xơ phôi gà chúng tơi chọn mẫu tế bào nhiễm virus có hiệu giá cao (107,3 TCID50/ml) để làm vắc xin thử nghiệm dạng đông khô Vắc xin thử nghiệm sản xuất từ huyễn dịch tế bào pha với chất bổ trợ sữa không kem với nồng độ cuối 8% Sau pha chế, hỗn dịch virus sữa không kem chia lọ vắc xin (1ml/ lọ) đưa đơng khơ theo quy trình đông khô vắc xin đậu gà sản xuất từ phôi trứng NAVETCO Quy trình chuẩn bị thực sau Theo tiêu chuẩn quốc tế vắc xin đậu gà sản xuất từ tế bào, lượng virus tối thiểu cho liều vắc xin 103,0 TCID50/ml Để đảm bảo lượng virus tối thiểu cho liều vắc xin sau đơng khơ trước đơng khô cần 104,0 TCID50/ml Dự kiến lọ vắc xin có 100 liều, cần: 100 x 104,0 = 106,0 TCID50/ml/ lọ Hiệu giá virus 107,3TCID50/ml Ta có tỷ lệ pha loãng với chất bổ trợ: 107,3 / 106,0 = 101,3 = 20 lần Như vậy: ml tế bào nhiễm virus đậu gà + 19 ml sữa không kem Tổng lượng huyễn dịch tế bào nhiễm virus đậu gà sử dụng sản xuất thử 14ml 22,4 g sữa không kem để nồng độ cuối sữa khơng kem đạt 8% Sau q trình pha chế, lọ, đơng khơ đóng nắp nhơm, nhận 254 lọ vắc xin dạng đông khô Các lọ vắc xin thu có dạng bánh xốp, màu trắng ngà Vắc xin sau đông khô bảo quản – 8OC để tiếp tục thực kiểm tra khác 4.3 KẾT QUẢ KIỂM TRA VÔ TRÙNG, AN TOÀN, HIỆU LỰC CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ THỬ NGHIỆM 4.3.1 Kết kiểm tra vô trùng Sản phẩm vắc xin đánh giá tốt tiêu cảm quan, vắc xin phải đạt tiêu khác theo tiêu chuẩn như: tính vơ trùng, tính an tồn, tính hiệu lực… 33 Chúng tơi tiến hành quy trình kiểm nghiệm vắc xin đậu gà sản xuất tế bào theo tiêu chuẩn 10 TCN 196-94 Bộ nông nghiệp công nghiệp thực phẩm (ban hành năm 1992) Quy trình kiểm nghiệm vắc xin đậu gà Sau cho huyễn dịch vắc xin vào ống môi trường thử vô trùng, đem ủ 37oC, riêng thạch nấm để nhiệt độ phòng 25 – 300C theo dõi thời gian ngày Kết cho thấy tồn mơi trường cấy sau ngày khơng có loại vi sinh vật mọc môi trường cấy Như vắc xin sản xuất thử nghiệm đạt tiêu chuẩn vô trùng theo tiêu chuẩn Việt Nam 4.3.2 Kết chuẩn độ virus chứa vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm Sau sản xuất thử nghiệm vắc xin đậu gà tế bào xơ phôi gà, tiếp tục làm chuẩn độ virus chứa vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm để kiểm tra hiệu giá virus chai vắc xin đậu gà Chúng tơi tiến hành pha lỗng lọ vắc xin sản xuất thử nghiệm với ml dung dịch sinh lý cho lọ vắc xin Kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết chuẩn độ virus vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm sau đơng khơ Hiệu giá virus Nồng độ pha lỗng có CPE Giếng TCID50/ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 + + + - - + + + - - + + + - - + + + - - 105,5 Từ kết thu nhận trình bày bảng trên, chúng tơi thấy vắc xin sản xuất thử nghiệm đạt tiêu chuẩn quy định cho vắc xin đậu gà đông khô Hiệu giá virus 105,5 TCID50/ml Theo tiêu chuẩn quốc tế vắc xin đậu gà sản xuất từ tế bào, lượng virus tối thiểu cho liều vắc xin 103,0 TCID50/ml Như lọ vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm sau đông khô chứa 316 liều/lọ 34 4.3.3 Kết kiểm tra an toàn hiệu lực vắc xin sản xuất cho gà Vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm tế bào sau đông khô đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm chúng tơi tiến hành kiểm tra an tồn hiệu lực cách dùng kim chủng đâm xuyên qua cánh gà 18 ngày tuổi vị trí khơng có mạch máu Đánh giá kết qua biểu nốt đậu vị trí chủng đậu sau chủng từ ngày thứ trở Kết thu nhận trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết thí nghiệm xác định hiệu lực vắc xin đậu gà thử nghiệm Lơ thí Số Huyễn dịch chủng cho Vị trí Gà có nốt đậu rõ Tỷ lệ bảo hộ nghiệm gà gà chủng vị trí chủng/số gà (%) I 10 Da cánh 10/10 100 II 10 Vắc xin đậu gà tế bào lô Vắc xin đậu gà tế bào lô 10/10 Da cánh 100 Vắc xin đậu gà III 10 NAVETCO (Đối chứng dương) IV 10/10 Da cánh Dung dịch sinh lý 10 (Đối chứng âm) 100 0/10 Da cánh 100 100 100 80 Tỷ lệ (%) 60 40 20 100 I Vắc xin đậu gà tế bào lô II Vắc xin đậu gà tế bào lô III Vắc xin đậu gà NAVETCO IV Dung dịch sinh lý Lơ thí nghiệm Biểu đồ 4.1: Biểu đồ xác định hiệu lực vắc xin sau chủng Từ kết nhận thấy vắc xin đậu gà thử nghiệm tế bào lơ lơ có hiệu lực theo tiêu chuẩn 10 TCN 196-94 gà có xuất nốt đậu vị trí 35 chủng (100%), tương đương với vắc xin đậu gà NAVETCO làm đối chứng so sánh Các nốt đậu biểu rõ ngày thứ - 6, sau lặn dần hoàn toàn ngày thứ 10 – 14, 100% gà đối chứng xuất nốt đậu sau chủng dung dịch sinh lý Sau chủng vắc xin đậu gà, quan sát thấy gà khơng có biểu bất thường, điều chứng tỏ vắc xin đậu gà an toàn gà chủng vắc xin đạt hiệu lực theo tiêu chuẩn Việt Nam Như vậy, virus đậu gà thích ứng tế bào có nguồn gốc từ chủng Weybridge sử dụng làm vắc xin NAVETCO giữ tính kháng nguyên qua biểu tạo nốt đậu vị trí chủng vắc xin sản xuất từ phơi trứng Hình 4.5: Gà chủng vắc xin đậu gà NAVETCO (Gà đối chứng dương) 36 Hình 4.6: Gà chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm Hình 4.7: Gà chủng dung dịch sinh lý Sau chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm, tiến hành kiểm tra khả gây đáp ứng miễn dịch cho gà với phương pháp công thử thách gà chủng mẫu virus vắc xin đậu gà NAVETCO chủng virus đậu gà phân lập Trong thử nghiệm này, nhổ lông đùi gà, làm trầy xước nhẹ bôi huyễn dịch vắc xin thử nghiệm Kết ghi nhận trình bày bảng 4.5 biểu đồ 4.2 37 Bảng 4.5: Kết xác định hiệu miễn dịch cho gà chủng vắc xin Lơ thí nghiệm/ loại gà chủng I Số gà Vị trí nốt đậu bảo thách cho gà cơng vị trí cơng hộ thử thách (%) Đùi 0/5 100 Đùi 1/5 80 Đùi 0/5 100 Đùi 1/5 80 Đùi 0/5 100 Đùi 1/5 80 Đùi 4/5 20 Đùi 5/5 NAVETCO (Gà chủng vắc xin đậu gà tế bào Chủng virus đậu gà lô 1) II phân lập Vắc xin đậu gà NAVETCO (Gà chủng vắc xin đậu gà tế bào Chủng virus đậu gà lô 2) III (Gà chủng vắc xin phân lập Vắc xin đậu gà NAVETCO đậu gà Chủng virus đậu gà NAVETCO) IV phân lập Vắc xin đậu gà NAVETCO (Gà chủng dung dịch sinh lý) Chủng virus đậu gà 100 phân lập 100 100 80 100 Vắc xin đậu gà NAVETCO 80 80 80 Chủng virus đậu gà phân lập 60 Tỷ lệ (%) Tỷ lệ Mẫu virus công thử Vắc xin đậu gà Số gà xuất 40 20 20 0 I II III IV Lơ thí nghiệm Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ bảo hộ vắc xin sau công thử thách 38 Qua kết kiểm tra nốt đậu sau công thử thách nhận thấy vắc xin sản xuất tế bào thử nghiệm có khả tạo miễn dịch chống lại bệnh đậu gà (100%) tương đương vắc xin đậu gà NAVETCO sản xuất phôi trứng, gà lơ đối chứng (chủng dung dịch sinh lý) xuất nốt đậu vị trí cơng da đùi gà Đối với chủng virus đậu gà phân lập sau công thử thách, tỷ lệ bảo hộ đạt 80% chủng virus đậu gà phân lập chưa hồn tồn chủng thức để sử dụng cho công thử thách gà chủng phân lập khảo sát thử nên khả bảo hộ gà chưa cao nên gà có biểu nốt đậu vị trí cơng Sau cơng thử thách, chúng tơi quan sát theo dõi thấy gà khơng có biểu bất thường, điều chứng tỏ vắc xin đậu gà sản xuất tế bào an toàn có khả tạo miễn dịch gà cơng thử thách Hình 4.8: Gà đối chứng nốt đậu cơng thử thách 39 Hình 4.9: Gà chủng vắc xin đậu gà NAVETCO công thử thách Hình 4.10: Gà chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm công thử thách 4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ TẾ BÀO THỬ NGHIỆM Dựa vào kết theo dõi thời gian bảo quản vắc xin thử nghiệm tế bào lơ – 80C Bộ mơn Hóa Sinh – Trung Tâm Nghiên Cứu cung cấp, tiếp tục theo dõi thời gian bảo quản vắc xin thử nghiệm lô lô 40 Vắc xin thử nghiệm tế bào sau đông khô bảo quản – 80C hoàn nguyên lọ ngẫu nhiên (với ml dung dịch PBS pH 7,2 cho lọ vắc xin) chuẩn độ xác định hiệu giá virus kết hợp với thử hiệu lực gà theo thời điểm Kết ghi nhận bảng 4.6 Bảng 4.6: Kết theo dõi thời gian bảo quản vắc xin đậu gà tế bào – 80C Hiệu giá Thời gian Hiệu giá Kết công thử thách Lô vắc virus trước sau đông virus Hiệu lực Bằng vắc Bằng xin đông khô khô TCID50/ml gà xin chủng NAVETCO phân lập 0/5* kl 1/8* 2/8* 0/5* 1/5* 0/5* 1/5* (tháng) (160707) 10 6,0 TCID50/ml 105,3 kl 105,5 10/10 105,3 kl 10 105,0 16/20 12 105,0 kl 13 105,0 kl 14 104,7 9/10 15 104,5 kl 17 104,3 kl 20 104,3 kl 105,5 09/10 106,0 105,5 kl (280808) TCID50/ml 105,0 kl 105,3 kl 105,0 kl * Số gà xuất nốt đậu/ số gà công Qua kết nhận thấy virus sau q trình đơng khơ giảm hiệu giá từ 0,5 – 0,7 log10 Sau thời gian bảo quản – 80C, hiệu giá virus qua tháng đầu chưa có thay đổi, đến thời điểm 13 tháng lô tháng lô hiệu giá virus 105,0 TCID50/lọ tương đương với 100 liều vắc xin Như vậy, hiệu giá virus lô 41 giảm dần theo thời gian bảo quản, kết luận vắc xin đậu gà tế bào thử nghiệm sau đơng khơ có thời gian bảo quản tối thiểu 12 tháng 4.5 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ TẾ BÀO TRÊN HỘ CHĂN NI GIA ĐÌNH Ở THỰC ĐỊA Chúng tiến hành chủng vắc xin đậu gà tế bào thử nghiệm lô sau đông khô - tháng hộ chăn ni gia đình tỉnh Tiền Giang với gà ri thịt gà tre – tuần tuổi, lọ vắc xin chủng cho 100 gà vào da cánh nhằm theo dõi tính an tồn vắc xin qua họat động linh hoạt lại, ăn, uống…,đến tuần sau chủng, kiểm tra đại diện xuất nốt đậu vị trí chủng sau – ngày Kết tổng hợp bảng 4.7 Bảng 4.7: Kết thử vắc xin đậu gà tế bào thực địa STT Hộ chăn nuôi Nguyễn Thị Thành Xã Tân Bình Thạnh, Chợ Gạo Đồn Đình Khải Xã Lương Hòa Lạc, Chợ Gạo Trần Văn Nhàn Xã Lương Hòa Lạc, Chợ Gạo Số lượng Kết an Kết hiệu /loại gà toàn lực 1370/ Gà Đạt, khơng có ri thịt biểu bất xuất nốt thường đậu 1400/ Gà Đạt, khơng có 26/30(87%) gà biểu bất xuất nốt thường đậu 680/ Gà Đạt, khơng có 19/20 (85%) gà ri thịt biểu bất xuất nốt thường đậu 270/ Gà Đạt, khơng có 34/40 (85%) gà tre biểu bất xuất nốt thường đậu 600/ Gà Đạt, khơng có 21/25 (84%) gà tre biểu bất xuất nốt thường đậu ri thịt Nguyễn Văn Trên Xã Long Điền, Chợ Gạo 27/30 (90%) gà Qua kết cho thấy 4290 gà ri gà tre sau chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm theo dõi không thấy xuất biểu bất thường Kiểm tra 42 xuất nốt đậu đại diện đàn gà cho thấy 127/145 (87%) gà có phản ứng tốt với vắc xin, nốt đậu xuất rõ – ngày sau chủng Gà sau chủng vắc xin theo dõi tiếp -5 tháng, số gà xuất chuồng, số giữ lại làm giống khơng có biểu bất thường hay xuất bệnh đậu gà toàn đàn gà chủng vắc xin Qua tiêu theo dõi ghi nhận từ thử nghiệm, vắc xin đậu gà tế bào đánh giá an tồn phòng bệnh đậu cho gà điều kiện chăn ni thơng thường ngồi thực địa 43 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua q trình nghiên cứu, chúng tơi thu kết sau: - Virus đậu gà nhược độc chủng Weybridge thích ứng tốt tế bào xơ phơi gà giữ tính kháng nguyên Từ đời thứ 13 đến đời thứ 15, sau gây nhiễm virus đậu gà, thu hoạch tế bào có 75% tế bào có biểu bệnh tích có hiệu giá tương đối ổn định từ 107,0 TCID50/ml - 107,3 TCID50/ml, sử dụng làm vắc xin để phòng bệnh đậu gà - Vắc xin sản xuất thử nghiệm tế bào chế từ huyễn dịch virus thu lần tiếp đời thứ 14 chứa lượng virus tối thiểu cho liều 103,0 TCID50 đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm 10 TCN 196-94, có tính an tồn cao có khả tạo miễn dịch tốt cho gà để phòng bệnh đậu gà theo tiêu chuẩn Việt Nam - Vắc xin đơng khơ có thời gian bảo quản tối thiểu 12 tháng – 80C 5.2 ĐỀ NGHỊ Để đảm bảo vắc xin đậu gà sản xuất từ tế bào hoàn chỉnh theo quy định chúng tơi nhận thấy số vấn đề cần thực như: - Chuẩn hóa áp dụng phương pháp huyết học để đánh giá mức độ kháng thể hình thành sau chủng vắc xin - Tiếp tục sản xuất thử nghiệm vắc xin tế bào với quy mô lớn 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam Bộ Nông Nghiệp phát triển nông thôn – Viện Thú Y Quốc Gia, 2002, trang 160 Friedrich Barwinek, Bùi Quang Anh Cẩm nang thú y viên NXB Thanh Niên, 2002, trang 75 Nguyễn Như Thanh, Phùng Quốc Chương Phương pháp thực hành vi sinh vật thú y NXB Nơng Nghiệp (2006) Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vắc xin dùng thú y Nhà xuất Nơng nghiệp,1994 Trần Thị Bích Liên, Lê Anh Phụng Virus thú y chuyên biệt Tủ sách trường ĐH Nông Lâm (2001), trang 78 Trần Thanh Phong Bệnh truyền nhiễm virus gà Tủ sách trường ĐH Nông Lâm (1996), trang 121 - 126 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Fowlpox (chapter 2.03.10), Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th edition 2004 (www.oie.int) Peter Saville/ Fowlpox/ South Pacific Commission, BP D5, 98848 Noumea Cedex, New Caledonia R M Buller and G J Palumbo, Poxvirus Pathogenesis Microbiological Reviews, Mar 1991, p 88-122 TÀI LIỆU INTERNET 10 http://www.compasnac.com/intervet.htm 11 http://www.wikipedia\Fibroblast - Wikipedia, the free encyclopedia.htm 12 http://www.wikipedia\Fowlpox - Wikipedia, the free encyclopedia.htm 13 http://www.intervet.com 14 http://www.pasteur-hcm.org.vn/gdsk/gaymiendich.htm 15 http://ncbi.pub med\Taxonomy browser (Poxviridae).htm 16 http://www.vi.wikipedia.org/wiki/Vắc-xin PHỤ LỤC TÍNH HIỆU GIÁ VIRUS THEO REED AND MUENCH (1938) Theo dõi đọc kết 120 sau nhiễm virus, kết thiết lập bảng đây: Số giếng Số giếng Nồng độ có biểu khơng có pha lỗng CPE biểu Giá trị tích lũy Có CPE Khơng có Tỷ lệ (%) CPE CPE 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Giá trị tích lũy tính cách cộng trực tiếp giá trị từ thấp đến giá trị cao Muốn tính hiệu giá virus TCID50, trước tiên ta phải tính khoảng tỷ lệ theo cơng thức sau: Tỷ lệ % có CPE 50% - 50% Khoảng tỷ lệ = Tỷ lệ % có CPE 50% - Tỷ lệ % có CPE 50% Hiệu giá TCID50: - log TCID50 = [ -log (nồng độ gây nhiễm CPE 50%) + khoảng tỷ lệ] → TCID50/ ml Tính hiệu giá TCID50 mẫu vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm tế bào dựa vào kết bảng 4.3 Số giếng Số giếng Nồng độ có biểu khơng có pha lỗng CPE biểu Giá trị tích lũy Có CPE Khơng có Tỷ lệ (%) CPE CPE 10-2 12 12/12 100 10-3 8/8 100 10-4 4 4/4 100 10-5 4 0/4 10-6 0/8 100% - 50% 50% Khoảng tỷ lệ = = = 0,5 100% - 0% 100% Hiệu giá TCID50 đạt được: - log TCID50 = ( - log 10-4 + 0,5 ) → TCID50 = 104,5/ 0,1 ml = 105,5/ ml Các mẫu lại tính tương tự ... hiệu lực vắc xin đậu gà thử nghiệm tế bào cho gà 25 v 3.4.4 Xác định thời gian bảo quản vắc xin đậu gà tế bào thử nghiệm 28 3.4.5 Thử nghiệm miễn dịch vắc xin đậu gà tế bào hộ... hiệu lực vắc xin đậu gà thử nghiệm tế bào cho gà 19 Xác định thời gian bảo quản vắc xin đậu gà tế bào thử nghiệm 3.4.1.Thu nhận nuôi cấy tế bào xơ phơi gà Theo quy trình tạo tế bào xơ phơi gà từ... virus chứa vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm 34 4.3.3 Kết kiểm tra an toàn hiệu lực vắc xin sản xuất cho gà 35 4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ TẾ BÀO THỬ NGHIỆM