Nghiên cứu sự sinh trưởng cây lan gấm cấy mô (anoectochilus formosanus hayata) ở điều kiện ngoài vườn ươm tại đà lạt – lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ HOÀN ANH NGHIÊN CỨU SỰ SINH TRƯỞNG CÂY LAN GẤM CẤY MÔ (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA) Ở ĐIỀU KIỆN NGOÀI VƯỜN ƯƠM TẠI ĐÀ LẠT – LÂM ĐỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ HOÀN ANH NGHIÊN CỨU SỰ SINH TRƯỞNG CÂY LAN GẤM CẤY MƠ (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA) Ở ĐIỀU KIỆN NGỒI VƯỜN ƯƠM TẠI ĐÀ LẠT – LÂM ĐỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 8420201 Mã học viên: 58CH256 Quyết định giao đề tài: 562/QĐ-ĐHNT ngày 9/5/2018 Quyết định thành lập hội đồng: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN XUÂN HUYÊN PGS.TS TRANG SĨ TRUNG Chủ tịch Hội Đồng: Phòng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HÒA – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu sinh trưởng lan gấm cấy mô (Anoectochilus formosanus Hayata) điều kiện vườn ươm Đà Lạt – Lâm Đồng” cơng trình nghiên cứu tơi Kết nghiên cứu phần nhỏ đề tài “Nghiên cứu nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) thương phẩm kỹ thuật thủy canh Đà Lạt – Lâm Đồng” TS Phan Xuân Huyên làm chủ nhiệm đề tài Những kết số liệu luận văn chưa công bố hình thức Đề tài nghiên cứu thực phịng Cơng nghệ thực vật – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Ngun Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Khánh Hòa, tháng năm 2019 Tác giả Trần Thị Hồn Anh iii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Phan Xuân Huyên Thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt thời gian thực đề tài truyền đạt cho kiến thức bổ ích Sẽ khơng có thành cơng hơm không nhận hướng dẫn giúp đỡ Thầy PGS.TS Trang Sĩ Trung Trong suốt thời gian làm luận văn, Thầy tạo điều kiện cho học tập làm việc, động viên, khích lệ truyền đạt cho tơi kiến thức cần thiết Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, tạo điều kiện cho thực tập làm luận văn Cảm ơn Ban Giám Hiệu, Khoa sau đại học – Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cán phịng Cơng nghệ thực vật – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên; Bạn Anh, Chị hỗ trợ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực luận văn Xin gửi lời cảm ơn đến tất anh chị em học tập, thực tập với Những người bạn giúp đỡ đồng hành suốt chặng đường vừa qua Được học tập, làm việc trải nghiệm bạn cho tơi thấy sống cịn điều tốt đẹp Chúc người may mắn thành đạt tương lai Và lời cuối, từ sâu thẳm đáy lòng, xin dành lời cảm ơn chân thành tới gia đình ủng hộ, giúp đỡ chăm sóc suốt thời gian học Khánh Hòa, tháng năm 2019 Tác giả Trần Thị Hoàn Anh iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lan gấm 1.2 Nguồn gốc phân bố 1.3 Đặc điểm hình thái 1.4 Đặc điểm sinh thái 1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển lan gấm 1.6 Trồng lan gấm 1.7 Giá trị lan gấm 1.8 Các loài lan gấm Việt Nam 1.9 Tình hình nghiên cứu lan gấm giới .9 1.10 Tình hình nghiên cứu lan gấm nước 11 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .13 2.1 Địa điểm thởi gian tiến hành nghiên cứu đề tài .13 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Vật liệu 13 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu .13 2.3 Xử lý số liệu 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .22 3.1 Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến thích nghi lan gấm cấy mơ chuyển vườn ươm 22 v 3.2 Khảo sát ảnh hưởng phân bón đến sinh trưởng phát triển lan gấm .23 3.3 Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng phát triển lan gấm 25 3.4 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp trồng đến sinh trưởng phát triển lan gấm 27 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thuốc phòng trừ bệnh đến sinh trưởng phát triển lan gấm 28 3.6 Phân tích định lượng hợp chất kinsenonside lan gấm 31 3.7 Q trình trồng chăm sóc lan gấm cấy mô từ trồng đến hoa 32 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 4.1 Kết luận 34 4.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-benzyladenine IBA : Indol butyric acid MS : Môi trường Murashige Skoog, 1962 NAA : Naphtaleneacetic acid PLB : Protocorm like body TDZ : Thidiazuron WPM : Môi trường Woody Plant Medium vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hưởng giá thể đến thích nghi lan gấm cấy mơ chuyển ngồi vườn ươm sau tháng nuôi trồng 17 Bảng 2.2 Ảnh hưởng loại phân bón đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 17 Bảng 2.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 18 Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp trồng đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 19 Bảng 2.5 Ảnh hưởng thuốc phòng trừ bệnh đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 19 Bảng 2.6 Phân tích định lượng hợp chất kinsenonside lan gấm sau tháng nuôi trồng .20 Bảng 3.1 Ảnh hưởng giá thể đến thích nghi lan gấm cấy mơ chuyển ngồi vườn ươm sau tháng nuôi trồng 23 Bảng 3.2 Ảnh hưởng loại phân bón đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 24 Bảng 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 26 Bảng 3.4 Ảnh hưởng phương pháp trồng đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 27 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thuốc phòng trừ bệnh đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 30 Bảng 3.6 Phân tích định lượng hợp chất kinsenonside lan gấm sau tháng nuôi trồng .32 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Anoectochilus formosanus Hayata Hình 1.2 Hình thái lan gấm Hình 2.1 Lồi lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata 13 Hình 2.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 16 Hình 3.1 Ảnh hưởng giá thể đến thích nghi lan gấm cấy mơ chuyển ngồi vườn ươm sau tháng nuôi trồng 23 Hình 3.2 Ảnh hưởng loại phân bón đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 24 Hình 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 26 Hình 3.4 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp trồng đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng .27 Hình 3.5 Ảnh hưởng thuốc phòng trừ bệnh đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng 30 Hình 3.6 Phân tích định lượng hợp chất kinsenonside lan gấm sau tháng nuôi trồng .32 Hình 3.7 Ni trồng nhân tạo lồi lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata 33 Hình 3.8 Ni trồng nhân tạo lồi lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata 33 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Cây lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) loại thảo dược quí có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam nhiều người chưa biết đến lan gấm, giới, y học cổ truyền ngàn năm nghiên cứu y học đại ghi nhận lan gấm vua loài thảo dược, tác dụng dược lý đa dạng bảo vệ gan, phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh, chống oxy hóa tăng cường miễn dịch (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2000, Du et al., 2000; Du et al., 2001; Wang et al., 2002; Du et al., 2008; Hai et al., 2010; Ma et al., 2010; Hsiao et al., 2011; Zhang et al., 2013) Chính giá trị mà lan gấm tự nhiên bị thu hái cách triệt để, dẫn đến nguồn lan gấm ngày giảm dần có nguy tuyệt chủng (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006; Sách đỏ Việt Nam – Phần thực vật, 2007) Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu bảo tồn phát triển lan gấm tạo nguồn nguyên liệu phục vụ lĩnh vực y học, mỹ phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe vấn đề cần thiết Ở nước ta có số cơng bố nhân giống in vitro số loài lan gấm có giá trị dược liệu Đối với lồi Anoectochilus formosanus nước ta chưa thấy công bố nghiên cứu nhân giống ni trồng Do đó, tiến hành nghiên cứu sinh trưởng phát triển lan gấm cấy mơ lồi Anoectochilus formosanus điền kiện vườn ươm Đà Lạt – Lâm Đồng Trong nghiên cứu này, lan gấm nuôi cấy mơ lan gấm thích nghi điều kiện vườn ươm (2 tháng tuổi) đồng chiều cao, chiều dài rễ, phát triển tốt sử dụng làm vật liệu nghiên cứu Ảnh hưởng giá thể, phân bón lá, phương pháp trồng, thuốc phịng trừ bệnh đến thích nghi sinh trưởng, tích lũy hợp chất kinsenonside lan gấm cấy mơ chuyển ngồi vườn ươm theo dõi sinh trưởng lan gấm cấy mô từ trồng đến hoa tiến hành khảo sát x Bảng 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng Chiều cao Chiều dài Khối lượng Tỉ lệ (cm) rễ (cm) tươi/cây (g) sống (%) b* 14,87 8,11ª 2,72b 100 Giá thể 100% vụn xơ dừa Hỗn hợp 80% vụn xơ dừa 20% tro trấu+ 20% phân dê Hỗn hợp 80% vụn xơ dừa 20% tro trấu + 20% phân bò Hỗn hợp 80% vụn xơ dừa 20% tro trấu + 20% đất mùn 16,14a 8,21ª 2,85a 100 16,22a 8,25ª 2,89a 100 14,71b 7,74a 2,74b 100 Chú thích: *Những chữ khác (a, b, c) cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Hình 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng a, a1; b, b1; c, c1; d, d1: Cây trồng giá thể vụn xơ dừa; giá thể vụn xơ dừa bổ sung phân dê; giá thể vụn xơ dừa bổ sung phân bò; giá thể vụn xơ dừa bổ sung đất mùn Hiện giới nước có cơng bố nghiên cứu ni trồng lan gấm giá thể khác nhau, Ket (2003) sử dụng giá thể than bùn xơ dừa, rêu than bùn, xơ dừa phối trộn với đá trân châu theo tỉ lệ 3:1 tỉ lệ 1:1 ni trồng lồi Anoectochilus formosanus Chang et al., 2007 ni trồng lồi Anoectochilus formosanus giá thể lên men vỏ với phân trộn Phan Xuân Huyên et al., 2016, 2018 nghiên cứu ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus lylei sử dụng giá thể vụn xơ dừa, kết cho thấy, sinh trưởng phát triển tốt hoa sau 14 tháng nuôi trồng 26 Như vậy, ni trồng lan gấm giá thể vụn xơ dừa (80%) tro trấu (20%) phối trộn phân dê phân bị theo tỉ lệ 4:1 thích hợp đến sinh trưởng phát triển loài lan gấm Anoectochilus formosanus 3.4 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp trồng đến sinh trưởng phát triển lan gấm Ngoài yếu tố phân bón, giá thể phương pháp trồng quan trọng góp phần thúc đẩy sinh trưởng phát triển Mỗi loại thích hợp phương pháp trồng, việc tìm phương pháp trồng phù hợp để tăng giá trị loại trồng cần thiết Trong thí nghiệm này, lan gấm thích nghi điều kiện vườn ươm trồng giá thể vụn xơ dừa bổ sung phân dê, phương pháp trồng bố trí thí nghiệm, phun phân hữu sinh học JIA6 (2 ml/l) theo định kỳ tuần lần phun thuốc phòng trừ sâu bệnh theo định kỳ tháng lần Khả sinh trưởng phát triển sau tháng nuôi trồng chăm sóc thể Bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng phương pháp trồng đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng Chiều cao Chiều dài rễ Khối lượng Tỉ lệ sống (cm) (cm) tươi/cây (g) (%) a a Trồng chậu nhựa 16,20 8,23ª 2,90 100 a a Trồng thùng xốp 16,18 8,19ª 2,88 100 Trồng khay nhựa 16,15a 8,21ª 2,91a 100 Chú thích: *Những chữ khác (a, b, c) cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Phương pháp trồng Hình 3.4 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp trồng đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng a, a1; b, b1; c, c1 Cây trồng chậu nhựa; trồng thùng xốp; trồng khay nhựa 27 Kết cho thấy, trồng khay nhựa, chậu nhựa thùng xốp sinh trưởng phát triển tốt có tỉ lệ sống 100% Theo xử lý thống kê thi sinh trưởng phát triển trồng theo phương pháp khơng có khác biệt, chiều cao từ 16,15 – 16,20 cm, chiều dài rễ từ 8,19 – 8,23 cm khối lượng tươi từ 2,88 – 2,91 g/cây Qua cho thấy, khay nhựa, chậu nhựa thùng xốp phù hợp để trồng lan gấm cấy mô điều kiện ngồi vườn ươm, kết ứng dụng trồng lan gấm làm phong phú phương pháp trồng Việc nghiên cứu phương pháp trồng dược liệu nói chung lan gấm nói riêng nhà nghiên cứu quan tâm nhằm làm phong phú phương pháp trồng, tăng suất, phẩm chất giá trị trồng Đặc điểm hình thái cho thấy, thân mọc thẳng, có màu xanh đậm gân có màu trắng, gần gốc khơng bị rụng, rễ có nhiều lơng hút, phần thân mọc nhiều rễ khí sinh ( Hình 3.4) Chang et al., 2007 ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus formosanus theo phương pháp đặt chậu lan gấm túi nylon, kết sau tháng nuôi trồng cho thấy, nuôi trồng theo phương pháp túi nylon có chiều cao 8,1 cm, khối lượng tươi 1,8 g/cây, đó, ni trồng theo phương pháp truyền thống chiều cao đạt 6,3 cm, khối lượng tươi 1,6 g/cây Cheng Chang (2009) thực nghiên cứu ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus formosanus độ cao 1.000 m so với mực nước biển, sau tháng nuôi trồng, khối lượng tươi từ – g/cây, chiều cao từ – cm Bên cạnh đó, Shiau et al., 2002 nghiên cứu ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus formosanus buồng sinh trưởng, Gangaprasad et al., 2000 nghiên cứu ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus regalis mơi trường rừng tự nhiên Kết nghiên cứu tương đông với kết nghiên cứu Phan Xuân Huyên et al., 2018 công bố gần đầy nghiên cứu ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus lylei khay nhựa, chậu nhựa thùng xốp, kết cho thấy, khay nhựa, thùng xốp chậu nhựa phù hợp nuôi trồng lan gấm Như vậy, khay nhựa, chậu nhựa thùng xốp thích hợp để ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus formosanus 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thuốc phòng trừ bệnh đến sinh trưởng phát triển lan gấm Trong trồng trọt nói chung ni trồng lan gấm nói riêng, phịng trừ sâu bệnh yếu tố quan trọng định đến suất phẩm chất 28 trồng Do đó, việc nghiên cứu tìm loại thuốc bảo vệ thực vật để phòng ngừa sâu bệnh cần thiết Trong thí nghiệm này, lan gấm thích nghi điều kiện ngồi vườn ươm trồng giá thể vụn xơ dừa bổ sung phân dê, sử dụng phương pháp trồng chậu Phun thuốc phòng trừ sâu bệnh theo định ký tháng lần bố trí thí nghiệm Phun phân hữu sinh học JIA6 (2 ml/l) theo định kỳ tuần lần Khả phòng trừ sâu bệnh sinh trưởng phát triển lan gấm cấy mô sau tháng ni trồng chăm sóc thể Bảng 3.5 Kết cho thấy, lan gấm phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC kết hợp thuốc trừ bệnh sinh học Ditacin 8SL phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC kết hợp Nano chitosan khơng bị sâu bệnh sinh trưởng phát triển tốt, với chiều cao 16,11 – 16,14 cm, chiều dài rễ 8,10 – 8,15 cm, khối lượng 2,87 – 2,89 g/cây tỉ lệ sống đạt 100%, khơng phun thuốc phịng trừ sâu bệnh sinh trưởng phát triển hơn, với chiều cao 13,76 cm, chiều dài rễ 7,31 cm, khối lượng 2,45 g/cây, tỉ lệ sống đạt 57,14% bị sâu bệnh hại như: bị thối thân, sâu giai đoạn non (chiều dài khoảng 0,5 – cm) hút nhựa làm cho bị khô, sâu lớn khơng hút nhựa mà chuyển sang cắn phá hai ngày cắn đứt chậu lan gấm Trong trồng trọt, nuôi trồng loại rau ăn ngắn ngày giàn khoảng tháng thu hoạch khơng sử dụng thuốc phòng trừ sâu bệnh, những loại trồng khác nói chung lan gấm nói riêng ni trồng thời gian dài cần phải sửa dụng thuốc bảo vệ thực vật để phịng trừ sâu bệnh, khơng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để phịng trừ sâu bệnh dễ bị sâu bệnh công, dẫn đến sinh trưởng phát triển cho suất thấp Hiện nay, trồng trọt áp dụng nhiều phương pháp để phòng trừ sâu bệnh như: sử dụng bẩy, thiên địch, vi sinh vật đối kháng, thuốc sinh học, thuốc hóa học Nguyễn Ngọc Bảo Châu et al., 2016 nghiên cứu khảo sát hiệu lực phòng trừ sinh học sâu tơ hại rau ăn từ dịch chiết thô ngũ sắc Bùi Quang Tiệp et al., 2016 nghiên cứu phòng trừ sâu đo ăn keo tai tượng phịng thí nghiệm sử dụng thuốc hóa học vi khuẩn, nấm để phòng trừ sâu Kết nghiên cứu tương đồng với kết Phan Xuân Huyên et al., 2016 nghiên cứu nhân giống ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus lylei sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, kết 29 sinh trưởng phát triển tốt Kết phù hợp với kết khác Phan Xuân Huyên et al., 2017, 2018 nghiên cứu nhân giống ni trồng lồi Anoectochilus formosanus sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, kết sinh trưởng phát triển tốt Như vậy, để phòng trừ sâu bệnh lan gấm phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC kết hợp thuốc trừ bệnh sinh học Ditacin 8SL phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC kết hợp Nano chitosan Bảng 3.5 Ảnh hưởng thuốc phòng trừ bệnh đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng Phương pháp trồng Chiều cao Chiều dài Khối lượng Tỉ lệ (cm) rễ (cm) tươi/cây (g) sống (%) Khơng phun thuốc phịng trừ 13,76b 7,31b 2,45b 57,14 sâu bệnh Thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC + Thuốc trừ 16,14a 8,10ª 2,89a 100 bệnh sinh học Ditacin 8SL Thuốc trừ sâu sinh học Amectin 16,11a 8,15ª 2,87a 100 aic 36 EC + Nano chitosan Chú thích: *Những chữ khác (a, b, c) cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Hình 3.5 Ảnh hưởng thuốc phòng trừ bệnh đến sinh trưởng phát triển lan gấm sau tháng nuôi trồng a b Cây không phun thuốc sâu bệnh; c Cây phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC + thuốc trừ bệnh sinh học Ditacin 8SL; d Cây phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC + nano chitosan 30 3.6 Phân tích định lượng hợp chất kinsenonside lan gấm Trong thí nghiệm này, lan gấm thích nghi điều kiện vườn ươm trồng giá thể vụn xơ dừa bổ sung phân dê, sử dụng phương pháp trồng chậu Phun thuốc phòng trừ sâu bệnh theo định ký tháng lần phun phân hữu sinh học JIA6 (2 ml/l) theo định kỳ tuần lần Sau tháng nuôi trồng tiến hành phân tích định lượng hợp chất kinsenoside lan gấm trồng Đà Lạt – Lâm Đồng trồng Buôn Đôn – Đắk Lắk Hàm lượng kinsenoside lan gấm thể Bảng 3.6 Kết cho thấy, lan gấm trồng Đà Lạt – Lâm Đồng trồng Buôn Đôn – Đắk Lắk có hoạt chất kinsenoside, nhiên trồng Bn Đơn – Đắk Lắk có hợp chất kinsenoside (5,98%) cao trồng Đà Lạt – Lâm Đồng (5,80%) Điều giải thích, điều kiện tự nhiên khu vực Buôn Đôn – Đắk Lắk tác động nên hàm lượng kinsenoside lan gấm cao trồng Đà Lạt – Lâm Đồng Kết phân tích nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Du et al., 2008 nghiên cứu phân tích hoạt chất kinsenoside cụm chồi in vitro, in vitro ex vitro loài Anoectochilus formosanus, kết cho thấy, tất loại mẫu nuôi cấy in vitro ex vitro có hoạt chất kinsenoside Một nghiên cứu khác Du et al., 2008 nghiên cứu định lượng hợp chất kinsenoside loài Anoectochilus formosanus, kết thu hàm lượng kinsenoside đạt 18% Kết phân tích định lượng hợp chất kinsenoside nghiên cứu thấp kết phân tích Chao et al., 2017 nghiên cứu hàm lượng hoạt kinsenoside loài lan gấm, kết thu được, hàm lượng kinsenoside nằm khoảng từ 6,37% đến 22,66% hàm lượng trung bình 15% Và kết phân tích định lượng hợp chất kinsenoside nghiên cứu thấp kết phân tích định lượng hợp chất lan gấm Phan Xuân Hun et al., 2018 nghiên cứu ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus lylei loài lan gấm Anoectochilus roxburghii địa bàn tỉnh Đắk Lắk, kết cho thấy, hàm lượng kinsenoside loài Anoectochilus lylei dao động từ 5,89% đến 12,33% hàm lượng kinsenoside loài Anoectochilus roxburghii dao động từ 5,09% đến 8,17% Như vậy, lan gấm cấy mơ lồi Anoectochilus formosanus ni trồng nhân tạo điều kiện ngồi vườn ươm có hoạt chất kinsenoside 31 Bảng 3.6 Phân tích định lượng hợp chất kinsenonside lan gấm sau tháng ni trồng Hàm lượng kinsenoside (% theo Lồi lan gấm khối lượng khô) Anoectochilus formosanus 5,80 (lan gấm trồng Đà Lạt – Lâm Đồng) Anoectochilus formosanus 5,98 (lan gấm trồng Bn Đơn – Đắk Lắk) Hình 3.6 Phân tích định lượng hợp chất kinsenonside lan gấm sau tháng nuôi trồng a Cây trồng Đà Lạt – Lâm Đồng; b Cây trồng Buôn Đôn – Đắk Lắk 3.7 Q trình trồng chăm sóc lan gấm cấy mô từ trồng đến hoa Những lan gấm thích nghi điều kiện vườn ươm trồng giá thể vụn xơ dừa bổ sung phân dê, sử dụng phương pháp trồng chậu Phun thuốc phòng trừ sâu bệnh theo định kỳ tháng lần phun phân hữu sinh học JIA6 (2 ml/l) theo định kỳ tuần lần Sau 18 tháng nuôi trồng chăm sóc kết cho thấy, sinh trưởng phát triển tốt, giai đoạn tháng tuổi chưa hoa, giai đoạn 18 tháng tất hoa Cành hoa mang – 10 hoa Kết tương đồng với kết nghiên cứu Ket (2003) nghiên cứu nuôi trồng loài Anoectochilus formosanus, kết cho thấy, hoa sau 18 tháng ni trồng 32 Hình 3.7 Ni trồng nhân tạo loài lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata a Cây tháng tuổi b Cây 18 tháng tuổi Hình 3.8 Ni trồng nhân tạo lồi lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata a b Hoa lan gấm; c d Cây tái sinh từ mẹ – tháng tuổi nụ (kí hiệu chấm xanh) Trong nuôi trồng lan gấm cho thấy thêm đặc điểm, cấy mô sau 18 tháng nuôi trồng có khả hoa, tái sinh từ mẹ – tháng tuổi hoa Điều cho thấy, tái sinh từ cấy mô 18 tháng tuổi tương đồng với lan gấm mọc tự nhiên, vào đầu mùa mưa (tháng 4, tháng 5) độ ẩm tăng lên, tái sinh từ mẹ, sinh trưởng phát triển hoa vào cuối mùa hè đầu mùa thu (Phan Xuân Huyên et al., 2018) Như vậy, lan gấm cấy mô lồi Anoectochilus formosanus ni trồng nhân tạo điều kiện vườn ươm, sinh trưởng phát triển tốt tất hoa sau 18 tháng nuôi trồng 33 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Giá thể 80% vụn xơ dừa phối trộn 20% tro trấu thích hợp để chuyển lan gấm cấy mô vườn ươm - Phun phân hữu sinh học JIA6 (2 ml/l) theo định kỳ tuần lần phù hợp đến sinh trưởng lan gấm - Trong ni trồng lan gấm giá thể vụn xơ dừa (80%) tro trấu (20%) phối trộn phân dê phân bò theo tỉ lệ 4:1 thích hợp đến sinh trưởng phát triển lồi lan gấm Anoectochilus formosanus - Khay nhựa, chậu nhựa thùng xốp thích hợp để ni trồng lồi lan gấm Anoectochilus formosanus - Để phòng trừ sâu bệnh lan gấm phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC kết hợp thuốc trừ bệnh sinh học Ditacin 8SL phun thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC kết hợp Nano chitosan - Cây lan gấm cấy mơ lồi Anoectochilus formosanus ni trồng nhân tạo điều kiện ngồi vườn ươm có hoạt chất kinsenoside - Cây lan gấm cấy mơ lồi Anoectochilus formosanus ni trồng nhân tạo điều kiện vườn ươm, sinh trưởng phát triển tốt tất hoa sau 18 tháng ni trồng 4.2 Đề nghị - Phân tích hợp chất kinsenoside sau 12 tháng 18 tháng nuôi trồng - Ứng dụng nuôi trồng lan gấm qui mô lớn để tạo nguồn nguyên liệu dược lan gấm phục vụ lĩnh vực y học, thực phẩm mỹ phẩm - Nghiên cứu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ lan gấm (trà dược liệu túi lọc lan gấm, viên nang lan gấm, nước uống lan gấm) 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tiếng Việt Bộ Khoa học Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam – Phần thực vật NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Ngọc Bảo Châu, Đặng Thanh Nghĩa, Nguyễn Minh Hoàng Nguyễn Bảo Quốc (2016), Khảo sát hiệu lực phòng trừ sinh học sâu tơ (Plutella xylostella L.) hại rau ăn từ dịch chiết thô ngũ sắc (Lantana camara L.) Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ, 46b, tr 54-60 Đỗ Mạnh Cường, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Thanh Sang, Nguyễn Hồng Hoàng, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Xuân Tuấn, Trần Hiếu, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Thị Kim Loan Dương Tấn Nhựt (2015), Ảnh hưởng số yếu tố lên trình sinh trưởng phát triển lan gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ni cấy in vitro Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(3), tr 337-344 Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2006) Nghị định số 32/2006/NĐ-CP Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, III, NXB TP Hồ Chí Minh Phan Xuân Huyên Vũ Thị Hà (2015), Nghiên cứu tái sinh chồi sinh trưởng Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) điều kiện in vitro ex vitro Hội nghị Khoa học kỷ niệm 40 năm (1975-2015) thành lập Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 96-98 Phan Xuân Huyên, Nguyễn Văn Kết, Phan Hoàng Đại Nguyễn Thị Cúc (2016), Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies) điều kiện ex vitro Tạp chí Khoa học Đại học Đà Lạt, 6(4), tr 481-492 Phan Xuân Huyên, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Phùng Quang Vinh Vũ Thị Hà (2016), Nghiên cứu nhân giống nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies) Tạp chí Khoa học trường Đại học Tây Nguyên, 20, tr 68-74 10 Phan Xuân Huyên Nguyễn Thị Phượng Hoàng (2017), Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(3), tr 515-524 35 11 Phan Xuân Huyên, Trần Thị Hoàn Anh, Nguyễn Thị Phượng Hoàng, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Đinh Văn Khiêm Hoàng Văn Cương (2018), Nghiên cứu nhân giống in vitro ảnh hưởng phân bón đến sinh trưởng lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) Lâm Đồng Tạp chí Dược liệu, 23(1), tr 52-59 12 Phan Xuân Huyên, Phạm Thị Thanh Hải, Nguyễn Văn Duy, Phan Minh Hiển, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Nguyễn Thị Phượng Hồng Đinh Văn Khiêm (2018), Nghiên cứu ni trồng xác định hoạt chất kinsenoside loài lan gấm Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie phân bố Đắk Lắk Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2018, tr 1532-1538 13 Phan Xuân Huyên, Nguyễn Văn Kết, Hoàng Văn Cương, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Nguyễn Thanh Lâm, Trần Văn Tiến, Nguyễn Thị Cúc, Phan Hoàng Đại, Phùng Quang Vinh Vũ Thị Hà (2018), Ứng dụng công nghệ sinh học nhân giống lan gấm (Anoectochilus sp.) địa bàn tỉnh Đắk Lắk Báo cáo kết đề tài khoa học công nghệ cấp tỉnh Đắk Lắk 14 Phan Xuân Bình Minh, Phạm Hương Sơn, Trần Minh Hợi Nguyễn Thị Vân (2015), Nghiên cứu nhân giống nhằm bảo tồn lan sứa (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies) Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ sáu, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, tr 695-699 15 Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm Nguyễn Trung Thành (2010), Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 26, tr 248-253 16 Trương Thị Bích Phượng Phan Ngọc Khoa (2013), Nhân giống in vitro lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl) Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 79(1), tr 41-46 17 Sách đỏ Việt Nam – Phần thực vật (2007), NXB Khoa học Kỹ thuật 18 Bùi Quang Tiếp, Nguyễn Minh Chí, Nguyễn Mạnh Hà Lê Văn Bình (2016), Nghiên cứu phòng trừ sâu đo (Biston suppressaria) ăn keo tai tượng phịng thí nghiệm Tạp chí KHLN 3, tr 4547-4553 19 Nguyễn Quang Thạch Phí Thị Cẩm Miện (2012), Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quí Tạp chí Khoa học Phát triển, 10(4), tr 579-603 36 20 Trần Thị Hồng Thúy, Đỗ Thị Gấm, Nguyễn Khắc Hưng, Phạm Bích Ngọc Chu Hoàng Hà (2015), Nghiên cứu nhân nhanh in vitro lồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thơng qua cảm ứng tạo protocorm like bodies Tạp chí Sinh học, 37(1), tr 67-83 * Tiếng Anh 22 Chang DCL, Chou LC and Lee GC (2007), New cultivation methods for Anoectochilus formosanus Hayata Orchid Sci Biotechnol, 1(2), pp 56-60 23 Chao Z, Jian-guo W, Jun Y, Jin-zhong W, Cheng-jian Z and Yan-bin W (2017), Content determination of kinsenoside in Jin-Xian-Lian from three Anoectochilus species by HPLC-ELSD Sci Technol Food Industry, 65 (44), pp 9685-9692 24 Cheng SF and Chang DCN (2009), Growth responses and changes of active components as influenced by elevations and orchid mycorrhizae on Anoectochilus formosanus Hayata Botanical Studies, 50, pp 459-466 25 Chow HT, Hsieh WC and Chang CS (1982), In vitro propagation of Anoectochilus formosanus J Sci Eng, 19, pp 155-166 26 Du XM, Sun NY, Irino N and Shoyama Y (2000), Glycosidic constituents from in vitro Anoectochilus formosanus Hayata Chem Pharm Bull, 48(11), pp 1803-1804 27 Du XM, Sun NY, Tamura T, Mohri A, Sugiura M, Yoshizawa T, Irino N, Hayashi J and Shoyama Y (2001), Higher yielding isolation of Kinsenoside in Anoectochilus and its anti-hyerliposis effect Biol Pharm Bull, 24, pp 65-69 28 Du XM, Irino N, Uto T, Morinaga O and Shoyama Y (2008), Micropropagation of Anoectochilus formosanus Hayata in vitro and pharmacological and chemical investigations Phytochemistry, 9, pp 79-87 29 Duncan DB (1955), Multiple range and F tests Biometrics, 11, pp 1-42 30 Gangaprasad A, Latha PG and Seeni S (2000), Micropropagation of terrestrial orchids, Anoectochilus sikkimensis and Anoectochilus regalis Indian J Exp biol, 38(2), pp 149-154 31 Ho CK, Chang SH and Chen ZZ (1987), Tissue culture and acclimatization in Anoectochilus formosanus Hayata Bull Taiwan For Res Inst, 2, pp 83-105 32 Hai HG, Cho LH and Jun XC (2010), Content measurement of microelements in cultivated Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl in Wenshan of Yunnan Province Med Plant, 1(5), pp 39-41 37 33 Hsiao HB, Wu JB, Lin H and Lin WC (2011), Kinsenoside isolated from Anoectochilus formosanus suppresses LPS-stimulated inflammatory reactions in macrophages and endotoxin shock in mice Shock, 35(2),pp 184-190 34 Nguyen V.K (2003), Effect of Environmental Conditions on In vitro and Ex vitro Growth of Jewel Orchid (Anoectochilus formosanus Hayata) Physolophy of Doctor in Agricuture, The Graduate School of Chungbuk National University, Korea 35 Ma Z, Li S, Zhang M (2010), Light Intensity Affects Growth, Photosynthetic Capability, and Total Flavonoid Accumulation of Anoectochilus Plants Hort Sci, 45(6), pp 863-867 36 Pandey DM, Yu KW, Wu RZ, Hahn EJ and Paek KY (2006), Effects of different irradiances on the photosynthetic process during ex vitro acclimation of Anoectochilus plantlets Photosynthetica, 44(3), pp 419-424 37 Shiau YJ, Sagare AP, Chen UC, Yang SR and Tsay HS (2002), Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata by artificial cross-pollination and in vitro culture of seeds Bot Bull Acad Sin, 43, pp 123-130 38 Tai KS (1987), In vitro propagation of Anoectochilus formosanus (Hayata) J Agric Asso China, 137, pp 42-54 39 Wang SY, Kuo YH, Chang HN, Kang PL, Tsay HS, Lin KF, Yang NS and Shyur LF (2002), Profiling and characterization antioxidant activities in Anoectochilus formosanus Hayata J Agric Food Chem, 50, pp 1859-1865 40 Wu RZ, Baque MA and Paek KY (2010), Establishment of a large-scale micropropagation system for Anoectochilus formosanus in bioreactors Acta Hort, 878, pp 167-173 41 Yoon YJ, Murthy HN, Hahn EJ and Paek KY (2007), Biomass production of Anoectochilus formosanus Hayata in a bioreactor system J Plant Biol, 50(5), pp 573-576 42 Zhang FS, Ly YL, Zhao Y and Guo SX (2013), Promoting role of an endophyte on the growth and contents of kinsenosides and flavonoids of Anoectochilus formosanus Hayata, a rare and threatened medicinal orchidaceae plant J Zhejiang University Sci B, 14 (9), pp 785-792 * Tiếng Trung 43 Yuqiong G., Meixiu Y Weibin Z (2014), Anoectochilus roxburghii black tea, CN Patent 103976053A 44 Yuqiong G., Weibin Z Meixiu Y (2014), Anoectochilus roxburghii – Ganoderma lucidum tea, CN Patent 103947787A 38 PHỤ LỤC Môi trường MS (Murashige Skoog 1962) Khoáng đa lượng Hàm lượng (mg/l) KNO3 1900 NH4NO3 1650 CaCl2.H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Khoáng vi lượng Hàm lượng (mg/l) MnSO4 4H2O 22,3 H3BO3 6,2 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA.2H2O 37,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.7H2O 8,6 Vitamin Hàm lượng (mg/l) Myo-inositol 100 Nicotinic Acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 0,1 - Giá thể vụn xơ dừa – ECo N1 để nuôi trồng lan gấm (N: 0,15%; P2O5: 0,06%; K2O: 0,07%; CaO: 2.200 mg/kg; Acid humic: 0,41%; EC: 1,2 – 1,6 mS/cm; pH: – 6,6; độ ẩm: 50±5%) - Phân bón qua Nitrophoska® Foliar (N: 25%; P2O5: 10%; K2O: 17,5%; Fe: 0,050%; Zn: 0,019%; Mn: 0,050%; B: 0,011%; Cu: 0,019%; Mo: 0,001%) - Phân hữu sinh học JIA6 (2 g/l) Thành phần: Hữu cơ: 48%; N: 0,34%; P2O5: 0,07%; K2O: 3,3%; MgO: 0,75%; Mn: 1,96%; Cu: ppm; Fe: 20 ppm; Zn: ppm; pH: – - Thuốc trừ sâu sinh học Amectin aic 36 EC: hỗn hợp Avermectin B1a (80%) Avermectin B1b (20%) phân lập từ trình lên men vi khuẩn Streptomycin avermitilis - Kasuran 47WP: Kasugamycin 2%, copper oxychloride 45% - Nano chitosan 250 nm, hàm lượng 20.000 ppm (2%) môi trường nước sạch: ml - Thuốc trừ bệnh sinh học Ditacin 8SL (thành phần: Ningramycin 8%): loại kháng sinh mới, Streptomyces noursei var xichangensis lên men tạo thành, hỗn hợp 17 acid amin, số vitamin thiết yếu cho thể sinh vật số nguyên tố vi lượng ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ HOÀN ANH NGHIÊN CỨU SỰ SINH TRƯỞNG CÂY LAN GẤM CẤY MÔ (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA) Ở ĐIỀU KIỆN NGOÀI VƯỜN ƯƠM TẠI ĐÀ LẠT – LÂM ĐỒNG LUẬN... Hội Đồng: Phịng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HỊA – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài ? ?Nghiên cứu sinh trưởng lan gấm cấy mô (Anoectochilus formosanus Hayata) điều kiện vườn ươm Đà Lạt – Lâm. .. Lồi lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata a Cây lan gấm cấy mô; b Cây lan gấm cấy mơ thích nghi điều kiện ngồi vườn ươm 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1 Kỹ thuật nuôi in vitro lan gấm a