Tuyển chọn chủng vi nấm biển sinh enzyme amylase phân lập từ vịnh nha trang và vịnh vân phong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH THỊ SỞ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI NẤM BIỂN SINH ENZYME AMYLASE PHÂN LẬP TỪ VỊNH NHA TRANG VÀ VỊNH VÂN PHONG LUẬN VĂN THẠC SĨ H NH HÕA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH THỊ SỞ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI NẤM BIỂN SINH ENZYME AMYLASE PHÂN LẬP TỪ VỊNH NHA TRANG VÀ VỊNH VÂN PHONG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 80420201 Mã học viên 58CH263 Quyết định giao đề tài: 321/QĐ- ĐHNT ngày 27/3/2018 Quyết định thành lập hội đồng: 1140/QĐ-ĐHNT ngày 10/9/2019 Ngày bảo vệ: 26/9/2019 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY TS PHẠM THU THỦY CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TS NGƠ THỊ HỒI DƢƠNG Phịng Đào tạo Sau Đại học H NH HÕA - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Tuyển chọn chủng vi nấm biển sinh enzyme amylase phân lập từ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong” công trình nghiên cứu cá nhân tơi chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Kết phần đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hoà dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) TS Phạm Thu Thuỷ chủ nhiệm đề tài Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn đƣợc cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn xác đƣợc rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày 06 tháng năm 2019 Tác giả luận văn Đinh Thị Sở iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận đƣợc giúp đỡ quý thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng, quý thầy cô thuộc Khoa Sau đại học, Trƣờng Đại học Nha Trang tạo điều kiện tốt cho tơi đƣợc hồn thành đề tài Đặc biệt hƣớng dẫn tận tình PGS.TS Nguyễn Văn Duy TS Phạm Thu Thủy giúp tơi hồn thành tốt đề tài Qua xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ Tôi xin ghi nhớ công ơn tất Quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng, Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành công việc nghiên cứu thực đề tài Xin chân thành cảm ơn bạn học viên Cao học lớp CHSH16-1 Trƣờng Đại học Nha Trang thành viên đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hòa dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy” (mã số106-NN.02-2016.70) TS Phạm Thu Thủy chủ nhiệm nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình tiến hành thực nghiệm Xin gửi lời cảm ơn đến Quý Ban giám hiệu đồng nghiệp Trƣờng THPT Lộc Thanh, Bảo Lộc, Lâm Đồng nơi công tác tạo điều kiện ủng hộ vƣợt qua khó khăn q trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, anh chị, … yêu thƣơng, động viên ủng hộ tơi vƣợt qua khó khăn q trình học tập thực luận văn Khánh Hòa, ngày 06 tháng năm 2019 Tác giả luận văn Đinh Thị Sở iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC KÍ HIỆU ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH MỤC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH xii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xiv MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi nấm 1.1.1 Vị trí phân loại vi nấm 1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo tế bào vi nấm 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo tế bào nấm men 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo tế bào nấm mốc 1.1.3 Dinh dƣỡng sinh sản vi nấm 1.1.3.1 Dinh dƣỡng sinh sản nấm men .7 1.1.3.2 Dinh dƣỡng sinh sản nấm mốc .8 1.1.4 Khả sinh hoạt chất sinh học vi nấm biển 1.1.4.1 Hoạt tính sinh enzyme thủy phân ngoại bào 1.1.4.2 Khả sinh chất kháng sinh, kháng khuẩn 10 1.1.4.3 Khả sinh acid hữu chất kích thích sinh trƣởng 10 1.2 Khái quát enzyme amylase 10 1.2.1 Giới thiệu chung enzyme amylase .10 1.2.2 Phân loại enzyme amylase 11 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme amylase 13 v 1.2.4 Cơ chế cảm ứng sinh enzyme amylase 15 1.2.5 Các phƣơng pháp đánh giá hoạt tính enzyme amylase .17 1.2.6 Nguồn thu nhận enzyme amylase .17 1.2.6.1 Enzyme amylase từ thực vật động vật 17 1.2.6.2 Enzyme amylase từ vi sinh vật 17 1.2.7 Các ứng dụng enzyme amyalse .19 1.3 Tình hình nghiên cứu enzyme amylase từ vi nấm biển 21 1.3.1 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển giới 21 1.3.2 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển Việt Nam 22 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng, thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.1.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu .23 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu .23 2.2 Nguyên vật liệu 23 2.2.1 Các chủng vi nấm biển 23 2.2.2 Môi trƣờng nuôi vi nấm 26 2.2.3 Hóa chất .28 2.2.4 Dụng cụ thiết bị chuyên dụng 30 2.3 Bố trí thí nghiệm .30 2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu 30 2.3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện mơi trƣờng ni cấy thích hợp sinh tổng hợp enzyme amylase chủng nấm mốc nghiên cứu 32 2.3.2.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy 32 2.3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi 32 2.3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy 33 2.3.2.4 Khảo sát nguồn cacbon 34 2.3.2.5 Khảo sát nguồn nitơ 35 vi 2.3.2.6 Khảo sát nồng độ nacl thích hợp sinh tổng hợp enzyme amylase 37 2.3.2.7 Khảo sát nồng độ nano3 thích hợp sinh tổng hợp enzyme amylase 38 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2.4.1 Nuôi cấy vi nấm 39 2.4.2 Bảo quản chủng vi nấm 39 2.4.3 Khảo sát sơ hoạt tính enzyme emylase phƣơng pháp đo đƣờng kính vịng phân giải 40 2.4.4 Xác định hoạt độ enzyme amylase phƣơng pháp sử dụng thuốc thử DNS (axit dinitrosalicylic) .41 2.4.5 Quan sát hình thái tế bào nấm mốc .44 2.4.6 Tách chiết DNA tổng số nấm mốc kit Ez – 10 spin column plant genomic DNA miniprep kit (BioBasic) 44 2.4.7 Khuếch đại đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 kỹ thuật PCR .45 2.4.8 Kỹ thuật điện di DNA gel agarose .46 2.4.9 Giải phân tích trình tự gen 46 2.4.10 Xử lý số liệu 47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Sàng lọc hoạt tính enzyme amylase ngoại bào chủng vi nấm biển 48 3.2 Xác định hoạt độ enzyme amylase chủng nấm biển nghiên cứu .50 3.3 Khảo sát điều kiện môi trƣờng nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp enzyme amylase chủng nấm mốc nghiên cứu 52 3.3.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy chủng DM12M, DW7M TB8M .52 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme amylase chủng DM12M, DW7M vàT B8M 53 3.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh enzyme amylase chủng DM12M 54 3.3.4 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh enzyme amylase chủng DM12M 55 vii 3.3.5 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh enzyme amylase chủng DM12M 56 3.3.6 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NaCl môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh enzyme amylase DM12M .58 3.3.7 Khảo sát nồng độ NaNO3 môi trƣờng nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme amylase DM12M 59 3.4 So sánh hoạt độ enzyme amylase thu đƣợc từ chủng DM12M với hoạt độ amylase thƣơng mại .60 3.5 Định danh chủng nấm mốc DM12M 62 3.5.1 Kết quan sát hình thái khuẩn lạc tế bào 62 3.5.2 Định danh chủng DM12M giải trình tự gen .63 3.5.2.1 Kết PCR khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5,8S – ITS2 63 3.5.2.2 Trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 chủng nấm mốc DM12M .64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .66 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .68 PHỤ LỤC I viii DANH MỤC í hiệu g g/ml g/l l ml Viết đầy đủ Gam Gam/mililít Gam/lít Lít Mililít mM Milimol nm Nanomét U/ml Đơn vị/mililít w/v Khối lƣợng/thể tích ix Í HIỆU DANH MỤC C C CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ Ghi Thuốc thử dùng cho xác định DNS 3,5 - dinitrosalicylic acid MT Môi trƣờng PDA Potato Dextrose Agar YPD Yeast Extract Peptone Dextrose hoạt độ enzyme amylase Môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc x Môi trƣờng nuôi cấy nấm men định đƣợc 261 chủng có khả sinh amylase (chiếm 63,81%) [8] Các tác giả bƣớc đầu xác định đƣợc 10 chủng có hoạt tính amylase cao thơng qua phƣơng pháp sử dụng thuốc thử DNS (axit dinitrosalicylic) khảo sát điều kiện, môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu cho sản sinh α-amylase glucoamylase hai chủng tốt Đ10 Đ56 Nhƣ vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme amylase từ vi nấm biển có tiềm ứng dụng lớn, nhƣng nghiên cứu theo hƣớng Việt Nam hạn chế Mục tiêu nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng vi nấm biển có khả sinh amylase từ nƣớc biển ven bờ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong, nghiên cứu điều kiện mơi trƣờng ni cấy thích hợp để thu nhận enzyme amylase có hoạt độ cao VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU Chủng vi nấm biển Tổng số 160 chủng vi nấm biển đƣợc phân lập từ vùng biển ven bờ 11 vị trí thuộc Vịnh Vân Phong Vịnh Nha Trang khoảng thời gian từ tháng – 8, năm 2018 Các chủng đƣợc cung cấp Nhóm nghiên cứu Vi sinh, Viện Cơng nghệ sinh học Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang; đƣợc lƣu giữ glycerol 20% -70 C thạch nghiêng 4-8 C Nuôi cấy vi nấm Các chủng vi nấm đƣợc ni cấy hoạt hóa môi trƣờng thạch PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) (MT1) nấm mốc môi trƣờng thạch YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose, Difco) (MT2) nấm men Ủ 28C vòng - 10 ngày, tùy vào thời gian sinh trƣởng chủng vi nấm, sau sử dụng cho mục đích Các chủng vi nấm đƣợc nuôi môi trƣờng thạch Czapek- Dox cải tiến (MT3) nhằm cảm ứng sinh tổng hợp enzyme amylase Mơi trƣờng MT3 gồm có NaNO3 (3,0 g/l), K2HPO4 (1,0 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), KCl (0,5 g/l), FeSO4.7H2O (0,01 g/l), tinh bột tan (10 g/l), pH 6,5 ± 0,2 MT3 đƣợc pha 50% nƣớc biển, hấp khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phút Chờ mơi trƣờng hạ nhiệt độ xuống cịn 45 – 50oC, sau bổ sung kháng sinh ampicillin (0,05%) XXVI streptomycin sulfate (0,075%) Đối với môi trƣờng thạch, bổ sung thêm 1,5% agar Các chủng nấm mốc đƣợc cấy chấm điểm (1 điểm) chủng nấm men đƣợc cấy vạch (3 vạch) lên đĩa petri, sau ủ nhiệt độ phòng (28C) ngày Đối với môi trƣờng lỏng, trƣớc tiên chủng nấm mốc đƣợc nuôi môi trƣờng lỏng PDA (MT1) 28C ngày với đƣờng kính khuẩn lạc đạt – 3,5 cm, sau dùng dao vơ trùng cắt miếng khuẩn lạc, kích thƣớc 1/10 khuẩn lạc, cuối ni lỏng mơi trƣờng MT3, lắc 120 vịng/ phút 28C vòng ngày, nhằm cảm ứng sinh tổng hợp enzyme amylase Xác định hoạt tính enzyme amylase phƣơng pháp đo đƣờng kính vịng phân giải Các chủng vi nấm nuôi cấy môi trƣờng thạch MT3 để cảm ứng sinh tổng hợp amylase, sau ngày lấy cho thuốc thử Lugol vào, để phút đo đƣờng kính vịng phân giải thƣớc đo khuẩn lạc Hoạt tính enzyme amylase đƣợc xác định dựa vào kết D-d (mm), D (mm) đƣờng kính vịng phân giải, d (mm) đƣờng kính khuẩn lạc Xác định hoạt độ enzyme amylase phƣơng pháp thuốc thử DNS (axit dinitrosalicylic) Hoạt độ enzyme amylase chủng nấm mốc đƣợc xác định theo phƣơng pháp DNS [9] Cụ thể, lấy ống nghiệm, dùng pipet cho vào ống nghiệm ml dung dịch hồ tinh bột 1%, lắc đều, ủ dung dịch đạt đến nhiệt độ 20C, cho vào ống lần lƣợt ml dịch chiết enzyme thô (ống đối chứng không cho) Trộn ủ phản ứng 20C vịng phút Sau bổ sung vào ống ml thuốc thử DNS, đậy nắp đun sôi cách thuỷ phút Lấy ống nghiệm bổ sung ml dung dịch enzyme thô bất hoạt enzyme vào ống nghiệm đối chứng Để nguội nhiệt độ phòng bổ sung vào ống nghiệm ml nƣớc tinh khiết Trộn đo quang phổ kế bƣớc sóng 540 nm ghi lại kết mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng Các thí nghiệm đƣợc lặp lại lần Sự khác biệt mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng đƣợc xác định nhƣ sau: ΔOD540 = OD540 (Trung bình ống thí nghiệm) – OD540 (ống đối chứng) Một đơn vị hoạt độ enzyme (U/ml) đƣợc định nghĩa lƣợng enzyme cần thiết giải phóng mg maltose từ tinh bột tan phút pH 6,9 nhiệt độ 20C Hoạt độ enzyme đƣợc tính theo cơng thức sau: Hoạt độ enzyme (U/ml) = Hàm lƣợng maltose giải phóng (mg) x (df) / V (ml) Trong đó, df độ pha lỗng dịch enzyme XXVII thơ, V (ml) thể tích dịch enzyme thơ sử dụng hàm lƣợng maltose (mg) giải phóng đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn maltose Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase Các điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng vi nấm nghiên cứu đƣợc khảo sát theo bƣớc gồm thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trƣờng, nguồn cacbon, nguồn nitơ, độ mặn, kết thông số tối ƣu từ bƣớc trƣớc đƣợc ứng dụng cho tất bƣớc sau Định danh chủng vi nấm kỹ thuật sinh học phân tử DNA tổng số chủng vi nấm đƣợc tách chiết kit EZ – 10 Column Plant Genomic DNA Purification (BioBasic, Canada) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất DNA tổng số sau tách chiết đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di đệm TAE dƣới nguồn điện 130V đƣợc bảo quản -20C để sử dụng cho phản ứng PCR sau Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR ITS1F KYO2 (5’-TAG AGG AAG TAA AAG TCG TAA-3’) [10] ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) [11] Hỗn hợp 25 µl phản ứng PCR bao gồm: 9,5 µl nƣớc, µl mồi (10 mM), µl DNA (2-20 mg), 12,5 µl MyTaq Mix 2X (Promega) Chu trình nhiệt đƣợc thực 35 chu kỳ bao gồm: 93C 30 giây, 56-58C 30 giây, 72C 30 giây Sản phẩm phản ứng đƣợc điện di gel agarose 1,2% Sản phẩm PCR đƣợc tách chiết tinh từ gel kit sinh phẩm QIAquick Gel Extraction Kit theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR đƣợc gửi giải trình tự cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự DNA đƣợc xử lý kết phần mềm MEGA 6, Geneious 10.2.2 (Biomatters, New Zealand) công cụ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST) để xác định độ tƣơng đồng với trình tự gen Genbank Xử lý số liệu Các số liệu đƣợc phân tích thống kê phần mềm SPSS 16 (SPSS Inc., Chicago, Mỹ), với khác biệt có ý nghĩa giá trị P < 0,05 XXVIII KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sàng lọc hoạt tính enzyme amylase ngoại bào chủng vi nấm biển Kết nghiên cứu cho thấy từ 160 chủng vi nấm biển (112 chủng nấm men 48 chủng nấm mốc) đƣợc phân lập, tất chủng nấm men hoạt tính sinh amylase, có 34/48 (70,8%) chủng nấm mốc có hoạt tính amylase Kết tƣơng đồng so với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Bình số chủng nấm mốc thu nhận từ rừng ngập mặn Cần Giờ, xác định đƣợc 261/409 chủng (chiếm 63,81%) có khả sinh amylase [8] Tuy nhiên, kết nghiên cứu khơng tìm thấy chủng nấm men có hoạt tính amylase cao, kết nghiên cứu Yalcin Corbaci (2013) cho thấy 25 chủng nấm men đƣợc phân lập từ nguồn khác sau ủ mơi trƣờng có chứa tinh bột tan sàng lọc đƣợc 12 chủng sản xuất amylase (chiếm tỷ lệ 48%) [12] Khi phân tích cụ thể hơn, số 34 chủng nấm mốc có hoạt tính amylase nghiên cứu có 16 chủng nấm mốc có đƣờng kính vịng phân giải tinh bột lớn 10 mm thể hoạt tính amylase mạnh Từ kết khảo sát hoạt tính enzyme amylase chủng nấm mốc nói trên, chúng tơi chọn đƣợc 10 chủng có đƣờng kính vịng phân giải tinh bột lớn để sử dụng cho thí nghiệm Xác định hoạt độ enzyme amylase chủng nấm biển nghiên cứu Để đánh giá xác khả sinh enzyme amylase 10 chủng nấm mốc làm sở cho tuyển chọn tiếp theo, tiến hành xác định hoạt độ enzyme amylase theo phƣơng pháp sử dụng thuốc thử DNS Kết đƣợc thể Hình Hình Hoạt độ enzyme amylase trung bình 10 chủng vi nấm qua sàng lọc (ad thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) XXIX Kết từ Hình cho thấy, chủng DM12M, DW7M TB8M có khả phân giải tinh bột cao với hoạt độ tƣơng ứng 13,0 U/ml, 10,6 U/ml 12,9 U/ml Tuy nhiên, kết nghiên cứu Ominyi (2013) khả sinh enzyme amylase chủng Aspergillus sp AS- 2a, Mucor sp MS-3 Rhizopus sp RS-6b cho thấy chủng có hoạt độ tối ƣu lần lƣợt 35 U/ml, 34 U/ml 25 U/ml, cao so với hoạt độ enzyme amylase chủng nấm mốc nghiên cứu [13] Điều nhiên cứu Ominyi (2013), hàm lƣợng tinh bột môi trƣờng nuôi cấy cao dịch enzyme thô đƣợc tủa nên độ tinh tốt Ngƣợc lại, kết nghiên cứu Arzu (2015) đánh giá khả sản sinh amylase số lồi Aspergillus spp ƣa nhiệt ni cấy môi trƣờng lỏng sử dụng tinh bột tan nguồn chất cảm ứng, hoạt độ amylase đạt 5,1 U/ml [14], tức thấp kết nghiên cứu chủng nghiên cứu Từ kết nghiên cứu trên, chọn chủng DM12M, DW7M TB8M cho nghiên cứu Xác định thời gian ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase chủng DM12M, DW7M TB8M Kết từ Hình cho thấy chủng nấm mốc nghiên cứu có hoạt độ amylase cao sau thời gian nuôi cấy ngày (chủng DM12M có hoạt độ cao đạt 13,7 U/ml) Sau ngày hoạt độ enzyme amylase chủng giảm dần mơi trƣờng tạo sản phẩm thứ cấp ức chế sinh trƣởng môi trƣờng nuôi cấy cạn kiệt chất dinh dƣỡng [15] Kết phù hợp với nghiên cứu Ominyi (2013) khả sinh amylase chủng nấm Aspergillus, Mucor Rhizopus, với khả sản sinh enzyme amylase đạt hoạt độ cao sau ngày [13] Trong đó, chủng Aspergillus protuberus Đ10 A terreus Đ6 phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ nuôi môi trƣờng bán rắn có thời gian ni cấy thích hợp sinh enzyme amylase lần lƣợt 48 60 [8] Kết thời gian nuôi cấy ngày đƣợc ứng dụng cho bƣớc nghiên cứu XXX Hình Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ amylase chủng DM12M, DW7M TB8M (Các ký hiệu từ a-l thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Xác định nhiệt độ mơi trƣờng ni thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase chủng DM12M, DW7M TB8M Hình Ảnh hƣởng nhiệt độ ni cấy đến hoạt độ enzyme amylase chủng nấm mốc (Các ký hiệu a-i thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Kết từ Hình cho thấy chủng DM12M, DW7M TB8M có hoạt độ enzyme amylase cao tƣơng ứng nhiệt độ nuôi cấy 30, 37 28 C Trong kết hoạt độ cao chủng DM12M 30 C có giá trị khác biệt mặt thống kê điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác với chủng khác Theo Mahapatra Banerjee (2012), chủng Aspergillus aculeatus DBF9 ni lỏng mơi trƣờng Czapek-Dox, có bổ sung 1% tinh bột tan, cho thấy nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu 30 C [16], tức có kết tƣơng tự với chủng DM12M nghiên cứu Vì vậy, chủng DM12M với nhiệt độ nuôi cấy 30 C đƣợc lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu điều kiện nuôi cấy khác nhằm thu đƣợc enzyme amylase có hoạt độ cao XXXI Xác định pH mơi trƣờng ni thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M Kết từ Hình cho thấy pH 6,0 (axít yếu) giá trị pH tối ƣu cho sinh tổng hợp amylase ngoại bào chủng DM12M với hoạt độ đạt 30 U/ml Các nghiên cứu trƣớc nhiều enzyme đƣợc sinh tổng hợp mạnh mơi trƣờng ni có pH trung tính, có nhiều enzyme có hoạt độ cao pH mơi trƣờng < Ví dụ, Shahzad cộng (2016) công bố pH tối ƣu để Aspergillus niger sinh tổng hợp amylase [17] Trong đó, chủng Aspergillus protuberus Đ10 ni cấy mơi trƣờng bán rắn có pH 5-6 thích hợp cho việc sản sinh amylase [8] Hình Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến hoạt độ enzyme amylase chủng DM12M (a-c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Xác định nguồn cacbon thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase chủng DM12M Kết từ Hình cho thấy hoạt độ enzyme amylase chủng DM12M đạt cao 30 U/ml nguồn cacbon 1% tinh bột tan Điều chứng tỏ tinh bột tan nguồn cacbon phù hợp, đƣợc xem nhƣ chất cảm ứng tốt môi trƣờng nuôi cấy để kích thích sản sinh enzyme amylase chủng Kết nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu trƣớc chứng minh tinh bột tan nguồn cacbon tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy vi nấm Ví dụ, theo Sahoo cộng (2014), hoạt độ enzyme amylase chủng MFS-9 phân lập từ rừng ngập mặn đạt cao môi trƣờng nuôi chứa 1% tinh bột tan [5] Trong đó, Shahzad cộng (2016) nghiên cứu chủng nấm mốc thuộc lồi Aspergillus niger ni mơi XXXII trƣờng Czapek-Dox có bổ sung 1,25% tinh bột tan thu đƣợc hoạt tính enzyme amylase cao [17] Hình Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến hoạt độ enzyme amylase chủng DM12M (a-c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Xác định nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase chủng DM12M Kết từ Hình (bên trái) cho thấy chủng nấm mốc DM12M có khả sản sinh enzyme amylase cao có mặt 0,3% NaNO3 mơi trƣờng ni cấy Vì vậy, nguồn nitơ vơ thích hợp cho q trình sinh tổng hợp enzyme amylase chủng DM12M 0,3% NaNO3 với hoạt độ đạt đƣợc 40,0 U/ml Điều xác nhận thêm cho nhận định lồi vi nấm sử dụng nguồn nitơ khác cho trình sinh tổng hợp enzyme Hình Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến hoạt độ enzyme amylase chủng DM12M (a-d thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Sau xác định đƣợc nguồn nitơ vô thích hợp, chúng tơi tiếp tục tối ƣu nguồn nitơ hỗn hợp cách bổ sung thêm vào môi trƣờng nuôi cấy 0,3% nguồn nitơ hữu khác Kết thể Hình (bên phải) cho thấy bổ sung thêm nguồn nitơ hữu vào môi trƣờng nuôi cấy hoạt độ enzyme amylase chủng XXXIII chủng DM12M đạt mức từ 30 U/ml đến 40 U/ml, tức khơng có thay đổi đáng kể so với nuôi cấy môi trƣờng mà nguồn nitơ 0,3% NaNO3 Kết có khác biệt với kết nghiên cứu Shahzad cộng (2016) khả sản sinh enzyme amylase chủng nấm mốc thuộc loài A niger, nguồn nitơ tối ƣu nghiên cứu đƣợc 0,75% NH4NO3 kết hợp với 1,5% peptone [17] Vì vậy, 0,3% NaNO3 đƣợc chọn nguồn nitơ mơi trƣờng ni cấy cho thí nghiệm chủng DM12M Xác định nồng độ NaCl NaNO3 thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M Độ mặn yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng phát triển chủng vi nấm sống môi trƣờng biển Trong bƣớc nghiên cứu trên, chủng nấm đƣợc nuôi môi trƣờng chứa 50% nƣớc biển (độ mặn dao động từ 2-4%), tức nồng độ NaCl môi trƣờng nuôi vi nấm dao động từ 1-2% Để xác định xác độ mặn thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase chủng DM12M, tiến hành nuôi vi nấm môi trƣờng không bổ sung nƣớc biển mà có bổ sung NaCl nồng độ khác Kết từ Hình (bên trái) cho thấy bổ sung thêm 0,5% NaCl vào môi trƣờng nuôi cấy, hoạt độ amylase chủng DM12M đạt cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hoạt độ amylase chủng ni mơi trƣờng có bổ sung NaCl với nồng độ % cao Kết khác biệt với kết nghiên cứu Sahoo cộng (2014) khả sản sinh amylase vi nấm rừng ngập mặn, nồng độ NaCl thích hợp đƣợc tìm thấy 1% [5] Các kết thu đƣợc đƣợc ứng dụng để tiếp tục xác định nồng độ NaNO3 thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase chủng nghiên cứu Kết từ Hình (bên phải) cho thấy hoạt độ enzyme amylase chủng DM12M đạt cao (63,2 U/ml) nuôi mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 0,6% Hoạt độ cao so với hoạt độ thu đƣợc điều kiện mơi trƣờng có 0,3% NaNO3 (59,0 U/ml) nhƣng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (P>0,05) Trên thực tiễn, việc lựa chọn nồng độ NaNO3 0,3% đem lại hiệu kinh kế cao việc lựa chọn nồng độ NaNO3 0,6% giảm đƣợc 50% lƣợng muối XXXIV Hình Ảnh hƣởng nồng độ NaCl NaNO3 đến hoạt độ enzyme amylase chủng DM12M (a-c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) So sánh hoạt độ enzyme amylase thu đƣợc từ chủng DM12M với hoạt độ amylase thƣơng mại Để đánh giá hoạt tính amylase chủng DM12M, tiến hành so sánh hoạt tính amylase chủng với enzyme thƣơng mại amylase BAN480L (Novozymes) Kết từ Hình cho thấy hoạt độ amylase chủng DM12M 59,0 U/ml BAN480L 132,2 U/ml Điều enzyme thƣơng mại đƣợc tối ƣu điều kiện nuôi cấy nhƣ điều kiện phản ứng enzyme, đƣợc tinh sạch, kết tủa loại bỏ tạp chất không cần thiết nên hoạt độ enzyme thƣơng mại cao khoảng lần so với hoạt độ amylase chủng DM12M Hình So sánh hoạt tính hoạt độ amylase chủng DM12M amylase BAN480L (Novozymes) (A: Đĩa thạch vòng phân giải tinh bột ủ 37C vòng 13 giờ, 1: dịch enzyme amylase DM12M, 2: enzyme BAN480L pha loãng lần); B: Đồ thị hoạt độ amylase) Định danh chủng nấm mốc DM12M XXXV Sau khảo sát điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu ảnh hƣởng đến khả sinh enzyme amylase ngoại bào chủng nấm mốc, chúng tơi nhận thấy chủng DM12M chủng có hoạt độ amylase cao ổn định Vì vậy, tiến hành định danh chủng phƣơng pháp quan sát hình thái sinh học phân tử Kết phân tích phân tử cho thấy khuếch đại thành công đoạn gen ITS1–5,8S– ITS2 chủng DM12M có kích thƣớc khoảng 580 bp kỹ thuật PCR, nhiệt độ bắt cặp tối ƣu mồi 56,4 C Trình tự gen đoạn gen ITS chủng DM12M sau đƣợc phân tích BLAST Genbank (Bảng 1) cho thấy có độ tƣơng đồng cao từ 99,8% đến 100% với chủng thuộc loài Aspergillus aculeatus (KY320594, EU833205, EU326206, AJ279995) Từ cho thấy chủng DM12M thuộc lồi Aspergillus aculeatus Kết phù hợp với đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu đƣợc mô tả từ nghiên cứu trƣớc Bảng So sánh trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 chủng DM12M với trình tự tương đồng Genbank Mã số Điểm Genbank Tên loài Tỷ lệ tƣơng Tỷ lệ che phủ đồng (%) (%) 1064.79 KY320594 Aspergillus aculeatus 100 100 1064.79 EU833205 Aspergillus aculeatus 100 100 1064.79 EU326206 Aspergillus aculeatus 100 100 1057.4 AJ279995 Aspergillus aculeatus 99,8 100 1053.71 MG682503 Aspergillus 99,7 100 99,7 100 violaceofuscus 1053.71 KC128815 Aspergillus japonicus Hiện giới có nhiều nghiên cứu khả sản sinh amylase chi Aspergillus, nhiên, nghiên cứu khả sản sinh amylase loài Aspergillus aculeatus cịn hạn chế Điển hình có Khokhar cộng (2011) phân lập chủng vi nấm chi Aspergillus Penicillium từ nguồn khác XXXVI cho thấy Aspergillus aculeatus có khả sản sinh enzyme amylase [18] Một nghiên cứu ứng dụng khác chủng A aculeatus BCC17849 có khả sản sinh enzyme amylase phân giải tinh bột đa thành phần [19] Điều thú vị sử dụng enzyme từ chủng cho q trình đƣờng hố lên men ngun liệu bột sắn bể phản ứng sinh học thu nhận đƣợc ethanol với hiệu suất cao [19] Các nghiên cứu cho thấy chủng A aculeatus DM12M dịch enzyme amylase từ chủng có tiềm ứng dụng cho phân giải tinh bột số ngành công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học KẾT LUẬN Sau sàng lọc hoạt tính amylase 160 chủng vi nấm biển có nguồn gốc từ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong, tuyển chọn đƣợc chủng DM12M có khả sinh amylase mạnh Mơi trƣờng ni cấy thích hợp để chủng DM12M sinh tổng hợp amylase môi trƣờng Czapeck- Dox cải tiến với nguồn chất cảm ứng 1% tinh bột tan nguồn nitơ 0,3% NaNO3, có bổ sung 0,5% NaCl, nuôi ngày điều kiện pH 6,0 nhiệt độ 30C Trong điều kiện này, hoạt độ amylase chủng DM12M đạt 59,0 U/ml, cao gấp lần hoạt độ enzyme amylase chủng nuôi môi trƣờng chƣa đƣợc tối ƣu (13,0 U/ml), chứng tỏ điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng lớn đến sản sinh amylase chủng Hoạt độ amylase chủng DM12M thấp lần so với hoạt độ amylase thƣơng mại BAN480L (Novozymes), enzyme thƣơng mại tinh đƣợc tối ƣu điều kiện nuôi cấy nhƣ điều kiện phản ứng enzyme Chủng DM12M có trình tự đoạn gen ITS1 5,8S - ITS2 tƣơng đồng 99,8-100% với chủng loài Aspergillus aculeatus nên thuộc lồi Các kết cho thấy chủng DM12M dịch enzyme amylase từ chủng có tiềm ứng dụng cơng nghiệp LỜI CẢM ƠN Kết đƣợc tài trợ kinh phí Quỹ NAFOSTED cho đề tài mã số 106NN.02-2016.70 TS Phạm Thu Thủy làm chủ nhiệm XXXVII TÀI LIỆU THAM KHẢO Kumari N., Sushil R., Rani N., Malik K and Avtar R (2019), Microbial amylases: An overview on recent advancement, Journal of Entomology and Zoology Studies, 7(1), 198-205 Mohapatra B., Banerjee U and Bapuji M (1998), Characterization of a fungal amylase from Mucor sp associated with the marine sponge Spirastrella sp., Journal of Biotechnology, 60, 113–117 Li H F., Chi Z M., Wang X H., Duan X H., Ma L Y., Gao L M (2007), Purification and characterization of extracellular amylase from the marine yeast Aureobasidium pullulans N13d and its raw potato starch digestion, Enzyme and Microbial Technology, 40, 1006-1012 Chakraborty S., Khopade A., KoKare C., Mahadik K., Chopade B ( 2009), Isolation and characterization of novel α-amylase from marine Streptomyces sp D1, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 58, 17-23 Sahoo K., Dhal N and Das R (2014), Production of amylase enzyme from mangrove fungal isolates, African Journal of Biotechnology, 13(46), 4338-4346 Lanka S., Pydipally M and Latha J N L (2016), Extraction and activity studies of industrially important enzymes from marine fusarium species isolated from Machilipatnam sea water, (a.p), India, European Journal of Pharmaceuticaland Medical Research, 3(12), 254-258 Yanming W., Dorothee B., Anu T., and Marilyn G (2016), Growth of marine fungi on polymeric substrates, BMC Biotechnology, 16, Nguyễn Thị Thanh Bình (2010), Nghiên cứu thu nhận enzym amylase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Ðại học Sƣ phạm Thành phố Hồ Chí Minh Bernfeld P (1955), Amylases, α and β, Methods in Enzymology, 1, 149-58 10 Toju H., Tanabe A S., Yamamoto S and Sato H (2012), High-Coverage ITS primers for the DNA-Based identification of Ascomycetes and Basidiomycetes in environmental samples, PLoS ONE, 7(7), e40863 11 Lai X., Cao L., Tan H., Fang S., Huang Y., Zhou S (2007), Fungal communities from methane hydrate-bearing deep-sea marine sediments in South China Sea ISME J, 1, 756–762 XXXVIII 12 Yalcin, T H., & Corbaci, C (2013), Isolation and Characterization of Amylase Producing Yeasts and Improvement of Amylase Production, Turkish Journal of Biochemistry, 38(1), 101–108 13 Ominyi M C (2013), Optimization of α-amylase and glucoamylase production from three fungal strains isolated from Abakaliki, Ebonyi State, European Journal of Experimental Biology, 3(4), 26-34 14 Arzu U (2015), Production of α-amylase from some thermophilic Aspergillus species and optimization of its culture medium and enzyme activity, African Journal of Biotechnology, 14(47), 3179-3183 15 Abdullah R., Shaheen N., Iqtedar M., Shagufta N and Tikha R (2014), Optimization of cultural conditions for the production of alpha amylase by Aspergillus niger (btm-26) in solid state fermentation, Pakistan Journal of Botany, 46(3), 1071-1078 16 Mahapatra S and Banerjee D (2012), Production and characterization of Thermal acid amylase from A aculestus DBF9, Dynamic Biochemistry, Process Biotechnology and Molecular Biology, 6(1), 109-112 17 Shahzad M., Memuna G., Muhammad N and Quratulain S (2016), Production and optimization of α-amylase from Aspergillus niger using potato peel as substrate, Pakistan Journal of Biotechnology, 13(2), 101-109 18 Khokhar I., Mukhtar I and Mushtaq S (2011), Comparative Studies on the Amylase and Cellulase Production of Aspergillus and Penicillium Journal of Applied Sciences and Environmental Management, 15(4), 657-661 19 Poonsrisawat A., Paemanee A., Wanlapatit S., Piyachomkwan K., Eurwilaichitr L., Champreda V (2017), Simultaneous saccharification and viscosity reduction of cassava pulp using a multi-component starch- and cell-wall degrading enzyme for bioethanol production, Biotech, 7(5), 290 XXXIX Selection and culture condition optimisation for amylase biosynthesis of marine fungal strains isolated from Nha Trang Bay and Van Phong Bay, Khanh Hoa province Pham Thu Thuy, Dinh Thi So and Nguyen Van Duy * Institute of Biotechnology and Environment, Nha Trang University *E-mail: duynv@ntu.edu.vn ABSTRACT Marine fungi play an important role in marine ecosystems and provide many valuable industrial products The objective of this study is to select amylase-producing marine fungi strains isolated in Nha Trang Bay and Van Phong Bay, and to study the appropriate culture conditions to obtain high-activity amylase enzymes The results showed that all yeast strains did not express amylase activity (0/112 strains), while the molds had amylase activity with a high rate of 70,8.9% (34/48 strains) Of these, the mold DM12M strain had the highest amylase activity (13.0 U/ml) Suitable culture conditions for amylase enzyme biosynthesis have been shown as the modified Czapeck-Dox medium with 1% soluble starch, 0.3% NaNO3, 0.5% NaCl, cultured for days at pH 6.0 and 30C Under these conditions, the amylase activity of the DM12M strain reached 59.0 U/ml, approximately times higher than the pre-optimal conditions The DM12M strain has an ITS1- 5.8S-ITS2 gene sequence that is 99.8% 100% homologous to the strains of Aspergillus aculeatus, so it may belong to this species The results provide scientific data on the factors affecting the ability of marine fungus to produce amylase enzymes and open up their potential for industrial application Key words: amylase, Aspergillus aculeatus, marine fungi, Nha Trang Bay, Van Phong Bay Thông tin tác giả liên lạc: PGS.TS Nguyễn Văn Duy, Viện Công nghệ sinh học Mơi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang, 02 Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang, Khánh Hòa ĐT: (0258)2461301 E-mail: duynv@ntu.edu.vn XL ... vi nấm biển sinh enzyme amylase phân lập từ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong? ?? Mục tiêu đề tài - Tuyển chọn chủng vi nấm biển sinh enzyme amylase mạnh từ nƣớc biển ven bờ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong. .. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH THỊ SỞ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI NẤM BIỂN SINH ENZYME AMYLASE PHÂN LẬP TỪ VỊNH NHA TRANG VÀ VỊNH VÂN PHONG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học... phân lập từ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong? ?? nhằm đa dạng hoá nguồn amylase từ vi nấm biển phù du, nhƣ mong muốn thu đƣợc chủng nấm sợi mang đặc tính quý Mục tiêu đề tài tuyển chọn chủng vi nấm biển