Nghiên cứu thu nhận glucose isomerase từ bacillus coagulans

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - NGUYỄN THỊ HỒNG YẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN GLUCOSE ISOMERASE TỪ Bacillus coagulans Chuyên ngành : Khoa học công nghệ thực phẩm Mã số ngành : 2.11.00 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2007 CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH *************************** Cán hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN HỮU PHÚC Cán chấm nhận xét : PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Cán chấm nhận xét : PGS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Luận văn thạc só bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 17 tháng 08 năm 2007 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp HCM, ngày10 tháng 08 năm 2007 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ HOÀNG YEÁN .Phái: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 18 / 11 / 1981 Nơi sinh: Ninh Thuận Chun ngành: Khoa học Cơng nghệ thực phẩm MSHV: 01104309 Khóa (năm trúng tuyển): 2004 I- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN GLUCOSE ISOMERASE TỪ Bacillus coagulans II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Phân lập chủng vi khuẩn từ túi probiotic SPORLAC định danh chủng - So sánh, chọn chủng (giữa chủng Bacillus coagulans cung cấp Viện sinh học nhiệt đới chủng vừa phân lập) có khả sinh tổng hợp enzyme glucose isomerase cao - Chọn tối ưu hóa thành phần mơi trường lỏng ni cấy vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme glucose isomerase - Chọn tối ưu hóa điều kiện ni cấy vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme glucose isomerase - Thử nghiệm cố định tế bào vi khuẩn chứa enzyme alginate gelatine III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: ngày 06 tháng 02 năm 2006 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: ngày 10 tháng 08 năm 2007 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN HỮU PHÚC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Học hàm, học vị, họ tên chữ ký) CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH TS Nguyễn Hữu Phúc Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chun ngành thơng qua TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH Ngày tháng năm 2007 TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH Trước hết, xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô môn Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Tp.HCM hết lòng giảng dạy cho suốt thời gian vừa qua Đặc biệt cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Phúc tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn theo cách tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm – Sinh học, Trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM nhiệt tình hỗ trợ tơi q trình thực luận văn Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp hết lòng giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất thầy anh chị Tp.HCM, tháng 08 – 2007 Nguyễn Thị Hoàng Yến ABSTRACT This study, focuses on the optimization of liquid fermentation medium for glucose isomerase biosynthesis by Bacillus coagulans Composition of the culture medium used was as follows: A K2HPO4 1g D-xylose 20 g Yeast extract 3.9 – 4.2 g MgSO4.7H2O 500 mg NH4Cl 2.9 – 4.2 g MnSO4 50 mg Distilled water 300 ml Distilled water 700 ml B The solution is sterilized at 121 oC for 30 minutes The initial pH of the medium is approximately 6.8 Each 40 ml of above medium in 500 ml flask was inoculated with ml of seed culture The culture was mechanically shaken at 37 oC After 18 hours growth period, the cells were harvested by centrifugation at 6000 r.p.m for 10 minutes D-glucose isomerizing activity was determined as follows: the reaction mixture was prepared by adding ml of 0.025 buffer (pH = 7) containing 0.5 M Dglucose and 0.025 M CoCl2 to the 1.5 ml washed cell suspension (20 mg cells in dry basic) The reaction mixture, after 0.2 ml toluene was added, was incubated for hour at 50 oC The reaction was stopped by an addition of 12.5 ml of 0.5 M perchloric acid and D-frutose formed was determined by the cysteine-carbazole method Then the submerged fermentation conditions are optimized The inoculating rate is 20 mg dry spores/40 ml medium, agitation rate 250 rpm and fermentation time 18 hours The pH of the produced glucose isomerase are determined (pHopt = 6.8) Then, glucose isomerase was selected to immobilize on surface calcium alginate gel and gelatine gel The properties of the immobilized enzyme were investigated and compared with those of the free enzyme TÓM TẮT LUẬN VĂN Glucose isomerase enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa đồng phân glucose thành fructose Sản phẩm thu hỗn hợp đường glucose - fructose, cịn có tên gọi syrup fructose syrup giàu fructose (HFS - High Fructose Syrup) HFS sử dụng rộng rãi công nghiệp lên men, bánh kẹo, mứt trái cây, nước đóng hộp, sữa, kem Ngồi ra, HFS chọn làm nguyên liệu sản xuất loại thực phẩm đặc dụng, thức uống cho người lớn tuổi, người bệnh, vận động viên thể thao,… Trong nghiên cứu này, vi khuẩn Bacillus coagulans phân lập từ túi probiotic SPORLAC định danh Sau đó, so sánh khả sinh tổng hợp glucose isomerase chủng vi khuẩn vừa phân lập chủng Bacillus cogulans cung cấp Viện sinh học nhiệt đới Tp.HCM, chọn chủng hiệu tổng hợp enzyme Nuôi cấy để thu nhận enzyme glucose isomerase theo phương pháp nuôi cấy chìm 37 oC máy lắc có ổn định nhiệt Sau thời gian định, thu nhận toàn dịch ni cấy, ly tâm 6000 vịng/phút thu sinh khối, phá vỡ tế bào vi khuẩn toluene để thu enzyme Đo hoạt tính glucose isomerase tạo thành phương pháp cysteine-carbazole Chọn tối ưu hóa thành phần mơi trường điều kiện nuôi cấy để thu nhận glucose isomerase Thành phần môi trường tối ưu Phần A Phần B K2HPO4 1g D-xylose 33 – 34 g Cao nấm men 3,9 – 4,2 g MgSO4.7H2O 0,5 g NH4Cl 2,9 – 3,2 g MnSO4.7H2O 0,05 g Nước cất đủ 700 ml Nước cất đủ 300 ml Điều kiện nuôi cấy Giữ pH tự nhiên môi trường Hàm lượng giống bổ sung: 20 mg sinh khối/40 ml môi trường Thu enzyme sau nuôi cấy 18 Tốc độ lắc 250 vịng/phút Sau đó, thử nghiệm cố định tế bào vi khuẩn chứa enzyme alginate gelatine Hai phương pháp cố định làm đáng kể hoạt tính enzyme so với enzyme hòa tan, nhiên cố định gelatine hiệu so với alginate LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN Phái: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 18 / 11 / 1981 Nơi sinh: Ninh Thuận Địa liên lạc: 20/65 Đường Hồ Đắc Di, Phường Tây Thạnh, Quận Tân Phú, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Điện thoại: 0958123730 Q TRÌNH ĐÀO TẠO: - Năm 2004, tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ Hóa học & Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa, Tp Hồ Chí Minh - Năm 2004 – 2007: tham dự lớp cao học K15, ngành Khoa học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh Q TRÌNH CƠNG TÁC: - Từ 2004 – 2005: nhân viên Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm, Tp Hồ Chí Minh - Từ 2005 – đến nay: giáo viên Khoa Công nghệ Thực phẩm – Sinh học, Trường Đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh MỞ ĐẦU Một thành tựu to lớn khoa học công nghệ nửa cuối kỷ XX nghiên cứu enzyme, khám phá cấu trúc hóa học, chế xúc tác, phương pháp thu nhận tinh enzyme,…để phục vụ sống người Enzyme thành phần thiếu tế bào sinh vật, chúng đóng vai trị định chuyển hóa vật chất tế bào, định mối quan hệ thể sống môi trường Enzyme đối tượng quan trọng nghiên cứu ngành công nghệ sinh học, thực phẩm, dược phẩm,…Đến nay, người chiết xuất nhiều loại enzyme với độ tinh khiết cao từ động vật, thực vật đặc biệt từ vi sinh vật Một enzyme có nhiều ứng dụng glucose isomerase Đây loại enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa (isomer hóa) glucose thành fructose Enzyme glucose isomerase xúc tác chuyển hóa dịch đường glucose thu từ tinh bột thủy phân acid enzyme Sản phẩm thu hỗn hợp đường glucose - fructose, cịn có tên gọi syrup fructose syrup giàu fructose (HFS - High Fructose Syrup) iso-glucose, chứa 42 – 43 % fructose, 51% glucose, – 6% di−, tri−saccharide, có độ tương đương saccharose Syrup fructose ứng dụng ngày nhiều ngành công nghiệp thực phẩm y học Các ưu điểm fructose HFS ƒ Fructose gọi đường quả, phổ biến thiên nhiên, có nhiều táo, cà chua, mật ong (chiếm gần 50%) Trong saccharose, 3.2 ðường cong sinh trưởng chủng C1, C2 ðo độ hấp thu bước sóng 660 nm sau nuôi cấy với mẫu trắng dung dịch môi trường chưa cấy vi khuẩn Từ giá trị OD660nm, dựa vào ñường tương quan số tế bào sống vi khuẩn độ hấp thu, tính số khuẩn lạc/ml tương ứng Bảng vi: Giá trị dựng ñường cong sinh trưởng chủng C1 Thời gian Giá trị Số khuẩn Thời gian Giá trị Số khuẩn (giờ) OD660nm lạc/ml (giờ) OD660nm lạc/ml 0.999 24600 22 1.448 80300 1.018 25900 24 1.429 76500 1.093 31500 26 1.416 73800 1.225 44600 28 1.403 71300 1.308 55500 30 1.391 69200 10 1.374 66100 32 1.379 66900 12 1.417 74000 34 1.364 64400 14 1.443 79200 36 1.350 62100 16 1.463 83500 38 1.337 60000 18 1.462 83400 40 1.323 57800 20 1.458 82500 42 1.310 55900 91500 81500 Soá khuẩn lạc/ml 71500 61500 51500 41500 31500 21500 11500 1500 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Thời gian nuôi cấy (giờ) Hình v: ðường cong sinh trưởng chủng C1 Bảng vii: Giá trị dựng ñường cong sinh trưởng chủng C2 Thời gian Giá trị Số khuẩn Thời gian Giá trị Số khuẩn (giờ) OD660nm lạc/ml (giờ) OD660nm lạc/ml 0.879 25200 22 1.670 192500 0.938 29300 24 1.661 188400 1.138 49000 26 1.654 184900 1.337 81900 28 1.642 179200 1.451 109700 30 1.634 175700 10 1.534 135800 32 1.621 169900 12 1.592 157800 34 1.609 164700 14 1.639 178000 36 1.598 160100 16 1.663 189000 38 1.585 154900 18 1.679 196950 40 1.574 150800 20 1.676 195900 42 1.561 145600 251500 Soá khuẩn lạc/ml 201500 151500 101500 51500 1500 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Thời gian nuôi cấy (giờ) Hình vi: ðường cong sinh trưởng chủng C2 38 40 42 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 4.1 Kết phân tích thí nghiệm tối ưu hóa thành phần mơi trường ni cấy 4.1.1 Kết thí nghiệm khảo sát hàm lượng D-xylose thích hợp 4.1.2 Kết thí nghiệm khảo sát hàm lượng cao nấm men thích hợp 4.1.3 Kết thí nghiệm khảo sát hàm lượng NH4Cl thích hợp 4.1.4 Kết thí nghiệm tối ưu hóa thành phần mơi trường ni cấy 4.1.5 Kết thí nghiệm leo dốc 4.2 Kết phân tích thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu enzyme glucose isomerase 4.2.1 Kết thí nghiệm khảo sát pH thích hợp 4.2.2 Kết thí nghiệm khảo sát lượng giống cấy thích hợp 4.2.3 Kết thí nghiệm khảo sát độ thống khí thích hợp 4.2.4 Kết thí nghiệm khảo sát thời gian thu nhận enzyme 4.2.5 Kết thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Hoàng Kim Anh – Tinh bột sắn sản phẩm từ tinh bột sắn – Nhà xuất khoa học kỹ thuật [2] Hoàng Trọng – Xử lý liệu nghiên cứu với SPSS for Windows – Nhà xuất thống kê – 2002 [3] Lê Văn Việt Mẫn – Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống, tập – Đại học quốc gia Tp HCM – 2006 [4] Nguyễn Cảnh – Quy hoạch thực nghiệm – Nhà xuất đại học quốc gia Tp.HCM – 2004 [5] Nguyễn Đức Lượng – Công nghệ enzyme – Đại học quốc gia Tp HCM – 2004 [6] Nguyễn Đức Lượng cộng - Thực tập vi sinh vật học thực phẩm – Đại học Kỹ thuật Tp.HCM [7] Nguyễn Lân Dũng cộng - Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập – Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật – Hà Nội [8] Nguyễn Lân Dũng – Vi sinh vật học, tập – Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội [9] Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty – Vi sinh Vật học - Nhà xuất giáo dục – 2000 [10] Nguyễn Trọng Cẩn – Công nghệ enzyme – Nhà xuất Nông nghiệp Tp.HCM – 1998 [11] Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm – Nhà xuất giáo dục [12] Trần Linh Thước – Thực tập vi sinh vật học – Nhà xuất Đại học quốc gia Tp.HCM – 2001 [13] N.X.Egorov – Thực tập vi sinh vật học – Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp – Hà Nội [14] X.L Akhnadarova, V V Kapharop – Tối ưu hóa thực nghiệm hóa học & kỹ thuật hóa học – Nguyễn Cảnh, Nguyễn Đình Soa dịch – Trường Đại học Kỹ thuật Tp.HCM – 1994 [15] GS TS Ngô Kế Sương cộng – Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất hỗn hợp đường glucose - fructose từ tinh bột khoai mì phương pháp enzyme – Viện sinh học nhiệt đới Tp HCM – 9/1995 Tài liệu tiếng Anh [16] A Larry Branen, P Michael Davidson and Seppo Salminen – Food additives – Marcel Dekker, INC – 1990 – p444-448 [17] Alan Wiseman – Handbook of enzym biotechnology, 3rdedition – Ellis Horwood [18] Biobase industrial products: Priorities for Research and commercialization – Washington, D.C National Academy Press – 1999 – p93 [19] Catalysis looks to the future - D.C National academy press – 1992 – p30-31, 14 -15 [20] Harley Prescott – Laboratory Exercises in Microbiology [21] George M Garrity, James T Staley, Chairman,… – Bergey ‘s Manual of Systematic Bacteriology, 2th ed [22] Identification and susceptibility testing – 2005 – Technical guide of BIOMÉRIEUX [23] Industrial enzymes, p194-199 [24] John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley, Stanley T Williams - Bergey’s manual of Determinative bacterology – The Williams & Wilkins company – 1957 [25] Sadahiko Yoshimura, Gen-chi Danno and Masato Natare – Study on Isomerizing Activity of D_xylose grown cells from Bacillus cogulans HN_68, part I – Labovatory of food chemistry and applied microbiology, Hyogo university of agriculture, Sasayama – 1966 [26] Samuel Baron, MD - Medical Microbiology - Fourth Edition – Professor and Chairman, Department of Microbiology and Immunology – Professor, Department of Internal Medicine - Associate Dean for Research Development and Planning [27] Zacharias Dishe Ellen Borenfreund – J Biol Chem 192 Địa web [28] www.Apps3.fao.org/jecfa/additive_specs/docs/t0368e/t0368e08.htm#N437 [29] www.biologie.de [30] www biop.ox.ac.uk/lj2006/fac_fig2.jpg [31] www.dsmz.de/strains/no000001.htm [32] www.En.wikipedia.org/wiki/Bacillus_coagulans [33] www.erchantedlearning.com/subjects/bacterium/label [34] www.food-info.net/uk/ff/sporogenes.htm [35] www.fst.rdg.ac.uk/courses/fs916.industrial enzymology.html [36] www.inchem.org/documents/jecfa/jeceval/jec_798.htm [37] www.ispub.com/ /ijam/vol1n2/lacto-tbl2a.jpg [38] www.lactospore.com/back2.htm [39] www.macrocrystal.com/pic00026.jpg [40] www.novozymes.com/ /0/appdes_smarties.jpg [41] www.revitec.com.br/img/meios8.jpg [42] www.sti.nasa.gov/ /images/p092-0109_img_18.jpg [43] www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html [44] www.vetcareindia.com/Probiotic%20_mailer2.htm ... Xuất phát từ thực tế trên, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận glucose isomerase từ Bacillus coagulans? ?? Mục tiêu đề tài xác định điều kiện nuôi cấy để thu nhận glucose isomerase từ Bacillus coagulans. .. Nơi sinh: Ninh Thu? ??n Chun ngành: Khoa học Cơng nghệ thực phẩm MSHV: 01104309 Khóa (năm trúng tuyển): 2004 I- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN GLUCOSE ISOMERASE TỪ Bacillus coagulans II-... enzyme glucose isomerase 1.1.7 Nguồn thu nhận 1.1.8 Phương pháp thu nhận 10 1.1.9 Các dạng chế phẩm glucose isomerase thường gặp 12 1.1.10 Ứng dụng enzyme glucose isomerase