Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm, Phức hệ Nano Chitosan, Gen mã hóa

Một trong các liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thư, vaccine ung thư cung cấp các lợi thế khác biệt so với phương pháp tiếp cận thông thường: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÃ THỊ HUYỀN

PGS TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội, 2013

Thị Huyền, PGS TS Nguyễn Quang Huy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn, Trưởng

phòng Phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, và tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới NCS Lê Thị Thùy Dương, NCS Lê Thị Hạnh,

CN Phạm Văn Phúc và các anh chị tại phòng Công nghệ tế bào động vật đã giúp

đỡ rất nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình học tập tại đây

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo dạy Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dạy bảo và giúp đỡ trong thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Học viên

Hoàng Thị Ngà

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase 3

1.1.1 Giới thiệu chung telomere ở người 3

1.1.2 Hoạt động telomerase ở người 5

1.1.3 Tình hình nghiên cứu hTERT 7

1.1.4 Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT 9

1.2 Tổng quan về chitosan 11

1.2.1 Giới thiệu chung chitosan 11

1.2.2 Ứng dụng của chitosan 13

1.2.3 Giới thiệu chung về nano chitosan 14

1.2.4 Chitosan, chất mang dẫn truyền gen 16

1.2.5 Các phương pháp tạo nano chitosan 16

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Vật liệu và hóa chất 22

2.1.2 Thiết bị 22

2.1.3 Môi trường và dung dịch 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) 24

2.2.2 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 25

2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 26

2.2.4 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose 26

2.2.5 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E coli 27

2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 28

2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA 29

2.2.9 Phương pháp tạo hạt nano chitosan 29

2.2.10 Phương pháp tạo phức hệ nao chitosan/vector mang hTERT 31

2.2.11 Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM) 31

2.2.12 Phương pháp đo size, phân bố size và thế zeta 32

2.2.13 Phương pháp xác định hiệu quả đóng gói 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Thiết kế vector pcDNA3.1(+) mang đoạn gen mã hóa cho epitope của telomerase reverse transcriptase (hTERT) 37

3.1.1 Tổng hợp đoạn gen hTERT 37

3.1.2 Chuẩn bị vector pcDNA3.1 mở vòng với hai enzyme BamHI và XbaI 37

3.1.3 Gắn đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) và chọn lọc vector pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT 39

3.1.4 Xác định trình tự đoạn gen hTERT trong plasmid tái tổ hợp 41

3.2 Kết quả tạo hạt nano chitosan 42

3.2.1 Tạo chitosan phân tử lượng thấp từ chitosan phân tử lượng trung bình 42 3.2.2 Tạo hạt nano chitosan/TPP 43

3.3 Kết quả tạo phức nano chitosan mang plasmid DNA mã hóa cho hTERT 47

3.3.1 Tạo hạt nano chitosan mang vector tái tổ hợp pcDNA3.1/hTERT 47

3.3.2 Đánh giá khả năng mang DNA của hạt nano chitosan 50

KẾT LUẬN 53

KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

viết tắt

APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên

CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào lympho T gây độc

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

EDTA Ethyenediaminetetraacetic acid Axit ethyenediaminetetraacetic E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli

hTR Human temlate for replication

hTERT Human telomerase reverse

transcriptase TCR T-cell receptor Thụ thể tế bào T

LB Luria Bertani Môi trường LB

RNase Ribonuclease Enzyme phân hủy RNA

Hình 1.1 Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau 4

Hình 1.2 Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere 5

Hình 1.3 Tổ chức gen của hTERT 6

Hình 1.4 Cơ chế vacxin DNA 10

Hình 1.5 Cấu trúc của chitin và chitosan 12

Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương 17

Hình 1.7 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ 18

Hình 1.8 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương 19

Hình 1.9 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo 20

Hình 1.10 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion 21

Hình 2.1 Kính hiển vi điện tử quét S-4800 (FE-SEM, Hitachi) 32

Hình 2.2 Bề mặt của hạt nano mang điện tích và thế năng zeta 34

Hình 2.3 Sự biến thiên của thế zeta theo giá trị pH của môi trường 35

Hình 3.1 Sơ đồ đoạn gen hTERT 37

Hình 3.2 Sơ đồ vector pcDNA3.1(+) 38

Hình 3.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α 40

Hình 3.4 Điện đi đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI 41

Hình 3.5 Trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn tương ứng của đoạn gen mã hóa hTERT 42

Hình 3.6 Cơ chế tương tác giữa chitosan và TPP 44

Hình 3.7 Kích thước hạt nano chitosan/TPP 45

Hình 3.8 Thế zeta của hạt nano chitosan/TPP 46

Hình 3.9 Kích thước hạt nano chitosan-plasmid DNA 47

Hình 3.10 Thế zeta của hạt nano chitosan/plasmid DNA 48

Hình 3.11 Ảnh SEM nano chitosan –plasmid DNA 49

Hình 3.12 Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA 50

Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA cắt bằng DNaseI 51

Bảng 1.1 hTERT- epitope gây độc tế bào lympho T [8], [83], [85] 8 Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tích hợp gen mã hóa hTERT vào vector

pcDNA3.1(+) 24 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+) bằng enzyme BamHI và XbaI 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+)/hTERT bằng EcoRI 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt plamid DNA bằng enzyme DNase I 25 Bảng 2.6 Sự phụ thuộc độ ổn định của hệ keo vào giá trị thế Zeta 34

Với hy vọng khắc phục những trở ngại trên, nhiều nhà khoa học đang tập trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại căn bệnh ung thư Một trong các liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thư, vaccine ung thư cung cấp các lợi thế khác biệt so với phương pháp tiếp cận thông thường: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ được tính kháng thuốc, và tiềm năng bền trong điều trị thông qua bộ nhớ miễn dịch, Với sự phát triển của công nghệ nano, vaccine dạng nano đang được nghiên cứu Các vaccine dạng này thường cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo

hộ cao

Telomerase là một enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép

telomere của đầu cuối nhiễm sắc thể trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn

Telomerase ở người là một phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR và hTERT hTR

(hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và

hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngược

Chúng hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thư, không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen

mã hóa kháng nguyên hTERT sẽ mang lại nhiều triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thư Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các epitope của hTERT và nhận thấy rằng chúng có đáp ứng miễn dịch rất tốt với hầu hết các tế bào ung thư

Việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thư là hướng nghiên cứu triển vọng, nhưng để tăng cường quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin cần có một chất mang Cùng với phát triển của công nghệ nano các chất mang có bản chất polymer có khả năng liên kết và bảo vệ DNA đã được chọn làm chất truyền trung gian Một trong các polymer đặc biệt được quan tâm là chitosan, công nghệ nano chitosan hiện nay đã được sử dụng trong lĩnh vực y học như để phân phối thuốc và đang được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu làm vật liệu dẫn truyền vacxin DNA

Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một loại polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và tan tốt trong môi trường axit Vì chitosan tích điện dương nên có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, do vậy nó hứa hẹn là ứng cử viên tốt cho hệ thống mang gen Ngoài khả năng chitosan liên kết hiệu quả với

DNA chúng còn có thể bảo vệ DNA khỏi phân hủy của nuclease Xuất phát từ

những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase

reverse transcriptase (hTERT)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật

pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên telomerase reverse transcriptase (hTERT) Hệ vector tái tổ hợp này được bao gói

trong nano chitosan

3 Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT

- Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thước mong muốn

- Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT Đánh giá khả

năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase

1.1.1 Giới thiệu chung telomere ở người

Nhiễm sắc thể điển hình có chứa một cấu trúc đặc biệt ở hai đầu, được gọi là telomere Telomere là cấu trúc bao gồm một chuỗi lặp đi lặp lại TTAGGG [33], [48] Ở người các chuỗi lặp lại của telomere có từ 5000 đến 15000 base Telomere

có nhiệm vụ đảm bảo sự bền vững của nhiễm sắc thể, chống lại thoái hóa có hại, chống lại sự tái tổ hợp sai lạc Trình tự này sẽ mất dần đi sau mỗi lần phân chia, khi các telomere trở nên quá ngắn thì các nhiễm sắc thể sẽ kém bền vững, chúng không thể bám được vào màng nhân tế bào, bị dính vào nhau và có hình dạng kì dị và là các dấu hiệu dẫn đến sự thoái hóa của tế bào

Ở người, sự rút ngắn telomere của nguyên bào sợi từ 50-100 cặp base với mỗi lần tế bào phân chia, và nguyên bào sợi lão hóa sau 50-70 lần phân chia Vì vậy, có giả thiết rằng telomere rút ngắn đến một chiều dài nhất định sẽ dẫn đến tế bào già và chết [37] Rút ngắn chiều dài telomere thường dẫn đến sự mất ổn định hệ gen, dẫn đến mất kiểm soát chu kì tế bào, một dấu hiệu của ung thư Sự rút ngắn telomere được nghiên cứu là có liên quan tới việc tăng nguy cơ một số bệnh ung thư của con người, bao gồm: bàng quang, phổi, thực quản, tụy, buồng trứng và tuyến giáp [14], [17], [42], [60], [73] Các tế bào chống lại sự rút ngắn này bằng cách sử

dụng một enzyme phiên mã ngược gọi là telomerase

Ở các loài, các tế bào khác nhau thì chiều dài telomere là khác nhau, chiều dài này phụ thuộc vào loại mô, độ tuổi và lịch sử nhân lên của tế bào Chiều dài telomere hai đầu nhiễm sắc thể thay đổi rõ rệt giữa các nhiễm sắc thể khác nhau (Hình 1.1) Ví dụ NST 17p thường có telomere ngắn hơn so với hầu hết các telomere nhiễm sắc thể khác [58]

Hình 1.1 Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau

Telomere được hiển thị màu vàng, DNA của nhiễm sắc thể hiện màu xanh [53]

Khi tế bào ở trạng thái không phân chia, tức là từ pha G2 trở đi, thì telomere

sẽ liên kết với một số loại protein gắn chuyên biệt lên các trình tự nằm ở ngay gần vùng telomere nhằm tạo nên một cấu trúc phức tạp và vững chắc, được gọi là T-loop Cấu trúc T-loop này đóng vai trò quan trọng bảo vệ đầu mút DNA nhiễm sắc thể khỏi tác động của các enzyme hay các đáp ứng không thích hợp gây nguy hại đến DNA, cũng như hiện tượng dung hợp các đầu mút nhiễm sắc thể hay hiện tượng tái tổ hợp tương đồng giữa các vùng temomere [26]

- Các protein quan trọng liên quan đến duy trì sự ổn định telomere và điều chỉnh chiều dài telomere

Cấu trúc T-loop của telomere liên quan tới các loại protein bám trên mạch: + POT1 (protection of Telomeres-1) khi hình thành cấu trúc T-loop, một đoạn DNA phía dưới vòng cung do DNA uốn lại, sẽ tách ra làm 2 mạch đơn, protein POT1 bám vào mạch 3’, làm nhiệm vụ bảo vệ mạch và ngăn không cho 2 mạch bắt cặp lại với nhau [56]

+ Các phức hợp TRF1 và TRF2 cùng với các protein tương tác với chúng

Hình 1.2 Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere [26]

+ Phức hợp protein TRF1 gồm TRF1, Tankyrase ½, PINX1, Tin2, và POT1, có vai trò trong việc kiểm soát sự tăng chiều dài telomere thông qua việc tiếp nhận

telomerase lên telomere Ngoài ra, còn có các enzyme khác như Ku70/80,

DNA-PK, Bloom helicase [56], [78], [89]

+ Phức hợp protein TRF2 gồm TRF2, phức hợp (MRE11, RAD50, NBS1), WRN, ERCC1/XPF, kết hợp với POT1 ngăn chặn sự bắt cặp giữa các đoạn cuối NST với nhau Ngoài ra, TRF2 còn tương tác với yếu tố phát tín hiệu sửa chữa NST

để bảo vệ telomere khỏi các enzyme sửa chữa [27]

1.1.2 Hoạt động telomerase ở người

Telomerase là ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere đầu cuối của nhiễm sắc thể Chúng hoạt động rất ít ở trong tế bào thường, nhưng hoạt động phổ biến trong các dòng tế bào ung thư người và tìm thấy khoảng 85% các khối u [47], [70] Hoạt động của telomerase chống telomere rút ngắn trong quá trình sao chép bằng cách tổng hợp DNA lặp lại telomeric mới ở đầu cuối nhiễm sắc thể

Telomerase ở người là một phức hệ gồm hTR, hTERT hTR (hoặc hTERC)

(human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human

telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngược, giúp thêm telomeric

lặp đi lặp lại đầu tận cùng nhiễm sắc thể [11], [87] Cả hai hTR và hTERT đều biểu hiện rất thấp ở tế bào thường Protein hTERT bao gồm 1132 axit amin được mã hóa

bởi gen hTERT nằm trên NST 5p15.33 [38], [59], [63] Tổ chức gen hTERT có tổ

chức như sau:

Hình 1.3 Tổ chức gen của hTERT [23]

Gen hTERT ở người gồm 16 exon và 15 intron kéo dài hơn 40 kb [23], nằm

trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 5 (5p15.33), khoảng 2 Mb từ telomere và được

sao chép đến tâm động, miền sao đặc biệt của telomerase (T domain), miền reverse transcriptase (RT domain)

Thành phần RNA của telomerase người có chừng 451 nucleotide (bao gồm

cả telomere CAAUCCCAAUC mẫu), mã hóa bởi gen hTR nằm trên NST 3q21-q28

[30] Trong đó các nucleotide 46-56 là vị trí gắn vào đầu cùng 3’-OH của telomere Dựa trên quan sát thực nghiệm trong các ống nghiệm nuôi cấy tế bào và động vật,

các chất ức chế telomerase có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thư và di căn

không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma [59], [63], [64],

[79] Khối u liên quan đến telomerase reverse transcriptase (hTERT) được biểu

hiện trên 85% khối u ở người [70] Vì vậy kháng nguyên này có thể là một công cụ quan trọng để loại bỏ những tế bào mà không dễ dàng bị giết bởi điều trị thông

thường Việc ức chế hoạt động của telomerase trong các khối u dương tính dẫn đến

telomere rút ngắn và tế bào chết bởi quá trình apoptosis [82]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu hTERT

Ngay sau khi phát hiện nhiễm sắc thể của người có telomere ở 2 đầu, bao gồm trình tự lặp đi lặp lại chuỗi TTAGGG [33], [48] Morin đã xác định được hoạt

động telomerase trong các tế bào của con người Telomerase chỉ hoạt động trong

các tế bào mầm và tế bào ung thư, không hoạt động ở tế bào soma [59], [63], [64], [79] Tuy số lượng tương đối nhỏ các tế bào ung thư được xác định là không thể

hiện hoạt động của telomerase nhưng vẫn duy trì chiều dài telomere [20]

Mặc dù tế bào ung thư cũng sinh ra cùng một mô nhưng không giống như các tế bào bình thường, các tế bào ung thư có thể phân chia vô hạn đến một khối lượng đủ lớn gây nguy hiểm đến bệnh nhân Nghiên cứu nhiều năm qua cho thấy enzyme phiên mã ngược ở người - hTERT có khả năng kích thích miễn dịch trong

cả ống nghiệm và trong cơ thể Do vậy, hTERT có thể là mục tiêu đích điều trị ung thư bằng miễn dịch [82]

Không phải toàn bộ phân tử kháng nguyên nhận diện và liên kết với kháng thể hoặc TCR (T-cell receptor) mà chỉ có 1 phần nhất định của kháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay còn gọi là epitope Nghiên cứu trong nhiều năm qua

đã chứng minh các peptide có nguồn gốc từ hTERT được xử lý tự nhiên của các khối u và trình diện trên phân tử MHC (major histocompatibility complex) và có thể kích thích chức năng phản ứng của CTL (cytotoxic T lymphocyte) Peptide miễn dịch đầu tiên được mô tả từ hTERT là I540 (ILAKFLHWL) được giới hạn trong MHC lớp I alen HLA-A2 Chứng minh độc lập giữa các nhóm cũng thấy rằng TCR (Tế bào lympho T gây độc) đáp ứng miễn dịch với peptide I540 trong ống nghiệm

có tác dụng diệt một loạt các dòng tế bào khối u hTERT+ [31], [85] Trong giai

đoạn gần đây, thử nghiệm đáp ứng miễn dịch hTERT đã được thực hiện ở một số bệnh nhân ung thư vú hoặc ung thư tuyến tiền liệt, và thấy rằng phản ứng miễn dịch

và bằng chứng lâm sàng của các hoạt động chống khối u được quan sát thấy không

có độc tính [84] Trong một thử nghiệm khác, với những bệnh nhân ung thư vú di căn đã được tiêm vacxin dưới lớp da với peptide I540 hTERT được nhũ hóa trong tá dược và đã phân tích cho thấy 68% bệnh nhân đã có phản ứng miễn dịch [88] Ngoài epitope I540 còn có các epitope- hTERT gây độc tế bào lympho T:

Bảng 1.1 hTERT- epitope gây độc tế bào lympho T [8], [83], [85] Epitope Trình tự Phân tử hạn chế

Trên thế giới GV1001 đã được thử nghiệm ở giai đoạn I/II các bệnh nhân ung thư tuyến tụy, ung thư phổi và khối u ác tính đã được chứng minh rằng chủng ngừa là an toàn và gây ra phản ứng miễn dịch ở 50-80% bệnh nhân được tiêm phòng Và GV1001 đang được nghiên cứu thử nghiệm giai đoạn III với ung thư tuyến tụy [10], [15]

1.1.4 Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT

Theo Hội Ung thư Việt Nam, bệnh nhân ung thư các loại đang gia tăng nhanh chóng trong nhưng năm gần đây Mỗi năm có thêm 150.000 người mắc bệnh ung thư Do đó, ung thư là một trong nhưng căn bệnh nan y gây nên tỷ lệ tử vong cao nhất ở nước ta nói riêng và trên thế giới nói chung Vấn đề đặt ra là làm sao tìm kiếm một loại vacxin phòng chống ung thư một cách hiệu quả Một con đường mới

đã mở ra đó là cách phòng bệnh ung thư bằng vật liệu di truyền hay vacxin DNA được phát triển từ sự bùng nổ về công nghệ sinh học khi kỹ thuật DNA tái tổ hợp được đưa vào năm 1970 Vacxin DNA triển vọng sẽ ngăn chặn được căn bệnh thế

kỉ như: HIV, ung thư…, và những căn bệnh lây nhiễm quy mô toàn cầu

Hiện nay, vacxin có thể chia thành 5 loại: vacxin bất hoạt, vacxin sống giảm độc, vacxin tiểu đơn vị (tiểu đơn vị, polysaccharides và tiếp hợp protein), toxoid (biến độc tố) và vacxin DNA [6] Trong đó vaccin DNA có rất nhiều ưu điểm so với các vacxin truyền thống về an toàn, dễ sản xuất và ổn định, Thử nghiệm lâm sàng cũng cho thấy vacxin DNA gây ít tác dụng phụ như mẩn đỏ, sưng tấy, sốt và đau đầu [19] Hơn nữa, nó cũng được nghiên cứu là không gây tích hợp vào hệ gen [50]

Vacxin DNA bao gồm một DNA plasmid có chứa gen mã hóa trình tự của một protein mục tiêu từ một tác nhân gây bệnh dưới sự kiểm soát của một promoter nhân điển hình, cho phép biểu hiện protein trong các tế bào động vật có vú [25] Bước đầu tiên tạo vacxin DNA phải chọn vector plasmid phù hợp, yêu cầu cơ bản là vector DNA plasmid có một promoter nhân chuẩn, một điểm khời đầu sao chép, một chuỗi polyadenylate, một dấu chuẩn chọn lọc [35]

Mặc dù cơ chế miễn dịch của vacxin DNA trong tế bào vẫn chưa rõ ràng, sự gia tăng chậm các phản ứng miễn dịch sau đưa DNA vào cho thấy nó theo một hành trình phức tạp Một plasmid chứa gen biểu hiện protein quan tâm dưới sự kiểm soát của promoter thích hợp được tiêm trực tiếp vào cơ thể qua da hoặc bắp cơ Sau khi plasmid được hấp thụ, protein nội sinh sẽ được sản sinh và một quá trình nội bào sẽ biến nó thành một peptid kháng nguyên Ngoài ra, protein kháng nguyên có thể được tiết ra trong và xung quanh các mô bằng cách protein tiết hoạt tính hoặc giải

phóng sau quá trình apotosis của tế bào chuyển Các peptid này sau đó được đưa tới lưới nội chất Trong lưới nội chất nó được gắn với phân tử MHC-I (hệ thống trình diện kháng nguyên) MHC-I sẽ trình diện peptid kháng nguyên trên bề mặt tế bào Tiếp theo CD8+

- tế bào T kết hợp với phức hệ phù hợp tạo thành CTR (tế bào lympho T gây độc) chúng được gọi là tế bào miễn dịch trung gian CTR kích thích sản xuất Cytokin hoạt hóa tế bào B sản sinh kháng thể Protein ngoại bào được trình diện bởi MHC-II thông qua APC (tế bào trình diện kháng nguyên) được CD4+

- tế bào T nhận biết dẫn đến kích hoạt tế bào B sản sinh kháng thể [50], [71]

Hình 1.4 Cơ chế vacxin DNA [41]

Sự biểu hiện của hTERT trong tế bào ung thư có liên quan sự tăng trưởng, phát triển khối u và sự biểu hiện của hTERT góp phần quan trọng đến sự biến đổi ung thư bằng cách cho phép nhân tế bào lên không giới hạn Ức chế hoạt động của

telomerase trong các tế bào khối u – hTERT hoạt động dẫn đến telomere rút ngắn

và tế bào chết bởi quá trình apotosis [36], [39] Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thư là hướng nghiên cứu triển vọng Tuy nhiên, một trong nhưng mối đe dọa của vacxin DNA là nguy cơ hội nhập trình tự một phần hoặc toàn phần plasmid vào hệ gen của vật chủ Điều đó sẽ dẫn đến đột biết gen, gây bất hoạt gen ức chế khối u hoặc kích thích gen gây ung thư

hoặc gây mất ổn định nhiễm sắc thể Tuy nhiên mối lo ngại trên thực nghiệm thấy rằng tỷ lệ thâm nhập plasmid không đáng kể và thấp hơn so với tỷ lệ tự phát các đột biến trong bộ gen động vật có vú [29] Mối quan tâm nhất đối với vacxin DNA là làm thế nào tăng khả năng hội nhập và duy trì plasmid DNA trước khi biểu hiện trong tế bào Một vấn đề cần quan tâm nữa là tính lạ của DNA, có thể kích thích sản xuất kháng thể chống lại DNA Vì vậy, để tăng cường quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin, cần phải chọn chất truyền trung gian tạo phức với DNA Chitosan là polymer có khả năng gắn kết với DNA và được báo cáo rằng có khả

năng bảo vệ DNA khỏi sự thủy phân của DNase Do vậy, chitosan là chất dẫn

truyền gen hiệu quả Ngoài ra chitosan không độc, có khả năng phân hủy sinh học

nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ [13], [18], [72], [81]

1.2 Tổng quan về chitosan

1.2.1 Giới thiệu chung chitosan

Chitosan là một polysacarit mạnh thẳng, là dẫn xuất deaxetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C (2) Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết β(1-4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucoranose

Chitin là một chuỗi polymer dài bao gồm liên kết β(1-4) deoxy- β-D-glucose (N-acetylglucosamine), một dẫn xuất của glucose [74] Đây là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên sau xenllulo và nó là thành phần chính của thành tế bào của nấm, các khung xương của động vật chân đốt như động vật giáp xác và côn trùng [62]

2-acedamodo-2-Hình 1.5 Cấu trúc của chitin và chitosan [46]

Chitin và chitosan có giá trị kinh tế rất lớn vì chúng có các đặc tính sinh học như: không độc, có khả năng phân hủy sinh học nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trường [13], [18], [72], [81] Ngoài ra chúng còn có đặc tính kháng khuẩn, kháng vius nên chitin và chitosan được ứng dụng rộng rãi trong y học và dược học [44] Ở pH <6.3 chitosan tích điện dương Vì vậy, nó có thể tạo phức hợp với plasmid DNA và chitosan như một vật mang gen hiệu quả [55] Hầu hết các đặc tính đặc trưng của chitosan có liên quan đến trọng lượng phân tử của nó So với chitosan, chitin là vật liệu khó hòa tan, nên ứng dụng rất ít Bằng việc thay đổi nhóm amin cho nhóm hydroxyl đã giúp chitosan hòa tan trong nước và dung môi hữu cơ có thể được cải thiện Trọng lượng phân tử trung bình của chitin là 1,03x106 đến 2,5x106 Dalton nhưng chitosan thương mại có trọng lượng phân tử trung bình dao động từ 3800- 20.000 Dalton và deacetyl hóa là 66-95% Độ tan chitosan phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa, độ PH… Chitosan dễ dàng tan trong các dung dịch loãng hầu hết là các axit hữu cơ như citric, axit tartaric, tan trong một số axit vô cơ [54]

Chitosan là chất rắn, màu trắng ngà, không mùi, không vị, khá ổn định trong các dung dịch kiềm ngay cả ở nhiệt độ cao [46] Chitin không tan trong nước cũng như hầu hết các dung môi hữu cơ Ngược lại chitosan tan tốt trong dung dịch acid

loãng (pH < 6,3) [21] Ở pH < 6,3, chitosan tích điện dương Ngoài ra, chitosan có những tính chất sau:

 Là hợp chất cao phân tử nên trọng lượng phân tử của nó giảm dần theo thời gian do phản ứng tự cắt mạch Nhưng khi trọng lượng phân tử giảm thì hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm không bị giảm đi

 Có thể tạo nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, bột mịn, hạt, màng, tấm xốp, bông, sợi, gel

 Trong phân tử chitosan có chứa nhóm -OH, -NH2 trong các mắt xích acetyl-D-glucosamine có nghĩa chúng vừa có nhóm hydroxyl và nhóm amin nên dễ dàng thay thế bằng các nhóm khác

N- Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer được nối với nhau bởi các liên kết α-(1-4)-glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân

 Hoạt tính sinh học: Vì không có tính kháng nguyên nên chitosan có khả năng tương thích sinh học với các cơ quan, mô và tế bào động thực vật Ngoài ra, chúng

có tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kích thích quá trình làm lành vết thương và đông máu, có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể, có tác dụng

hỗ trợ trong điều hòa miễn dịch, chống loét, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u… [66], [67]

1.2.2 Ứng dụng của chitosan

Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục đích chế tạo những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển hướng đích thuốc trên những tế bào ung thư Một số ứng dụng của chitosan trong các lĩnh vực đời sống như:

Trong lĩnh vực y học, nhờ vào đặc tính không độc, tưong thích với mô cơ thể, tự phân hủy được, nên chitosan được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong kĩ thuật bào chế dược phẩm, làm da nhân tạo chữa bỏng, giảm đau, tá dược ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng Hỗn hợp chitosan-collagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipit, được dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt

khuẩn, chỉ khâu trong phẫu thuật, điều trị suy thận, ung thư, kiểm soát virus AIDS [22], [45]

Trong công nghiệp, chitosan làm chất keo cảm quang, kem dưỡng da, xà phòng dầu gội đầu, nước hoa Trong công nghiệp nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm Trong công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, chất chống oxy hóa, chất bảo vệ lạnh, chất tạo keo, chất phụ gia thức ăn cho cá, làm phụ gia thực phẩm duy trì hương vị tự nhiên, ổn định màu, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau quả tươi, làm trong nước quả ép, giữ màu sắc và hương vị tự nhiên của sản phẩm [9], [80]

Trong nông nghiệp, chitosan làm thuốc tăng trưởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, phân bón, thuốc diệt nấm bệnh cho thực vật, ngăn chặn

sự tăng trưởng và phát triển cây ăn quả, làm bao bì bảo quản các thực phẩm và sản phẩm nông nghiệp [9], [80]

Trong khoa học kĩ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuếch đại của kính hiển vi, xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein, phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm, xác định chì trong mẫu nước Riêng trong công nghệ sinh học chitosan được sử dụng rộng rãi làm vật mang gen và phân phối vacxin DNA [21], [69], [80]

1.2.3 Giới thiệu chung về nano chitosan

Công nghệ nano (nanotechnology) là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nano mét (nm) Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có được đó

là do sự thu nhỏ kích thước và việc tăng diện tích mặt ngoài

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thước nano Hạt nano Chitosan trở thành vật liệu tiềm năng vận chuyển axit nucleic vào tế bào trong liệu pháp gen Hạt nano chitosan với tính năng như tính tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, đặc biệt mang điện tích dương nên có

khả năng thúc đẩy sự hình thành phức hợp với axit nucleic mang điện tích âm [12], [24], [49]

Nano chitosan do có kích thước siêu nhỏ (từ 10 đến 1000 nm) nên dễ dàng đi qua màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều con đường khác nhau như dùng ngoài da, dùng qua đường miệng, qua mũi… Nano chitosan có diện tích và điện tích

bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc, vacxin, vector chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư… Khi sử dụng nano chitosan làm dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo vệ bởi những hạt nano chitosan khỏi sự phân hủy sinh học Do kích thước rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị [81]

Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển chitosan hướng đích thuốc tới những tế bào ung thư Một số công trình tiêu biểu là điều chế hạt chitosan composite với acid polyacrylic để điều khiển và kéo dài thời gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc tới mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi; tạo phức với axit deoxylcholic để dẫn truyền gen [32] Ngoài ra, nano chitosan còn được nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn, ứng dụng trong thực phẩm chức năng [52], [86] Nhiều công trình cũng nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bề mặt hạt nano chitosan vì đây là đặc tính rất quan trọng quyết định hiệu quả gây nhiễm gen, gắn kết các phân tử protein trên hạt nano Tuy nhiên, các kết quả đạt được rất khác nhau

Ở Việt Nam, nano chitosan cũng bước đầu được nghiên cứu, đặc biệt trong ngành thực phẩm chitosan được ứng dụng rất rộng rãi như bảo quản các loại hoa quả, đồ đông lạnh, làm chất phụ gia [3], [4] … Ngoài ra, chitosan là một vật liệu mới tiềm năng làm vật liệu phân phối vacxin DNA, chất hấp thụ trong dẫn truyền thuốc, xử lý môi trường [1], [2], [65]

1.2.4 Chitosan, chất mang dẫn truyền gen

Những hệ thống dẫn truyền gen không virus (non-virus) trong vật liệu gen đã được đề xuất để thay thế những vector virus Chúng làm giảm tối thiểu phản ứng miễn dịch từ vật chủ Hơn nữa, dễ sản xuất với lượng lớn và bảo quản đơn giản Những lợi thế này đã tạo động lực cho sự phát triển của chúng Chitosan- polycation được nhận thấy là chất mang đầy hứa hẹn trong số những hệ thống dẫn truyền gen không virus Chất mang gen polymer nổi lên với hiệu quả chuyển gen, xác định mục tiêu điều trị và khả năng tương thích sinh học tốt

Chitosan là một vector không virus thích hợp cho dẫn truyền gen Tương tác giữa chitosan và DNA là tương tác tĩnh điện [75] Tương tác mạnh đến mức phức chitosan-DNA không bị tách cho đến khi nó vào trong tế bào Chitosan và những

dẫn xuất chitosan tụ lại bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của DNase Những hạt nano

chitosan/plasmid DNA có kích thước từ 20-500 nm nhỏ hơn những hệ thống polymer khác nên thâm nhập vào tế bào thuận lợi hơn cơ chế endocytosis, làm tăng tốc độ gây nhiễm [75], [76]

Những hệ thống dẫn truyền gen dựa trên chitosan cũng có thể gắn thêm ligand để có tương tác tế bào cụ thể như transferrin hoặc galactose [28], [68]

Kết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể sống cho thấy khi hạt nano chitosan/plamid DNA vào trong cơ thể chúng nhanh chóng di chuyển khỏi máu và bám trên những cơ quan khác nhau Kích thước hạt khác nhau thì phân bố trên những cơ quan khác nhau [57], [90] Vì vậy, chitosan là vật liệu thích hợp để dẫn truyền DNA trong sản xuất vacxin DNA

1.2.5 Các phương pháp tạo nano chitosan

Hiện nay, có nhiều phương pháp tạo nano chitosan Phương pháp sử dụng nhiều nhất là tạo gel ion, ưu điểm của phương pháp này là quá trình chuẩn bị đơn giản và không cần sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi trong dẫn truyền thuốc và thực phẩm chức năng [32]

Những yếu tố ảnh hưởng đến tính chất hạt nano chitosan như kích thước hạt

và sự tích điện bề mặt là khối lượng phân tử và độ deacetyl hóa của chitosan Sự lựa chọn phương pháp tổng hợp nano chitosan phụ thuộc vào bản chất của những phân

tử hoạt động cũng như những yêu cầu dẫn truyền khác nhau [32]

Hiện nay có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking), phương pháp giọt tủa/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp tạo gel ion (ionic gelation), phương pháp mixen đảo (reverse micellar) [7], [5]

a) Phương pháp khâu mạch nhũ tương

Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu (w/v) được tạo ra bằng cách phân tán dung dịch chitosan trong dầu Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bề mặt Dung dịch nhũ tương sau đó được khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp như glutaraldehyde Hai nhóm –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –

NH2 của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan

Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương

b) Phương pháp giọt tụ/kết tủa

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch kiềm Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc ethandiamine Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén sau đó được phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano

Hình 1.7 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ

c) Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương lần đầu được sử dụng vào năm 1999 Phương pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa Thay vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kết hợp với các giọt NaOH Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo ra trong paraffin lỏng Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như

trên Khi cả hai hệ nhũ tương được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ

sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ

Hình 1.8 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

d) Phương pháp mixen đảo

Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung môi hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc được thêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch Pha lỏng được giữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ trong suốt Sau đó tác nhân tạo nối ngang được thêm vào và khuấy qua đêm Cô đặc loại dung môi Phần còn lại phân tán lại trong nước Dung dịch muối thích hợp được thêm vào để kết tủa chất hoạt động bề mặt Hỗn hợp được ly tâm, phần dịch trên chứa hạt nano chitosan mang thuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách một giờ Đông cô chất lỏng thu được cho ta bột thuốc

Hình 1.9 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo

e) Tạo gel ion

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và một polyanion như tripolyphosphate Kĩ thuật này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước Đầu tiên chitosan được hòa tan trong dung dịch axit acetic Sau đó, chitosan được trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng Kích thước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng tỷ lệ chitosan và polyanion khác nhau

Hình 1.10 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu và hóa chất

- Trình tự gen mã hóa epitope GV1001 kháng nguyên hTERT được cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào động vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Vector biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3.1(+), chitosan phân tử lượng trung bình (400 kDa)

- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được nhập khẩu từ các hãng Fermentas, Sigma Aldrich, Promega…

2.1.2 Thiết bị

- Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng Công nghệ tế bào động vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Vật liệu, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge ) Sorvall

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Mettler Toledo

Máy làm khô chân không (Speed Vacuum Sc 110A) Savant

Máy chụp ảnh Gel – Doc Applied BioSciences

Cân phân tích (Analytic balances) Mettler Toledo

Cân điện tử (Electronic balances) Ohaus

Máy lắc (Shaking Incubator) Gyromax 737R Amerex

Instrument

Kính hiển vi điện tử quét (SEM) S-4800, Hitachi

2.1.3 Môi trường và dung dịch

2.1.3.1 Dung dịch tách chiết DNA plasmid

- Dung dịch III: Đệm acetate kali 3 M, pH 5,5

- Dung dịch phenol: chloroform: isomylalcohol (25:24:1)

2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB, thành phần cho 1 lít)

Cao nấm men 5 g

Trypton 10 g

NaCl 5 g

Đối với môi trường thạch, cần bổ sung 1,5% agarose

2.1.3.3 Dung dịch dùng cho điện di DNA

- Dung dịch đệm điện di TAE 50X

Tris base 121 g

Acid acetic glacial 28,6 mL

EDTA 0,5M pH 8,0 50 mL

Nước khử ion vừa đủ 500 mL

- Ethidium bromide dung dịch gốc: 10 mg/mL

Hòa 1g ethidium bromide vào 100 mL H2O Quấy vài giờ bằng máy khuấy

từ cho tan đều Giữ dung dịch trong lọ tối ở nhiệt độ phòng Khi dùng pha 20 µL dung dịch gốc trong 100 mL đệm TAE 1X

- Đệm tra mẫu DNA (loading Buffer)

Tris HCl 1M pH 8,0 1 mL

EDTA 0,5M pH 8,0 0,2 mL

Glycerol 2 mL

Bromphenol blue 1% 2 mL

2.1.3.4 Gel agarose 1%

Cân 1 g agarose pha trong 100 mL dung dịch đệm TAE 1X rồi đun trong lò

vi sóng khoảng 2 phút, lắc nhẹ cho tan đều Để nhiệt độ xuống khoảng 50oC rồi đổ

ra khay điện di

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+)

Sau khi thu nhận được 2 đoạn oligonucleotit hTERTF và hTERTR chúng tôi tiến hành tạo đoạn gen hTERT gồm:

hTERTF: 10 µl hTERTR: 10 µl

H2O : 10 µl Biến tính ở 96oC trong 5 phút, để ở nhiệt độ phòng Bảo quản dung dịch thu

được có chứa đoạn gen hTERT ở - 4oC

 Nguyên tắc tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+)

Đoạn gen hTERT được tổng hợp có trình tự enzyme cắt hạn chế ở hai đầu: BamHI và XbaI Trong khi đó vector pcDNA3.1(+) cũng có hai trình tự enzyme hạn

chế này Sau khi pcDNA3.1(+) được xử lý bằng 2 enzyme này sẽ thu được vector

mở vòng Do vậy, đoạn gen mã hóa hTERT có thể được tích hợp vào vector pcDNA3.1(+) nhờ xúc tác của enzyme T4 DNA ligase

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tích hợp gen mã hóa hTERT vào vector

pcDNA3.1(+) Thành phần Thể tích (µl)

2.2.2 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn

Thành phần phản ứng cắt vector pcDNA3.1(+) bằng enzyme giới hạn:

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+) bằng enzyme BamHI và

XbaI Thành phần Thể tích (µl)

kiểm tra khả năng bảo vệ DNA của hạt nano chitosan với enzyme DNase I Thành

phần cắt phức hệ nano chitosan/plasmid DNA và plasmid thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt plamid DNA bằng enzyme DNase I

Thành phần Thể tích (µl)

DNA trong gel agarose được phát hiện bằng cách nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và được phát hiện dưới đèn chiếu tia UV

2.2.4 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose

Đề tài sử dụng kit thu đoạn DNA từ gel agarose của hãng Fermentas (Mini QIAGEN) Cách tiến hành:

- Mẫu DNA sau khi điện di trên gel agarose được soi dưới ánh sáng tử ngoại và cắt thu băng kích thước quan tâm

- Xác định trọng lượng miếng gel đã cắt

- Bổ sung đệm QG tỷ lệ 3:1 với gel đã cắt

- Ủ ở 50oC, 10 phút, trong quá trình ủ đảo 2, 3 lần

- Bổ sung isopropanol thể tích 100 µl/100 mg gel đã cắt, đảo đều

- Chuyển dịch sang cột, spin và ly tâm tốc độ 12000 v/ph trong 1 phút, loại dịch

ly tâm

- Bổ sung 0,5 ml đệm QG và ly tâm 1 phút

- Rửa cột bằng 0,75 ml đệm PE và ly tâm trong 1 phút Loại dịch ly tâm và ly tâm thêm 1 phút

- Dùng 30-50 µl nước tinh khiết để thu DNA vào ống eppendort mới

2.2.5 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E coli

- Bổ sung 60 µL CaCl2 0,1 M + 30 µl glycerol 60%

- Giữ trên đá ít nhất 1 giờ trước khi biến nạp

Biến nạp:

- Bổ sung 5 µL DNA plasmid vào ống tế bào khả biến, để trên đá trong 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42oC trong 30 giây

- Bổ sung 0,5 mL môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 v/ph, ở 37oC trong 1 giờ

- Cấy trải 0,2 mL dịch nuôi cấy trên môi trường LB đặc

- Ủ đĩa cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm

2.2.6 Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pcDNA3.1 (+) đã tích hợp gen mã hóa hTERT

 Nguyên tắc

Vector pcDNA3.1(+) có chứa trình tự gen mã hóa kháng ampicillin nên vector này có khả năng phát triển được trên môi trường có chứa ampicillin Như vậy, sau khi nuôi cấy trong môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin, khuẩn lạc mọc thu được có khả năng mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT

 Tiến hành

- Sau khi biến nạp plasmid vào E coli, trải 150 µL dịch tế bào lên môi trường LB

đặc (trong đĩa petri) có bổ sung ampicillin, sau đó ủ đĩa petri ở 37oC trong 16 giờ

- Lựa chọn các khuẩn lạc nuôi cấy tiếp tục trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin qua đêm, sau đó thu sinh khối để tách plasmid

2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

a) Nguyên tắc:

Các tế bào E coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha dừng thì được ly tâm

thu cặn Màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt DNA của

E coli, protein được loại bỏ bằng cách chiết mẫu với dung dịch phenol:

Chloroform: isoamylalalcohol DNA plasmid tinh sạch sau đó được thu lại nhờ ly tâm

- Các dung dịch chuẩn bị gồm có: dung dịch I, dung dịch II, dung dịch III, dung dịch phenol: Chloroform: isoamylalalcohol (25:24:1)

b) Tiến hành

- Thu 1,5 mL dịch tế bào nuôi cấy qua đêm ở 37oC trên môi trường LB lỏng

- Ly tâm huyền dịch thu tế bào với tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 1 phút, thu cặn

- Bổ sung 150 µL Sol I (Tris HCl 50 mM PH 8.0; EDTA 10 mM PH 8.0), đảo nhẹ

- Bổ sung tiếp 150 µL Sol II (200 mM NaOH; SDS 1%), đảo nhẹ