Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm, Sinh học, Allicin, Tỏi Việt Nam, Thụ thể Dectin -1

MỞ ĐẦU Các nghiên cứu gần đây đã công bố Allicin: Có khả năng chống viêm nhiễm mạnh, tăng cường hoạt tính của các tế bào trong quá trình thực bào, tăng cường hoạt tính của các tế bào gi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HOÀNG LAN QUỲNH

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALLICIN TÁCH TỪ TỎI VIỆT NAM TRONG QÚA TRÌNH ĐIỀU HÒA ĐÁP ỨNG VIÊM THÔNG QUA

THỤ THỂ DECTIN-1

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HOÀNG LAN QUỲNH

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALLICIN TÁCH TỪ TỎI VIỆT NAM TRONG QÚA TRÌNH ĐIỀU HÒA ĐÁP ỨNG VIÊM THÔNG QUA

MỞ ĐẦU

Các nghiên cứu gần đây đã công bố Allicin: Có khả năng chống viêm nhiễm mạnh, tăng cường hoạt tính của các tế bào trong quá trình thực bào, tăng cường hoạt tính của các tế bào giết tự nhiên, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, ức chế sự phát triển của những tế bào ung thư [28, 44] Rất nhiều công bố và các công

ty trên thế giới đã sản xuất Allicin từ việc tạo quá trình xúc tác giữa Alliin với enzym allinase có sẵn trong tỏi Bằng việc sử dụng Allicin chiết xuất từ Alliin có sẵn trong tỏi, các công ty trên thế giới đã sản xuất được rất nhiều loại thực phẩm chức năng cao cấp với nhiều tác dụng sinh học quí

Dựa vào những tín hiệu của thụ thể Dectin-1, một số hợp chất tách chiết từ thực vật đã được chứng minh có khả năng điều hòa được đáp ứng viêm và điều trị hiệu quả chuột bị nhiễm khuẩn nặng và choáng nhiễm trùng Chẳng hạn, các chất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc như Rb1, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) đã được công bố

có khả năng điều hòa các tín hiệu viêm như cytokine, quá trình phosphoryl hóa MAPK (mitogen activated protein kinase), phản ứng oxy hóa (ROS) thông qua tín hiệu của thụ thể Dectin-1 Tuy nhiên, các chất này có nguồn gốc từ nhân sâm nên rất đắt Do vậy, việc tìm kiếm các chất có hoạt tính dược học đối với khả năng chống viêm vẫn đang là vấn đề cấp bách để có thể thay thế một số thuốc đang sử dụng hiện nay, cũng như góp phần làm giảm bớt tỷ lệ tử vong và giá thành điều trị của bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng

Tuy nhiên, kể cả trên thế giới và trong nước chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào đánh giá vai trò của Allicin đối với con đường tín hiệu thụ thể Dectin-1 trong quá trình điều hòa những phản ứng viêm quá mức ở vật chủ Đặc biệt, Việt Nam là một quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, lượng dân số vào loại cao nhất thế giới nên khả năng mắc các bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng do viêm (inflammation) là rất cao Cho đến nay, thì nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU) Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng

khắp trên cả thế giới Với thực trạng hiện nay, thị trường trong nước vẫn chủ yếu là thuốc nhập ngoại, giá thành rất đắt và luôn bị phụ thuộc vào các công ty nước ngoài trong khi đó Việt nam lại có một tài nguyên vô cùng đa dạng về thực vật mà khả năng ứng dụng vào dược học là vô cùng phong phú Ngoài ra việc sử dụng thuốc một cách tự ý đặc biệt là kháng sinh để chống các bệnh nhiễm trùng vẫn đang là một vấn đề cần được giải quyết Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp và tá dược chữa bệnh là một vấn đề cần thiết và cấp bách để điều trị hiệu quả quá trình viêm hệ thống, và sẽ hỗ trợ cải thiện được khả năng điều trị của bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi

tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu vai trò của Allicin tách từ tỏi Việt Nam trong quá trình điều hoà đáp ứng viêm thông qua thụ thể Dectin – 1”

- Có qui trình sản xuất Allicin từ tỏi

- Xác định đƣợc chức năng điều hòa quá trình đáp ứng viêm của Allicin tổng hợp từ Alliin trong tỏi

- Đánh giá đƣợc hiệu quả của Allicin trong quá trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ

Miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng là hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ quan trọng đối với các động vật có xương sống Miễn dịch đáp ứng bẩm sinh có vai trò như hàng rào bảo vệ đầu tiên nhưng lại không có khả năng nhận dạng lập lại các mầm bệnh và trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh dựa vào chọn lọc một vùng cụ thể nhờ vô số các tế bào lymphocyte mang rất nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch có thể nhận dạng bất kỳ kháng nguyên bên ngoài xâm nhập vào cơ thể Hệ thống miễn dịch bẩm sinh sử dụng vô số các thụ thể để nhận dạng và đáp ứng tới những mầm bệnh trong giai đoạn ban đầu của cơ thể Quá trình nhận dạng mầm bệnh của các thụ thể có một vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu tới những đáp ứng viêm, sản xuất những tế bào hiệu quả mới tham gia vào quá trình viêm cục

bộ và bắt đầu những đáp ứng của quá trình miễn dịch đáp ứng Vô số các thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1

và các thụ thể scavenger quyết định tới khả năng sống xót của vật chủ bằng quá trình nhận dạng những mẫu phân tử ở trên mầm bệnh như vi khuẩn, virut, nấm có cấu trúc giống như trên các thụ thể riêng biệt được gọi là PAMP (pathogenic associated molecules pattern) Quá trình nhận dạng mầm bệnh bằng quá trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh ra cytokine, chemokine tiền viêm, và thậm trí là kích thích quá trình ban đầu của miễn dịch đáp ứng

1.2 KHÁI NIỆM VIÊM

Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay là những tế bào bị hỏng Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi Khi phản ứng viêm xảy ra, nhiều loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm nhờ các loại tế bào di chuyển (migrating cells ) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa nhân , các tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào này giải phóng ra hàng loạt các chất trung gian, phần lớn

là các chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu và interleukin-1 Các chất này lại tiếp tục hoạt hoá các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein nhờ các proteinase, các interleukin, yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), các superoxide, H+, hydroperoxide gây ra tổn thương mô, qua đó khép kín quá trình viêm mạn tính Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng Một vài chất tiết ra làm hẹp dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng Khi quá trình viêm kéo dài sẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do qúa trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan

và tử vong [25]

1.3 NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG NHIỄM TRÙNG

Nhiễm trùng có thể được định nghĩa như một phổ của những điều kiện lâm sàng gây ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân tới quá trình nhiễm trùng mà được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [6,7,8] Các bệnh nhân mắc nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7] Thời kỳ đầu sẽ biểu hiện những đáp ứng viêm ồ ạt tới quá trình nhiễm trùng Hầu hết, đó là các cytokine tiền viêm như TNF, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12, và interferon gamma (IFN gamma) Sau đó, cơ thể sẽ điều hòa những đáp ứng này bằng sản xuất những cytokine kháng viêm (IL-10), các chất ức chế của thụ thể TNF, thụ thể IL-1 loại II, và IL-1RA (một dạng bất hoạt của IL-1) [12] Các lớp đáp ứng viêm hệ thống của vật chủ được bắt đầu bằng một số sản phẩm vi khuẩn Những sản phẩm vi khuẩn (vi khuẩn gram âm bao gồm nội độc tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố và proteases; các vi khuẩn gram dương như ngoại độc

tố, các siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A của streptococcal pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) và một số chất của vỏ tế bào nấm (zymosan được phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết các thụ thể trên macrophage của

vật chủ và kích hoạt những protein điều hòa (yếu tố nhân Kappa B (NFқB)) [12] Chẳng hạn, thụ thể Toll like 4 (TLR4) nhận dạng LPS, còn thụ thể Dectin-1 nhận dạng đối với zymosan [8,15] Sau đó, các thụ thể chuyển tín hiệu vào tế bào Hiệu quả tích lũy của những lớp viêm hệ thống này dẫn tới trạng thái mất cân bằng, cùng với quá trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng

và choáng nhiễm trùng, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [25, 21]

Hình 1: Bệnh nhân bị shock do nhiễm trùng

Bé T.T.T.P (11 tuổi, ngụ tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu) được cấp cứu trong tình trạng shock do nhiễm trùng

1.4 MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm vô số các thành phần khác nhau để chống lại quá trình xâm nhập của vi sinh vật Thứ nhất, các chức năng của hàng rào biểu bì của cơ thể có thể cản trở quá trình gây viêm nhiễm của mầm bệnh Thứ hai, các tế bào và các phân tử kiểm soát hoặc phá hủy các mầm bệnh mà có thể trốn thoát khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên trong Thứ ba cũng là hàng rào quan trọng nhất của hệ thống bảo vệ miễn dịch bẩm sinh đó là các mô của tế bào macrophage truyền tín hiệu bảo vệ tế bào ở các vùng ngoại biên và hệ thống bổ thể của protein truyền tín hiệu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh dưới dạng dịch nằm giữa khoảng không của mô và máu Quá trình nhận dạng bằng hệ thống miễn dịch

sẽ loại bỏ các mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số cơ chế hiệu quả khác nhau Hệ thống miễn dịch bẩm sinh có thể xem như có vai trò quan trọng nhất trong quá trình viêm nhiễm

1.4.1 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs)

1.4.1.1 Định nghĩa: Thụ thể là những protein biệt hoá để tiếp nhận các phân tử hoá

học nội sinh (ligans) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất)

1.4.1.2 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh

Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) được chia làm ba nhóm chính bắt nguồn từ vị trí trong tế bào đó là: Thụ thể huyết thanh hoặc phần dịch của mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm trên màng hoặc trong dịch

tế bào được xem là thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19] Mỗi nhóm thụ thể PRR có các phối tử đặc hiệu của chính mình để có thể nhận dạng một loại vi sinh vật nhất định [19] Các thụ thể này có thể nhận dạng mầm bệnh một cách trực tiếp (không thông qua opsonin) hoặc gián tiếp (thông qua oposonin) [19] Đối với In vivo, nhiều thụ thể có thể tham gia để nhận dạng vi khuẩn thông qua đa phản ứng ở đa vị trí Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn được nhận bằng PRR giống như thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể 3 (CR3), và dectin-1 [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh của PRR kích thích quá trình sản xuất cytokine và chemokine dẫn tới

quá trình hoạt động và sinh ra các tế bào khác tham gia tới vị trí đang trong quá

trình bị viêm nhiễm Từ đây, dẫn tới những phản ứng của miễn dịch đáp ứng [12]

Hình 2: Các thụ thể RRP đối với nấm có thể nhận dạng ra phần cacbon Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 và TLR6, CR3, dectin-1 nhận dạng β-glucans

Những đoạn TIR có chứa các phân tử tiếp nối giống nhưng giống như yếu tố phân chia tế bào 88 (MyD88), protein nối tiếp có đoạn TIR (TIRAP), một đoạn TIR có chứa phần interferon-β (TRIF), và phân tử tiếp nối với TRIF (TRAM) [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh của TLR2 sẽ kích thích quá trình hoạt động của yếu tố hoạt động nhân tế bào là NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), và sản xuất ra các cytokine tiền viêm như tumor necrosis factor, TNF-α thông qua đoạn TIRAP và đoạn MyD88, nhưng quá trình nhận dạng của TLR4 lại kích thích hoạt động của NF-κB thông qua TIRAP, MyD88 và kích thích hoạt động của đoạn phiễn mã của interferon (IFN) giống như quá trình sản xuất IFN kiểu 1 [30]

1.4.1.4 Thụ thể Dectin-1

Quá trình nhiễm nấm đã kích hoạt quá trình hoạt động ban đầu của các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh trong động vật có vú thông qua các cơ quan cảm ứng đối với quá trình nhiễm trùng [16] Chất β-glucan là một thành phần quan trọng trong vỏ của tế bào của nấm Tế bào có thể nhận ra được thành phần này khi xâm nhập đó là nhờ vào sự hoạt động của thụ thể Dectin-1 Thụ thể này nằm trên màng tế bào có một đoạn kiểu C lectin gắn với loại màng kiểu II và có một đoạn bên trong cytoplasma của tế bào cùng với một phần hoạt động dựa vào thụ thể miễn dịch tyrosine [8]

Thụ thể Dectin-1 được biểu hiện trên các dòng tề bào monocyte, macrophage, tế bào trung tính, và tế bào tua [16] Dectin-1 được chứng minh có vai trò quan trọng trong nhận dạng nấm, đặc biệt là các thành phần giàu β-glucan [43] Khi thụ thể Dectin-1 liên kết với phối tử đặc hiệu sẽ truyền tín hiệu vào nhân tế bào và dẫn tới sản sinh ra cytokine, chemokine, quá trình oxy hóa (ROS) và quá trình Nito hóa (RNS) kích thích tăng cường khả năng thực bào của cơ thể [43] Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu khoa học đã công bố vai trò của Dectin-1 trong quá trình sản xuất cytokine tiền viêm để ức chế sự phát triển của Mycobacterium tuberculosis [36] Hơn nữa, dựa vào những tín hiệu của thụ thể Dectin-1, một số hợp chất tách chiết từ thực vật đã được chứng minh có khả năng điều hòa được đáp ứng viêm và

điều trị hiệu quả chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng Chẳng hạn, các chất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc như Rb1, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) đã được công bố có khả năng điều hòa các tín hiệu viêm như cytokine, quá trình phospho hóa yếu tố tự phân bào (MAPK (mitogen activated protein kinase)), phản ứng oxy hóa (ROS) thông qua tín hiệu của thụ thể Dectin-1 [24]

1.4.1.5 Thụ thể Dectin-1 hoạt động cùng với TLR2 để nhận dạng các phối tử

có nguồn gốc từ vi sinh vật

Zymosan là một hợp chất mà lượng β-glucan trong thành tế bào của

Saccharomyces cerevisiae chiếm phần chính [8,16] Thành phần của zymosan có

β- glucan, mannan, và chitin Thành phần này được nhận dạng bằng một số thụ thể chẳng hạn như TLR2, TLR6, Dectin-1, thụ thể mannose, và CR3 [16, 45] Chất này

đã được chứng minh là kích thích quá trình đại thực bào và quá trình viêm cả ở in

vivo và in vitro [16]

Dectin-1 hoạt động cùng với một số TLR để nhận dạng ra nấm [16] Thụ thể

này cùng với TLR2, Dectin-1 nhận dạng ra zymosan hoặc nấm Candida albicans

truyền tín hiệu điều hòa hoạt động của yếu tố nhân kích hoạt tế bào T (NFAT)

và quá trình sản xuất interleukin (IL)-2, IL-10, và IL-12 p70 trong tế bào dendritic [16,29] Dectin-1 cũng tham gia vào quá trình thực bào, hoạt động của yếu tố tự phân bào (ERK)1/2 (extracellular signal-regulated kinase), và quá trình

sản xuất các cytokine tiền viêm cùng với TLR2 để nhận dạng ra Mycobacterium

abscessus [16] Hơn nữa, Dectin-1 tham gia cùng với TLR2 và TLR4 trong đáp

ứng miễn dịch bẩm sinh tới nhận Mycobacterium ulcerans để kích thích sinh ra gốc

oxy hóa (ROS) và sản xuất ra chemokines và IL-37 trong kerainocyte của người

Do vậy, Dectin-1 thực hiện một vai trò hoạt động giống như một thụ thể chính

nhận dạng ra quá trình nhiễm nấm và mycobacterium [16]

Hình 3: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác cùng TLR để nhận dạng nấm

Dectin-1 nhận dạng ra nấm để sinh ra quá trình enzyme kinsase của tyrosine ở lách (Syk) và một đoạn protein caspase 9 (CARD)9 CARD9 tác động cùng với B-cell lymphoma-10 (Bcl-10) và vùng phiên mã gen 1 của lympho (MALT1) để kích thích tạo ra ROS và quá trình hoạt động của NF-κB Quá trình biểu hiện của Dectin-1 expression tăng cường quá trình sản xuất cytokine trong sự

có mặt của TLR2 và TLR6

1.4.1.6 Glucocorticoid

Glucocorticoid đã được sử dụng như một chất chống viêm cùng với rất nhiều cơ chế trong quá trình hoạt động của nó [17] Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh glucocorticoid có thể điều hòa được chức năng của các tế bào viêm, đặc biệt là quá trình phiên mã của các gen sinh cytokine [11] Hơn nữa, glucocorticoid có thể

ức chế quá trình sản xuất các cytokine tiền viêm như TNF-α, IL-6, IL-1, và làm giảm quá trình tiết gốc nito và quá trình hoạt hóa các yếu tố mô trong tế bào macrophage [23,39,40] Do vậy, glucocorticoid đã được sử dụng trong điều trị một

số bệnh viêm nhiễm và các bệnh mẫn cảm miễn dịch Hơn nữa, chúng có tiềm năng vô cùng to lớn trong hoạt động kháng viêm và giảm quá trình miễn dịch không có lợi cho cơ thể [9,17,22]

Nhìn chung, quá trình viêm hệ thống mất kiểm soát được xem như là các đặc trưng của nhiễm trùng, của triệu chứng viêm cấp tính đường hô hấp Một chất được biết đó Hydrocortisone, là một glucocorticoid, có thể làm giảm đi đáng kể mức plasma của protein C, phospholipase A2, và loại bỏ bớt các tế bào neutrophil trong các bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [23,41] Những nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra chất này có thể điều hòa hầu hết các cytokine tiền viêm [11], bao gồm ức chế các cytokine có vai trò quan trọng trong miễn dịch bẩm sinh

và nhiễm trùng [23] Hiệu quả của glucocorticoid đã được chứng minh trong các

bệnh nhiễm trùng nặng như nhiễm vi khuẩn meningitis, pneumocystis pneumonia,

typhoid fever, và những trường hợp nhiễm H5N1 [11]

1.4.1.7 ROS

ROS (reactive oxygen species) là một đại diện nhỏ của phản ứng oxy hóa, bao

gồm superoxide (O2-) anion, hydrogen peroxide (H2O2), peroxyl (ROO-) radical, acid (HOCl), ozone (O3) [14] ROS được tạo ra thông qua một loạt các phản ứng

mà bắt đầu bằng quá trình tạo ra superoxide [14,10] Quá trình tạo ra ROS trong

sinh lý được xem như sản phẩm phụ xảy ra trong mitochondria, cytochrome P-450,

và các yếu tố tế bào khác [25] ROS có thể tương tác cùng với vô số phân tử, bao gồm những phân tử hữu cơ nhỏ, protein, lipid, carbohydrate và nucleic acid [14]

Thông qua những tương tác, ROS có thể gây ra thảm họa hoặc làm thay đổi chức năng của phân tử đích [14] Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidases (Nox) cũng tạo ra ROS [10] Thực ra, ROS tham gia trong các

cơ chế truyền tín hiệu kích thích liên quan tới khả năng miễn dịch và quá trình viêm [14] ROS kích thích hoạt động của NF-κB Ví dụ, quá trình sản xuất của TNF-α được điều hòa bằng con đường NF-kB được kích hoạt bởi ROS trong tế bào Kuffer, macrophage ở trong gan [27] Hơn nữa, ROS có thể điều hòa hoạt động activator protein-1 (AP-1) (một yếu tố tham gia trong quá trình viêm) thông qua nhiều cơ chế khác nhau [31]

1.4.1.8 Vai trò của đại thực bào trong đáp ứng viêm

Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống Vai trò chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, chúng còn đóng vai trò các

tế bào trình diện kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể

Do đóng vai trò quan trọng trong quá trình thực bào của cơ thể, đại thực bào có liên quan đến một số tình trạng bệnh lý do miễn dịch Ví dụ các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm mạnh, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh lý của các hội chứng này Các cytokine chính được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố họai tử khối u TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, nitric oxide (NO) vàc các phân tử dính kết tế bào dẫn đến làm tăng qúa trình viêm Như vậy , việc kiểm soát sản xuất các chất này có thể làm giảm khả năng viêm Macrophage là tế bào có kích thước tương đối lớn và có khả năng đáp ứng nhanh với các kích thích viêm tạo ra bởi Zymosan Ngoài ra , các TLR ở macrophage được biểu hiện mạnh hơn so với các tế bào bạch cầu khác (Hình 4) nên nó thường được lựa chọn trong các mô hình sàng lọc và nghiên cứu cơ chế

kháng viêm in vitro

Hình 4: Biểu hiện của các thụ thể ở các tế bào bạch cầu

1.5 Mô hình nghiên cứu viêm thực nghiệm in vivo sử dụng Zymosan

Khả năng kháng viêm của một chất nghiên cứu, đặc biệt là sau bước sàng lọc in

vitro, chỉ được khẳng định khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật thực

nghiệm Đối với chất kháng viêm, các nghiên cứ u thường sử dụng chuột vì hệ gen chuột và người có mức độ tương đồng khá cao (85%) [18] Ngoài ra, sử dụng chuột

sẽ ít tốn kém và dễ thực hiện hơn so với các động vật thực nghiệm khác Các nghiên

cứu trước đây thường sử dụng trực tiếp các mô hình gây viêm thực nghiệm in vivo

để sàng lọc và nghiên cứu cơ chế kháng viêm của chất cần nghiên cứu Các mô hình này thường là: i) sử dụng carrageenan, một polysaccharide tách từ tảo đỏ, để gây viêm ở chân chuột (caageenan- induced hind paw edema) trong điều kiện có mặt

và vắng mặt của chất cần nghiên cứu và sau đó so sánh thể tích bàn chân viêm với đối chứng [48, 49]; ii) gây viêm xoang bụng (peritroneal inflammation ) bằng cách tiêm carrageenan vào bụng chuột trong điều kiện có mặt và vắng mặt của chất

nghiên cứu Lượng dịch viêm tiết trong xoang bụng chuột sẽ được thu lại và so sánh với đối chứng về thể tích cũng như lượng bạch cầu và protein trong dịch [15]; iii) gây viêm mạn tính (chronic nflammation) bằng cách tiêm carrageenan vào phần cơ chuột trong điều kiện có mặt và vắng mặt của chất nghiên cứu để tạo khối u Sau đó khối u được lấy ra để đo trọng lượng khô so với mẫu đối chứng [32] Hiện nay, mô hình gây viêm thực nghiệm sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới gọi là shock nội độc tố (endotoxin shock model) thường sử dụng zymosan của nấm (một tác nhân gây viêm mạnh) để gây viêm cấp và viêm đặc hiệu với thụ thể Dectin-1 cần nghiên cứu [26, 34] Ở mô hình này, chuột sau khi được gây viêm sẽ được tiêm chất nghiên cứu Hàm lượng các chất trung gian tiết ra trong quá trình tiền viêm cũng như những yếu tố tham gia vào các con đường tín hiệu viêm được theo d i và đánh

giá, ví dụ như cytokine, chemokine tiền viêm (TNF-a; IL-6, IL-8) và kháng viêm(IL-10), interferon, quá trình phospho hóa các yếu tố tự phân bào protein

kinase (MAPKs), hay phản ứng ôxy hóa Từ đó tác dụng của chất nghiên cứu được

khẳng định Với mô hình in vivo này, việc đánh giá tác dụng của chất kháng viêm sẽ

có hệ thống, chính xác và chi tiết hơn ở mức phân tử

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.6.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính gồm:

1.6.1.1 Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID)

Đại diện cho nhóm này là aspirin, ibuprofen và naproxen Cơ chế kháng viêm của NSAID được phát hiện là do chúng ức chế sự tổng hợp PG Đích tác dụng được biết rõ nhất của các chất này là cyclooxygenase (COX), là enzym có vai trò chuyển hóa axit arachidonic thành prostaglandins (PG) và thromboxane (TX) Một số NSAID lại có khả năng ức chế enzym liên quan đến sự bào mòn màng nhày dạ dày Nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh các chất NSAID này có tác dụng ức chế sự hình thành PG ở màng nhày dạ dày Tuy nhiên, salysilate, một chất kháng viêm thuộc nhóm này cũng có tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp của PG nhưng lại không làm bào mòn màng nhày dạ dày như aspirin Lý do tại sao lại có sự khác nhau về cơ chế tác

dụng giữa aspirin và salisylate là vấn đề chưa giải thích được [46]

1.6.1.2 Các chất kháng viêm có bản chất steroid

Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vòng 4 cycloalkane Thuộc về nhóm chất này có các chất corticoid Chúng tác dụng thông qua ức chế enzyme phospholipases A2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phospholipase A2 thành axit arachidonic Như vậy , cuối cùng thì corticoid cũng ức chế sự sinh tổng hợp của PG , TX và LT Các chất kháng viêm có bản chất steroid

ức chế phospholipase A2 một cách gián tiếp thông qua việc giải phóng các chất ức chế protein có tên gọi là macrocortin, lipomodulin hay renocortin có khối lượng phân

tử đạt khoảng 15, 30 và 40 kDa Đại diện nhóm chất này là lipocortin đã được tinh sạch, thương mại và được xem là một trong những chất kháng viêm mạnh [46] Các chất có bản chất steroid thường là phối tử của thụ thể glucocorticoid

1.6.1.3 Các chất khác

Thuộc về nhóm này có vàng và colchicine Trong trường hợp của colchichine, chất này ức chế sự hình thành tinh thể urate trong khớp của bệnh nhân gout thông qua việc làm giảm sự tiết các chất chemotaxis của bạch cầu đa nhân và giải phóng enzyme lysosom Colchicine có tác dụng ức chế đặc hiệu sự giải phóng một glycoprotein có trọng lượng phân tử 8400 Da Đây là một chất chemotaxis của bạch cầu đa nhân đối với các bạch cầu trung tính và monocytes có khả năng thực bào các thể urate [46]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm nên khả năng mắc các bệnh nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn do viêm là rất cao Cho đến nay, viêm nặng và choáng do viêm vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp cả trên thế giới và Việt Nam Trong nhiều trường hợp , quá trình bị viêm kéo dài mà không được điều trị kịp thời còn dẫn đến những bệnh mạn tính nguy hiểm như tim mạch, tiểu đường, thấp khớp…

Việt Nam cũng là nước có nguồn tài nguyên sinh vật rất phong phú, đặc biệt

về thực vật Theo thống kê của Viện Dược liệu thì tính đến năm 2000, nước ta có gần 4000 loài thực vật, 22 loài tảo và trên 33 loài động vật được dùng làm thuốc

ở các mức độ khác nhau, đó là chưa kể đến nhiều loài tảo biển và động vật biển cũng có thể được dùng làm thuốc [2] Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam có thể sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc

để tìm ra những chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất chống viêm mới có hiệu quả cao mà không gây ra các phản ứng phụ Tuy vậy, có thể nói các nghiên cứu khoa học một cách có hệ thống và chi tiết về điều tra, khai thác, đánh giá tác dụng và sử dụng các chất hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên sinh vật trong nước để phát triển thành các sản phẩm thuốc mới, phục vụ cho bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng còn rất hạn chế

Trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng viêm, có thể nói rằng chúng ta chưa có các nghiên cứu sâu cũng như chưa có các hệ thống và mô hình nghiên cứu hiện đại về quá trình viêm và tác dụng của chất chống viêm Đây chính là cơ sở để phát triển các sản phẩm thuốc có thể thương mại được trên thị trường Việt Nam và quốc tế Các nghiên cứu về viêm được thực hiện chủ yếu ở Viện Dược liệu Trung ương, các trường Đại học Dược, trường Đại học Y Hà Nội và Học viện Quân y 103 Các nghiên cứu ở những cơ sở này mới chỉ dừng ở mức tạo

được mô hình gây viêm thực nghiệm in vivo cổ điển như đã trình bày ở trên Cụ thể

là các thí nghiệm được thực hiện trên chuột thông qua sử dụng chất gây viêm carrageenan để tạo mô hình viêm cấp dưới hình thức gây phù bàn chân chuột và gây viêm màng bụng chuột sau khi tiêm chất gây viêm này Việc gây viêm mãn tính sử dụng chất amiant để tạo u hạt trong cơ thể chuột Việc đánh giá tác dụng kháng viêm được thực hiện bằng cách đo thể tích bàn chân, đo thể tích dịch viêm ổ bụng, đo trọng lượng khối u hạt tách ra, đếm số lượng bạch cầu so với mẫu đối chứng, từ đó đánh giá tác dụng kháng viêm của các chất nghiên cứu Ngoài ra, việc đánh giá tác dụng kháng viêm cũng chủ yếu được thực hiện với các cao chiết thô của thực vật

Điển hình như các nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng và cộng sự với các dịch

chiết rong tảo biển Việt Nam [1] Nhóm nghiên cứu đã phát hiện thấy dịch chiết

methanol của hai loài tảo biển là Sargassum swartzii và Ulva reticulata thể hiện

hoạt tính kháng viêm cao mà không gây độc với động vật thử nghiệm [1] Hàng loạt các nghiên cứu khác trong thời gian gần đây cũng chỉ sử dụng các mô hình nghiên cứu này để đánh giá tác dụng kháng viêm của các dịch chiết thực vật nghiên cứu Ví

dụ như Hà Vân Oanh và cộng sự (2010) trên cao lỏng của rễ cây bạch đồng nữ

(Clerodendrum chinense) [4], Đỗ Thị Oanh và cộng sự (2010) trên cao sói rừng (Sapium sebiferum) [3] hay Nguyễn Thị Bích Hằng (2009) trên cao lỏng lá vọng cách (Premna corymbosa) [5] Như vậy có thể nói rằng, mô hình nghiên cứu viêm

và đánh giá tác dụng kháng viêm ở Việt Nam hiện nay là đơn giản, cổ điển, tốn nhiều thời gian và thiếu tin cậy Như vậy, chúng ta còn thiếu các nghiên cứu hiện đại với các mô hình gây viêm đạt chuẩn quốc tế hay nghiên cứu cơ chế kháng viêm thông qua đánh giá ảnh hưởng của chất nghiên cứu lên các thụ thể như TLR, GC, mức độ giải phóng các chất trung gian được tiết ra trong quá trình tiền viêm và viêm, các tín hiệu gây viêm đặc hiệu Đặc biệt, cho đến nay chúng ta chưa có mô

hình sàng lọc in vitro cho phép sàng lọc nhanh, chính xác và hiệu quả các chất

kháng viêm mới từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

1.7 CÂY TỎI VÀ VAI TRÒ CỦA ALLICIN TRONG QUÁ TRÌNH KHÁNG VIÊM

1.7.1 Cây tỏi

Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, khuynh hướng quay về với thiên nhiên, tìm tòi và phát triển những phương thuốc truyền thống ngày càng được chú trọng Thảo dược thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan trọng trong phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe của nhân dân

Với lãnh thổ trải dài từ Bắc đến Nam, thuộc vùng nhiệt đới gió mùa ẩm, nước ta

có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, trong đó cây cỏ làm thuốc chiếm một tỉ lệ khá cao Nhiều loài cây cỏ Việt Nam là những nguồn hoạt chất quý cho y học dân tộc và y học hiện đại, là nguồn chất thơm có giá trị kinh tế cho các ngành thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm, dược phẩm…

Tỏi là một cây được trồng khắp nơi để làm gia vị- hàng ngàn năm nay- từ cổ Hy Lạp và La Mã, từ Châu Á đến Trung Đông, tỏi luôn đứng ở tuyến đầu điều trị chống

vi khuẩn Đến khi thuốc kháng sinh được khám phá, tỏi bắt đầu lùi lại tuyến sau Đến nay, cùmg với sự xuất hiện của những siêu vi trùng kháng kháng sinh, tỏi lại đứng trong danh sách những thuốc chống lây nhiễm Cái lợi nhất của dược thảo tự nhiên như tỏi là nó không tấn công vi khuẩn bừa bãi hay cản trở sự phòng vệ tự nhiên của cơ thể như thuốc kháng sinh, chúng là những probiotic kích thích các cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể mà không làm hại những vi khuẩn có ích [5] Tỏi được sử dụng phổ biến trong đời sống hàng ngày của con người Từ lâu đời con người đã biết sử dụng tỏi để chữa bệnh, nhưng hiểu biết những tác dụng huyền

bí của tỏi thì ít người biết

Việt Nam ta có nhiều vùng trồng tỏi, nhưng nổi tiếng thơm ngon nhất là “Vương quốc tỏi- huyện đảo Lý Sơn” Điều làm nên sự khác biệt của tỏi Lý Sơn là củ của nó không quá to, không quá cay lại có mùi thơm đặc biệt Mùi thơm nồng ấy là do người dân Đảo đã dùng cát biển để “lót” khi gieo trồng Và việc khai thác cát để trồng tỏi đã tạo điều kiện cho triều cường lấn át đất đai nơi đây

1.7.1.1 Phân loại thực vật – Đặc điểm sinh thái

1.7.1.1.1 Phân loại thực vật

Tên khoa học: Allium sativum L

Thuộc họ Hành tỏi Alliaceae

1.7.1.1.2 Phát sinh tên gọi:[ 33]

Các nhà thực vật học gọi cây tỏi là Allium Sativum [ 33], (URL4, 5, 6) Tiếng La tinh gọi tỏi là Olere – có nghĩa là “ngửi thấy”, tiếng Hy lạp là Hallestai là “nhảy vọt ra” để mô tả sự tăng trưởng nhanh chóng các tép tỏi trong một củ Một nhà thơ La

mã Plaupus (250 – 184 trước CN) dùng thuật ngữ Allium để gọi cây tỏi, nên người

ta cho rằng đó là một từ phát sinh từ chữ Arya cổ áluh hoặc álukám qua alum mà ra,

vì người xưa dùng từ đó với nghĩa là một gia vị Một cách giải thích khác Allium là phát sinh từ alare hoặc halare có nghĩa là “thở”, “thở ra” đều liên quan đến mùi ngửi

thấy Ngoài ra từ Celtic all có nghĩa là “ấm áp”, “làm nóng, đốt nóng” cũng được

coi là nguồn gốc phát sinh của tên gọi cây tỏi

1.7.1.1.3 Khái quát chung về họ hành tỏi: [38]

Tỏi, “gia vị của cuộc đời”, là loại độc nhất vô nhị trong vương quốc thảo mộc có nguồn gốc sâu xa, huyền bí gắn liền với những truyền thuyết xa xưa của nhiều dân tộc khác nhau trên thế giới Tỏi cùng y học dân gian hay những tập quán dân tộc đã thật sự hòa nhập vào nhau Cùng với thiên nhiên-tỏi cũng chịu ảnh hưởng sâu sắc của sự biến hóa trong quá trình chọn lọc tự nhiên nên có rất nhiều loài khác nhau [33] Trên thế giới có hơn 600 loại tỏi khác nhau bởi độ lớn, màu sắc, hình dáng của

củ, mùi vị, số lượng tép tỏi trong một củ, vị hăng cay và công dụng trong từng loại tỏi khác nhau [33]

Các nhà phân loại thực vật học cho rằng sơ khai chỉ có một loài Allium Sativum Loài tỏi này có hai loài phụ: Ophioscorodon (hard-necked garlics) và Sativum (soft-necked garlics) Tỏi Ophioscorodon là loại tỏi chính gốc và Sativum là loại tỏi Ophioscorodon đã bị lai hóa bởi do điều kiện thổ nhưỡng gieo trồng khác nhau trong quá trình chọn lọc tự nhiên

Nghiên cứu mới nhất (2003) đã công bố rằng có 8 nhóm tỏi khác biệt đã được tiến hóa; 6 nhóm thuộc loại hard-necked garlics (tỏi cổ cứng) có tên gọi là Asiatic, Creole, Purple Stripe, Marbled Purple Stripe, Porcelain, Rocambole và 2 nhóm thuộc loài soft-necked garlics (tỏi cổ mềm) là Artichoke và Silverskin

Một nghiên cứu gần đây cho rằng có 17 loài tỏi khác nhau được biến hóa từ 8 nhóm trên Thực tế trên khắp thế giới, có hàng trăm loài tỏi khác nhau đều được phát triển từ 17 loài cơ bản trên Chúng có những đặc tính khác nhau bởi được trồng trong điều kiện thổ nhưỡng khác nhau như: Sự phì nhiêu của đất, lượng mưa, nhiệt

độ, độ cao so với mực nước biển, thời điểm gieo trồng trong năm và chế độ nghiêm

ngặt của nước tưới…[33]

Tỏi - Cây thảo sống một năm Thân thực hình trụ, phía dưới mang nhiều rễ phụ, phía trên có nhiều lá Lá cứng, hình dài, thẳng dài 15-50cm, rộng 1- 2,5cm có rãnh khía, mép lá hơi ráp Phần dưới của lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển

thành một tép tỏi; các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ tỏi tức là thân hành (giò) của tỏi Hoa mọc ở ngọn thân trên, một cán hoa dài 55cm hay hơn Bao hoa màu trắng hay hồng bao bởi nhiều tán, rơi rụng thành mũi nhọn dài Hoa mọc thành cụm trên đầu một trục hình trụ từ thân củ kéo dài ra Cụm hoa là một tán giả hình cầu, màu trắng, đỏ hoặc xanh nhạt

Hình 5: Cây tỏi

1.7.2 Allicin và các sản phẩm chứa Allicin

Đối với hàng nghìn năm trước tỏi đã được biết đến có nhiều tiềm năng y học đặc biệt Trong lịch sử, tỏi đã được sử dụng để chữa bệnh thương hàn, bệnh dại Thực

sự, sau khi Cavallito phát hiện ra Allicin – một hoạt chất được hình thành từ Alliin thành phần quan trọng của tỏi năm 1944 đã có tới 1500 công bố khoa học và vô số các nghiên cứu khác xung quanh vấn đề dược học của tỏi (ULR1) Vì vậy, người xưa đã đặt cho tỏi những biệt hiệu: thần dược, thuốc bách bệnh Trong những thập niên gần đây, cùng với sự phát triển của 2 loại bệnh tim mạch và ung thư, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến tác dụng chống oxy hóa, chống đột biến tế bào, hạ

độ mỡ trong máu và làm giảm nguy cơ máu đông của một số hoạt chất thiên nhiên

Trong đó, tỏi là một gia vị có hoạt chất quan trọng tổng hợp nên Allicin - chất có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất, có thể ngăn chặn các quá trình trên (ULR2) Tỏi có 3 hoạt chất chính: alliin, liallyl sulfide và ajoene Alliin là hoạt chất mạnh nhất và quan trọng nhất của tỏi Khi tỏi được cắt mỏng hoặc đập dập và dưới sự xúc tác của men allinase, chất alliin có sẵn trong tỏi biến thành allicin Do đó, càng cắt nhỏ hoặc càng đập nát, hoạt tính càng cao Allicin dễ mất hoạt tính sau khi được hình thành và càng để lâu càng mất hoạt tính Đặc biệt là sẽ bị phá hủy hoạt tính khi

ở nhiệt độ cao Allicin là một chất kháng sinh tự nhiên rất mạnh, mạnh hơn cả penicillin (ULR2) Bên cạnh đó, Allicin có một số dược tính có lợi mà giúp cho cơ thể có khả năng tăng cường đáp ứng lại một số bệnh [34] Các nghiên cứu gần đây

đã công bố Allicin :

- Tăng cường hoạt tính của các tế bào trong quá trình thực bào

- Tăng cường hoạt tính của các tế bào giết tự nhiên

- Ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh

- Ức chế sự phát triển của những tế bào ung thư (ULR3)

Alliin Allinase/H 2 O Allicin

CH2=CH-CH2-SO-CH2-CH(NH2)-COOH CH2=CH-CH2-SO-S-CH2-CH=CH2+ pyruvic acid + NH4

Quá trình tạo Allicin trong tỏi

Trong một số thực phẩm chức năng hiện này có chứa Allicin được biết đến như chế phẩm Alimax, Weissin, Garcin, Knoflox, Alli-C, AliTRU, Alli-Oregano, Aliforce, AliPro, Betacal, PreRRO, AlliMED Các sản phẩm này được khuyến cáo

sử dụng hỗ trợ làm giảm cholesterol trong máu, ngăn ngừa xơ vữa mạch, cao huyết

áp Đặc biệt là có khả năng ngăn ngừa ung thư trong trường hợp uống thường xuyên Các sản phẩm này đã sự dụng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Sản phẩm Alimax đã nhận được giải thưởng bạc của hội bảo vệ sức khỏe tự nhiên ở Canada

với số chứng nhận sản phẩm : 80022062 (ULR1)

1.7.3 Sản xuất Allicin từ alliin có trong tỏi

Allinase là enzym có trong tỏi giúp cho quá trình chuyển alliin thành Allicin Nhưng lượng Alliin thường có ở trong tỏi khoảng 0,4 đến 0,9% thành phần phụ thuộc vào điều kiện trồng tỏi Trên thực tế với phương pháp sử dụng lượng allinase

có trong tỏi để sản xuất Allicin thì cần alliin chiếm khoảng từ 1%-15% [36] Do vậy, để sản xuất Allicin từ Alliin của tỏi cần bổ sung thêm alliin từ tinh thể deoxyalliin Sau đó, lượng alliin này sẽ được tiếp xúc với tỏi đã được nghiền để quá trình phản ứng giữa alliin và allinase xảy ra dễ dàng cho ra sản phẩm là Allicin Với nồng độ alliin, nhiệt độ, pH và thời gian tối ưu để phản ứng xảy ra triệt để sẽ thu được lượng Acillin nhiều nhất

Để sản xuất Allicin từ Alliin của tỏi cho mục đích làm thực phẩm chức năng và một dạng thuốc dùng cho điều trị một số bệnh cũng như các ứng dụng khác trong dược học các nhóm nghiên cứu mạnh hiện nay ở Mỹ, cộng đồng Châu Âu đã có patent sử dụng alliin để sản xuất Allicin tự nhiên từ thực vật thuộc họ tỏi hành Nguyên nhân chủ yếu là để đảm bảo Allicin sản xuất ra hoàn toàn không liên quan đến nguyên liệu chuyển gen và tổng hợp bằng con đường hóa học

Tóm lại, để sản xuất Allicin có khả năng kích thích miễn dịch từ tỏi, các tác giả thường dùng phối hợp alliin với allinase để sản xuất Allicin và một số dung môi hữu cơ không phân cực để tinh sạch Allicin trong điều kiện thích hợp về pH, nhiệt

Sơn của Việt Nam đã được công bố có rất nhiều hoạt tinh sinh học quý báu Trong khi đó, dầu tỏi tạo ra vẫn chưa được đánh giá khả năng điều hòa đáp ứng viêm

Để góp phần giải quyết những tồn tại nêu trên, đề tài nghiên cứu này với mục tiêu làm sáng tỏ một trong các công dụng của tỏi, đặc biệt là đánh giá khả năng của Allicin như một dạng thuốc trong quá trình điều hòa đáp ứng viêm, cũng như định hướng ứng dụng Allicin như một liệu pháp hỗ trợ và phòng bệnh cho con người, cụ thể là bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng Trong nghiên cứu này sẽ tập trung vào tổng hợp Allicin từ tỏi Lý Sơn Đây là một trong những loại tỏi đã có thương hiệu từ lâu của Việt Nam và đã được biết đến ở nhiều nước trên thế giới

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

sử dụng chống nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, quà tặng của giáo sư Jo,

Compound – K, một chất được chiết xuất từ nhân sâm Hàn Quốc)

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

Tủ ấm CO2, Tủ cấy vô trùng Naure, Máy đọc ELISA(bio-rad, Mỹ), Tủ lạnh: Kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật), Máy khuấy từ nhiệt (Đức), kính hiển vi laze hội tụ (LSM 510)… và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác như: đĩa nuôi cấy 24, 48, 96 giếng (Corning, Mỹ), kim uống, kim tiêm, dao, kéo

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột

Tế bào đại thực bào (BMDM) được tách ra từ xương đùi của chuột Sau đó, BMDM được phân chia từ 5 đến 7 ngày trong môi trường DMEM đã được bổ sung cùng với 10% môi trường điều kiện nuôi tế bào L929 (được xem như yếu tố kích thích M-CSF (macrophage-specific colony stimulating factor)), 10% FBS, 1mM sodium pyruvate, 50U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, và 5 × 10−5 M chất 2-mercaptoethanol

2.2.2 Đánh giá hoạt tính độc tố của Allicin tới khả năng sống của BMDM bằng kít CCK-8

Khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng sử dụng Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumammoto, Japan) BMDMs được ủ cùng với

Allicin hoặc C-K trước 24 giờ Sau quá trình này, 10µl của dung dịch CCK-8 được đưa vào macrophage đã được ủ cùng với Allicin hoặc C - K trong 1 giờ Khả năng hấp thụ của các mẫu này sẽ được đo ở bước sóng 450nm bằng máy đọc ELISA Giá trị hấp thụ ở 450 nm của mỗi mẫu này được tính như tỉ lệ phần trăm so với mẫu không được xử lý với Allicin hoặc C-K (xem như 100% tế bào sống)

2.2.3 Sản xuất Allicin từ tỏi

a) Sản xuất tinh thể deoxyalliin

- L-cysteine hydrochloride monohydrate được hòa tan vào nước cất và khuấy đều ở nhiệt độ 20-25ºC

- Bổ sung thêm sodium hydroxide đã được hòa tan trong nước cất từng giọt

- Bổ sung allyl chloride ở nhiệt độ 25 - 30oC

- Sau đó làm lạnh dung dịch ở 4oC, tiếp tục bổ sung thêm axit glacial acetic ở dạng giọt tới tạo ra dạng kết tủa màu trắng Sau đó, tách phần kết tủa trắng bằng lọc và làm khô

- Phần kết tủa trắng được hòa tan trong nước cất ở nhiệt độ 45oC, sau đó làm lạnh methanol -20oC và làm khô Lập lại 4 lần

- Sau đó, chất rắn này được rửa với diethyl ether và làm khô

b) Sản xuất alliin

- deoxyalliin ở trên được bổ sung thêm nước và khuấy đều

- hydrogen peroxide bổ sung vào dung dịch ở dạng nhỏ giọt

- Bổ sung thêm methanol, khuấy đều

- hydrogen peroxide bổ sung từng giọt và khuấy ở nhiệt độ thích hợp

C) Sản xuất Allicin

- Lấy 10 gram Alliin hòa tan trong 800ml nước cất Sau đó bổ sung thêm 12 gram tỏi đã được nghiền nát Bổ sung thêm nước cất đủ tới 1 lít

- Ủ hỗn hợp này ở 4ºC

- Sau 24 giờ lọc thu dịch (chính là Allicin thu được)

- Dịch lỏng này tiếp tục được đông khô thu được Allicin dạng bột

- Chạy HPLC kiểm tra độ tinh sạch:(URL7)