Luận văn thạc sĩ Sinh vật, Đa dạng di truyền, Quần thể bách xanh tự nhiên, TâyNguyên, Di truyền học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đinh Thị Phòng PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc sử dụng công bố tài liệu Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Lê Thị Quỳnh LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành đến PGS.TS Đinh Thị Phịng tận tình, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt q trình hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình học tập trƣờng nhƣ thực nghiên cứu để thoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, toàn thể cán Phòng Phân loại học thực nghiệm Đa dạng nguồn gen giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình học tập, thực nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tiến Hiệp cung cấp mẫu cho nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội tận tâm truyền đạt kiến thức cho tơi suốt khóa học Luận văn phần kết đề tài TN3/T15 thuộc Chƣơng trình Tây Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Chƣơng trình Cuối tơi xin chân thành cảm ơn động viên khích lệ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Lê Thị Quỳnh MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU .7 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .9 1.1 Giới thiệu tổng quát loài Bách xanh 1.1.1 Vị trí phân loại Bách xanh 1.1.2 Một số đặc điểm sinh học giá trị bảo tồn lồi Bách xanh 1.1.3 Tình hình phân bố Bách xanh Việt Nam .11 1.2 Tính đa dạng di truyền quần thể thực vật 12 1.2.1 Khái niệm quần thể thực vật .12 1.2.2 Tính đa dạng di truyền quần thể thực vật 13 1.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thƣờng đƣợc dùng nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 13 1.3.1 Kỹ thuật isozyme 13 1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .14 1.3.3 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 15 1.3.4 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .15 1.3.5 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) .16 1.3.6 Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) .17 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc đa dạng di truyền thực vật .17 1.4.1 Thế giới 17 1.4.2 Trong nƣớc 18 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Địa điểm nghiên cứu 26 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ 70 mẫu Bách xanh 26 2.4.2 Phƣơng pháp nhân PCR 27 2.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số loài Bách xanh .29 3.2 Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh Tây Nguyên phân tích với thị ISSR .29 3.2.1 Tính đa hình DNA 70 mẫu Bách xanh với thị ISSR 29 3.2.2 Đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với thị ISSR .34 3.2.3 Mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh phân tích với thị ISSR 36 3.2.4 Nhận xét chung kết phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với thị ISSR .39 3.3 Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh Tây Nguyên phân tích với thị SSR .39 3.3.1 Tính đa hình DNA 70 mẫu Bách xanh với thị SSR 39 3.3.2 Đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với thị SSR 43 3.3.3 Mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh quần thể Bách xanh phân tích với thị SSR 48 3.3.4 Nhận xét chung kết phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với thị SSR .50 3.4 Mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh với tổ hợp thị ISSR SSR 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin mẫu thu nghiên cứu phân tử 22 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide 30 mồi ISSR sử dụng nghiên cứu .23 Bảng 2.3 Trình tự nucleotide 17 cặp mồi SSR sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Giá trị PIC tỉ lệ phân đoạn đa hình 70 mẫu Bách xanh phân tích với 30 mồi ISSR 30 Bảng 3.2 Thông số đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với thị ISSR 34 Bảng 3.3 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể Bách xanh phân tích với thị ISSR 36 Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng di truyền (dƣới) khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) quần thể Bách xanh phân tích với thị ISSR 36 Bảng 3.5 Giá trị PIC, đa dạng gen locus tỷ lệ phân đoạn đa hình 70 mẫu Bách xanh phân tích với thị SSR 42 Bảng 3.6 Một số thông số đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với thị SSR 44 Bảng 3.7 Một số thơng số di truyền quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR 46 Bảng 3.8 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR 47 Bảng 3.9 Hệ số tƣơng đồng (dƣới) khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) quần thể Bách xanh phân tích với thị SSR .48 Bảng 3.10 Một số thông số di truyền quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR+SSR .52 Bảng 3.11 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR+SSR 53 Bảng 3.12 Hệ số tƣơng đồng (dƣới) khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR vàSSR 53 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Bách xanh Vƣờn quốc gia Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk 10 Hình 2.1 Vị trí thu mẫu quần thể Bách xanh nghiên cứu 22 Hình 3.1 DNA tổng số tách từ đại diện số mẫu Bách xanh điện di gel agarose 0,9% .29 Hình 3.2 Sản phẩm PCR-ISSR 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR3 gel agarose 1,5% 32 Hình 3.3 Sản phẩm PCR-ISSR 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR62 gel agarose 1,5% 33 Hình 3.4 Biểu đồ hình 70 mẫu Bách xanh phân tích với thị ISSR tính theo hệ số di truyền Jaccard kiểu phân nhóm UPGMA 37 Hình 3.5 Biểu đồ tọa độ 70 mẫu thuộc quần thể Bách xanh phân tích với thị ISSR 38 Hình 3.6 Sản phẩm PCR-SSR 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm3 gel polyacrylamide 5% 40 Hình 3.7 Sản phẩm PCR-SSR 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm7 gel poly acrylamide 5% .41 Hình 3.8 Biểu đồ hình 70 mẫu Bách xanh phân tích với thị SSR tính theo hệ số di truyền Jaccard kiểu phân nhóm UPGMA 49 Hình 3.9 Biểu đồ tọa độ 70 mẫu thuộc quần thể Bách xanh phân tích với thị SSR .50 Hình 3.10 Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR SSR tính theo phƣơng pháp Jacccard kiểu phân nhóm UPGMA 54 Hình 3.11 Biểu đồ tọa độ 70 mẫu thuộc quần thể Bách xanh phân tích với thị ISSR SSR 55 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Đa hình chiều dài phân đoạn DNA nhân (Amplified Fragment Length Polymorphism) AOO Phạm vi cƣ trú (Area of Occupancy) bp Cặp bazơ (Base pair) BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cpSSR Trình tự lặp lại đơn giản vùng gen lục lạp (Chloroplasts Simple Sequence Repeat) dNTP Deoxyribonucleoside 5‟ Triphosphate kb 1000 cặp bazơ (Kilobase pair) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EOO Phạm vi khu phân bố (Estimating Extent of Occurrence) Genbank Ngân hàng gen quốc tế CTAB Cetyl Trimethyl Amonium Bromide DNA Axit Deoxyribo Nucleic (deoxyribonucleic acid) IUCN Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (International Union for Conservation of Nature) ISSR Vùng đoạn trình tự lặp lại đơn giản (Inter Simple Sequence Repeat) ITS Vùng chép nội (Internal Transcribed Spacer) mtDNA ADN ty thể (mitochondrion Deoxyribo Nucleoic Axit) NJ Phƣơng pháp tạo phân loại Neighbor Joining (Neighbor Joining) OD Mật độ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) RAPD Đa hình đoạn ADN đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) RFLP Đa hình chiều dài đoạn ADN cắt enzyme giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) SSR Trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat) TAE Tris Acetate EDTA TE Tris EDTA Tm Nhiệt độ biến tính (Melting temperature) UPGMA Phƣơng pháp phân cặp nhóm khơng có trọng số dùng trung bình số học (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) VQG Vƣờn Quốc gia VU Sẽ nguy cấp (Vulnerable) hình (chiếm 95,2%) Các alen phát đƣợc có kích thƣớc khoảng 100 – 430 bp Kết phân tích SSR quần thể Bách xanh Đatanla có tính đa dạng di truyền cao (h = 0,251; I = 0,496 PPB = 88,24%), xếp thứ hai quần thể Hòa Sơn (h = 0,250; I = 0,466 PPB = 76,47%), thấp quần thể Kon Chƣ Răng (h = 0,167; I = 0,313 PPB = 47,06%) Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể cá thể quần thể cho thấy tổng mức độ thay đổi phân tử thấp quần thể (36,46%) cao cá thể quần thể (63,54%) Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh với thị SSR chia thành hai nhánh I II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động khoảng từ 71 đến 98% Nhánh I gồm mẫu Cm67, Cm68, Cm69 Cm70 có nguồn gốc Kon Chƣ Răng (Gia Lai), có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 88,8 đến 97% Nhánh II gồm 66 mẫu cịn lại chia thành phân nhóm II.1 II.2 có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 73,8 đến 98% Trong phân nhóm II.1 gồm 34 mẫu (Cm33 – Cm66) có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 77,9 đến 98%, có nguồn gốc Hịa Sơn (Đắk Lắk) Phân nhóm II.2 gồm 32 mẫu (Cm1 – Cm32) có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 78,4 đến 98%, có nguồn gốc Đatanla (Lâm Đồng) 3.4 Mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh với tổ hợp thị ISSR SSR Để có nhìn tổng qt mức độ đa dạng di truyền mối quan hệ di truyền quần thể Bách xanh nghiên cứu, chúng tơi tổng hợp kết phân tích với thị ISSR thị SSR Kết quần thể Bách xanh Đatanla có tính đa dạng di truyền cao (h = 0,123; I = 0,194 PPB = 36.61%), xếp thứ hai quần thể Hòa Sơn (h = 0,107; I = 0,188 PPB = 345.52%), thấp quần thể Kon Chƣ Răng (h = 0,031; I = 0,034 PPB = 6.01%) (bảng 3.10) Kết phân tích thông số này phù hợp với kết phân tích độc lập hai thị ISSR SSR 51 Bảng 3.10 Một số thông số di truyền quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR SSR Mức độ quần thể Thơng số di truyền Đatanla Hịa Sơn Kon Chƣ Răng Mức độ Trung bình lồi N 32 34 23,3 70 Na 1,317 1,284 0,825 1,142 1,512 Ne 1,229 1,221 1,041 1,164 1,277 He 0,131 0,127 0,023 0,094 0,168 PPB (%) 36,61 35,52 6,01 26,05 51,16 h 0,123 0,107 0,031 0,102 0,146 I 0,194 0,188 0,034 0,139 0,254 Ghi chú: N: số mẫu; Na: số alen trung bình locus; Ne: số alen hiệu locus; I: số đa dạng Shannon; He: hệ số gen dị hợp tử mong đợi; UHe: Unbiased expected heterozygosity; h: số đa dạng theo Nei; PPB: phần trăm phân đoạn đa hình Kết phân tích mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể cá thể quần thể cho thấy tổng mức độ thay đổi phân tử thấp quần thể (37,87%) cao cá thể quần thể (62,13%) (bảng 3.11) Khi so sánh với loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis) Trung Quốc nghiên cứu Wang cộng (2004) [56] nhận thấy, mức độ thay đổi phân tử quần thể loài Bách xanh Tây Nguyên cao (37,87% so với 4,1%) thấp cá thể quần thể (62,13% so với 95,9%) so sánh với lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) Trần Thị Liễu cộng (2014) phân tích với 17 cặp mồi SSR nhận thấy mức độ thay đổi phân tử quần thể loài Bách xanh cao (37,87% so với 11,94%) thấp cá thể quần thể (62,13% so với 88,06%) [10] Mức độ thay đổi phân tử phù hợp với mức độ thay đổi phân tử phân tích với thị ISSR thị SSR 52 Bảng 3.11 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR SSR Nguồn biến thiên Bậc Tổng bình tự phƣơng Thành phần biến đổi Tổng biến đổi (%) Giữa quần thể 237,886 5,676 37,87 Trong quần thể 67 623,928 9,312 62,13 Hệ số tương đồng Giá trị p < 0,001 truyền v k oảng truyền g ữa quần t ể B xanh Kết bảng 3.12 quần thể Bách xanh nghiên cứu có hệ số tƣơng đồng di truyền tƣơng đối cao ( > 0,853), trung bình đạt 0,897 Trong quần thể Đatanla Hịa Sơn có hệ số tƣơng đồng di truyền cao (0,952) thấp quần thể Đatanla quần thể Kon Chƣ Răng (0,853) Khoảng cách di truyền quần thể dao động từ 0,049 (giữa quần thể Đatanla Hòa Sơn) đến 0,159 (giữa quần thể Đatanla Kon Chƣ Răng) Khoảng cách di truyền trung bình ba quần thể 0,109 Kết phù hợp với kết phân tích độc lập hai thị ISSR thị SSR Bảng 3.12 Hệ số tƣơng đồng (dƣới) khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR SSR Đatanla Đatanla Hòa Sơn 0,952 Kon Chƣ Răng 0,853 Trung bình Hịa Sơn Kon Chƣ Răng 0,049 0,159 0,114 Trung bình 0,109 0,892 0,897 Phân tích UPGMA sở khoảng cách di truyền theo Nei (1972) sử dụng phần mềm NTSYS 2.0 tìm thấy mối quan hệ di truyền 70 mẫu quần thể Bách xanh thể hình 3.10 hình 3.11 53 75.3 58.1 52.7 54.9 II.2 49.8 65.1 c 62.8 51.1 57.0 68.1 II 77.5 52.6 50.5 II.1 b 63.1 60.4 I 99.9 a 64.8 86.6 Hình 3.10 Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh phân tích với tổ hợp thị ISSR SSR tính theo phƣơng pháp Jacccard kiểu phân nhóm UPGMA Ghi chú: a: mẫu Kon Chƣ Răng (Gia Lai); b: mẫu Hòa Sơn (Đắk Lắk); c: mẫu Đatanla (Lâm Đồng) 54 Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh với thị ISSR SSR (hình 3.10) chia thành hai nhóm I II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động khoảng từ 78,5% (Cm41 Cm50) đến 98,1% (Cm64 Cm65) Nhóm I gồm mẫu Cm67, Cm68, Cm69 Cm70 có nguồn gốc Kon Chƣ Răng (Gia Lai), có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 94,8 đến 97,9% Nhóm II gồm 66 mẫu cịn lại chia thành phân nhóm II.1 II.2 có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 82,2 đến 98,1% Trong phân nhóm II.1 gồm 34 mẫu (Cm33 – Cm66) có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 86,5 đến 98,1%, có nguồn gốc Hịa Sơn (Đắc Lắc) Phân nhóm II.2 gồm 32 mẫu (Cm1 – Cm32) có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng từ 84,7 đến 97,3%, có nguồn gốc Đatanla (Lâm Đồng) Biểu đồ tọa độ (hình 3.11) thể việc phân nhóm tƣơng tự nhƣ biểu đồ hình Các mẫu có khoảng cách di truyền gần biểu đồ tọa độ chúng nằm co Tọa dộ (18.81%) cụm lại với Datanla Hòa Sơn Kon Chƣ Răng Tọa độ (39.42%) Hình 3.11 Biểu đồ tọa độ 70 mẫu thuộc quần thể Bách xanh phân tích với thị ISSR SSR 55 So sánh hiệu p ân tí đa ạng di truyền quần thể Bách xanh với th ISSR SSR: Ba mƣơi mồi ISSR mƣời bảy cặp mồi SSR đƣợc sử dụng để phân tích đa dạng di truyền 70 thể thuộc quần thể Bách xanh thu đƣợc Lâm Đồng, Đắk Lắk, Gia Lai có 25/30 mồi ISSR 15/17 cặp mồi SSR tính đa hình mẫu nghiên cứu Các mồi ISSR cho tỷ lệ đa hình thấp mẫu nghiên cứu, có 18 mồi có số phân đoạn đa hình 50%, có mồi ISSR3 có 100% số phân đoạn đa hình Trong khi phân tích với 17 cặp mồi SSR lại cho thấy tỉ lệ đa hình tƣơng đối cao mẫu nghiên cứu (nhân đƣợc tổng số 42 phân đoạn, trung bình 2,47 phân đoạn/mồi, có 40 phân đoạn đa hình (chiếm 95,2%)) Hàm lƣợng thơng tin đa hình ( PIC) phân tích với thị ISSR thấp phân tích với thị SSR (1,01 0,272, tƣơng ứng) Thông số đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với 30 mồi ISSR quần thể Đatanla có tính đa dạng di truyền cao (I = 0,192; h = 0,102; PPB = 35,66%; Ne =1,227 He = 0,130) thấp quần thể Kon Chƣ Răng (I = 0,022; h = 0,015; PPB = 3,88%; Ne = 1,027 He = 0,015) Kết phân tích với thị SSR cho kết giống với kết phân tích thị ISSR thể quần thể Đatanla có tính đa dạng di truyền cao (h = 0,251; I = 0,496 PPB = 88,24%) thấp quần thể Kon Chƣ Răng (h = 0,167; I = 0,313 PPB = 47,06%) Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể cá thể quần thể phân tích với thị ISSR SSR cho thấy tổng mức độ thay đổi phân tử thấp quần thể (36,63% 36,46%, tƣơng ứng) cao cá thể quần thể (63,67% 63,54%, tƣơng ứng) với giá trị p < 0,001 Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh phân tích với thị ISSR SSR chia thành hai nhánh I II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động khoảng từ 81,4% đến 99,1% từ 71% đến 98%, tƣơng ứng Các cá thể quần thể có quan hệ gần gũi mặt di truyền nằm co cụm vào nhóm riêng biệt biểu đồ 56 hình Kết phân nhóm biểu đồ tọa độ (PCA) phân tích với thị ISSR SSR phản ánh tƣơng tự nhƣ biểu đồ hình Các mẫu có khoảng cách di truyền gần biểu đồ tọa độ chúng nằm co cụm lại với Dựa vào kết ta thấy kết phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh Tây Nguyên phân tích với thị ISSR SSR tƣơng đối giống nhau, có khác biệt nhỏ phân tích với thị ISSR cho thấy tỉ lệ đa hình hàm lƣợng thơng tin đa hình (PIC) tƣơng đối thấp cịn phân tích với thị SSR lại cho kết tƣơng đối cao Khi sử dụng nhiều mồi để phân tích đa dạng di truyền kết xác khách quan hơn, lí nghiên cứu chúng tơi sử dụng đồng thời loại thị ISSR SSR để đánh giá đa dạng di quyền quần thể Bách xanh Tây Nguyên 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Ba mƣơi mồi ISSR 17 cặp mồi SSR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho 70 mẫu thuộc quần thể Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) Tây Nguyên (Đatanla, Lâm Đồng; Hòa Sơn, Đắk Lắk Kon Chƣ Răng, Gia Lai) Trong 25/30 mồi ISSR 15/17 cặp mồi SSR tính đa hình Tính đa dạng di truyền loài Bách xanh Tây Nguyên phân tích với hai thị ISSR SSR bộc lộ cao quần thể Đatanla thấp quần thể Kon Chƣ Răng, tỉnh Gia Lai Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) quần thể cá thể phân tích với thị ISSR SSR thấp quần thể cao cá thể quần thể Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 70 mẫu Bách xanh phân tích với thị ISSR SSR chia thành hai nhánh I II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động khoảng từ 81,4% đến 99,1% từ 71% đến 98%, tƣơng ứng Các cá thể quần thể có quan hệ gần gũi mặt di truyền nằm co cụm vào nhóm riêng biệt biểu đồ hình Kết phân nhóm biểu đồ tọa độ (PCA) phân tích với thị ISSR SSR phản ánh tƣơng nhƣ biểu đồ hình Các mẫu có khoảng cách di truyền gần biểu đồ tọa độ chúng nằm co cụm lại với Thông qua giá trị nhƣ hệ số di nhập gen (Nm), giá trị tạo giống (Fis), số alen (Ap) mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) cho thấy tính đa dạng di truyền lồi Bách xanh Tây Ngun khơng đáng lo ngại, có trơi dạt nguồn gen tƣơng đối cao số locus nên việc bảo tồn đa dạng nguồn gen cần đƣợc quan tâm sớm KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu chúng tơi có đề xuất: Cần có chiến lƣợc thu thập hạt giống lồi Bách xanh để bảo tồn nguồn tài nguyên tự nhiên Tây Nguyên Xây dựng khu bảo tồn chỗ để chăm sóc phát triển mạ quản lý phát triển nguồn gen tất quần thể Xây dựng nguồn gen lõi để trì bảo tồn phát triển nguồn gen tất quần thể để làm tăng tính đa dạng di truyền vùng 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Trọng Cúc (2002), Đa dạng sinh học bảo tồn thiên nhiên, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Bộ KH & CN, Viện KH CNVN (2007), Sách Đỏ Việt Nam - Phần II- Thực vật, NXB KHTN & CN, tr 389 Vũ Đình Duy, Bùi Thị Tuyết Xuân, Trần Vinh, Nguyễn Minh Tâm (2010), “Phân tích đa dạng quan hệ di truyền quần thể Thủy tùng (Glyptostrobus pensilis) Đắk Lắk thị SSR”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(3), tr 331-336 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội Vũ Thị Thu Hiền, Lê Anh Tuấn, Trần Thị Việt Thanh, Phí Hồng Hải, Đinh Thị Phịng (2009), Phân tích mối quan hệ di truyền tập đồn giống bách xanh (Calocedrus macrolepis) mồi RAPD DNA lục lạp, Proceeding Hội nghị khoa học lần thứ Sinh thái tài nguyên sinh vật, tr 120-128 Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc, Nguyễn Đức Tố Lƣu, Philip Ian Thomas, Aljos Farjon, Leonid Averyanov, Jacinto Regalado (2004), Thông Việt Nam: Nghiên cứu trạng bảo tồn 2004, Fauna & Flora International, Chƣơng trình Việt Nam, Hà Nội Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Tiến Hiệp, Đinh Thị Phịng (2015), “ Tính đa dạng nguồn gen di truyền cấu trúc quần thể loài Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte)- lồi đặc hữu Tây Nguyên, Việt Nam thị ISSR”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 53(2), tr 179 Nguyễn Hoàng Nghĩa (2004), Các loài kim Việt Nam, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Đinh Thị Phịng, Vũ Thị Thu Hiền, Phí Hồng Hải, La Ánh Dƣơng (2009), “Phân tích mối quan hệ di truyền xuất xứ Pơ Mu (Fokienia hodginsii) mồi RAPD ADN lục lạp”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 12(2), tr 195-201 59 10 Đinh Thị Phịng, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Nguyễn Tiến Hiệp (2014), “ Đánh giá tính đa dạng di truyền quần thể tự nhiên lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) Tây Nguyên, Việt Nam thị SSR”, Tạp chí sinh học, 36(2), tr 210-219 11 Khuất Hữu Thanh (2005), Kỹ thuật gen – Nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 12 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 13 Nguyễn Minh Tâm, Vũ Đình Duy, Phạm Văn Lực, Nguyễn T Phƣơng Trang, Nguyễn Tiến Hiệp (2010), Bảo tồn tính đa dạng di truyền số lồi Thơng bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam, Proceeding Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 13-21 TIẾNG ANH 14 Arif M., Zaidi N M., Singh Y P., Haq Q M R., Singh U S (2009), “A comparative analysis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity in Shisham (Dalbergia sissoo)”, Plant Mol Biol Rep., 27, pp 488– 495 15 Averyanov L.V., Nguyen Tien Hiep, Pham Van The, Phan Ke Loc (2004), “ Calocedrus rupestris sp.nov (Cuppressaceae) new relict coniferous species from limestone areas of northern Vietnam, Proceeding of the National Conference on Life Science, Thai Nguyen University, pp 40-44 16 Bornet B., Branchard M (2001), “Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: Reproducible and specific tools for genome fingerprinting” Plant Mol Biol Rep., 19, pp 209-215 17 Boys J., Cherry M., Dayanandan S (2005), „„Microsatellite analysis reveals genetically distinct populations on red pine (Pinus resinosa, pinaceae)“, Amer J Bot., 92(5), pp 833-841 18 Carrasco B., Retamales J B., Quiroz K., Garriga M., Caligari P D S., Gonzales R G (2013), “Inter simple sequence repeat markers associated with flowering 60 time duration in the Chilean strawberry (Fragaria chiloensis)”, J Agr Sci Tech., 15, pp 1195-1207 19 Chiang Y C., Shih H C., Chang L W., Li W R., Lin H Y., Ju L P (2011), “Isolation of 16 polymorphic microsatellite markers from an endangered and endemic species Podocarpus nakaii (Podocarpaceae)”, Amer J Bot., pp 306309 20 Chung JD, Lin TP, Lin MY, Hwang SY (2004), “ Genetic diversity and biogeography of Cunninghamia konishii with Cunninghamia lanceolate, a mainland special in China”, Mol Phylogene Evol., 33(3), pp 791-801 21 Cipriano J., Carvalho A., Fernandes C., Gaspar M J., Pires J., Bento J., Roxo L., Louzada J., Lima-Brito J (2013), “Evaluation of genetic diversity of Portuguese Pinus sylvestris L populations based on molecular data and inferences about the future use of this germplasm”, J Genet., 92, e41-e48 22 Dinh Thi Phong, Vu Thi Thu Hien, Tran Thi Lieu (2015), “ Genetic variation of Pinus dalatensis Ferre‟ (Pinaceae) populations- endemic species in Vietnam revealed by ISSR markers”, J Chem Bio Phy Sci Sec B., Feb.2015- Apr.2015, Vol 5, No.2, pp 1415-1425 23 Doyle J J., Doyle D J (1990), “Isolation of plant DNA from fresh tissue”, Pocus 12, pp 13-15 24 Echt C S., Vendramin G G., Neison C D., Marquardt P (1999) „Microsatellite DNA as shared genetic markers among conifer species”, Canada J For Res., 29, pp 365-371 25 Fang D Q., Roose M L., Federici C T (1997), “Fingerprinting trifoliate orange germ plasm accessions with isozymes, RFLPs and inter-simple sequence repeat markers”, Theo App Genet., 95, pp 211-219 26 Farjon A., Page C N (1999), Conifer : status survey and conservation action plan, Conifer Specialist Group, IUCN, Gland, Switzerland &Cambrige, UK 61 27 Feng F J., Han S J and Wang H M (2006), “Genetic diversity and genetic differentiation of natural Pinus koraiensis populations”, J For Res., 17, pp 21– 24 28 Goudet J., 1995 FSTAT version 1.2: a computer program to calculate Fstatistics J Hered., 86, pp 485-486 29 Hung K H., Lin C Y., Huang C C., Hwang C C., Hsu T W., Ku Y L., Wang W.K., Hung C.Y.,Chiang T.Y (2012), “Isolation and characterization of microsatellite loci from Pinus massoniana (Pinaceae)”, Botanical Studies, 53, pp 191-196 30 Isshiki S., Iwata N., Khan M M R (2008), “ISSR variations in eggplant (Solanum melongena L.) and related Solanum species”, J Amer Soci Hort Sci., 117, pp 186–190 31 Levi A., Rowland L J (1997), “Identifying blueberry cultivars and evaluating their genetic relationships using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) anchored primer”, J Amer Soci Hort Sci., 122, pp 74-78 32 Liao S X., Mi X J., Liu A Z., Li K., Yang Z Y., Tian B (2010), “Isolation and Characterization of polymorphic microsatellite markers in Calocedrus macrolepis Kurz (Cupressaceae)”., J Amer Soci Hort Sci., 45(1), pp.169–171 33 Liu G F., Dong J X., Jiang Y., Lu Y F., Jiang J and Zhao G Y (2005), “Analysis of genetic relationship in 12 species of Section Strobus with ISSR markers”, J For Res., 16, pp 213–215 34 Madhav P (2011), “ Genetic diversity and differentiation of core vs peripheral populations of eastern white cedar, Thuja occidentalis (Cupressaceae)”, Am J Bot., 99(4); pp 690-699 35 Man K H., Hong W H (2000), “Genetic diversity and population structure of Juniperus rigida (Cupressaceae) and Juniperus coreana”, Evol Ecol., 2000, Vol.14.Issue 2, pp 87 62 36 Mellick R., Porter C., Rossetto M (2009), “Isolation and characterisation of polymorphic microsatellite loci from Podocarpus elatus (Podocarpaceae)”, Mol Ecol Res., 9(6), pp 1460-1466 37 Moraga A R., Perez D C., Lucas-Borja M E., Tiscar P A., Viñegla B., Linares J C., Gómez-Gómez L., Ahrazem O (2013), “Genetic Diversity of Pinus nigra Arn Populations in Southern Spain and Northern Morocco Revealed By InterSimple Sequence Repeat Profiles”, Int Jour Mol Scien., 13, pp 5645-5658 38 Nagaoka T., Ogihara Y (1997), “Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers”, Theo App Genet., 94, pp 597-602 39 Nei M (1973), “Analysis of genetic diversity in subdivided populations”, Proc Natl Acad Sci USA., 70, pp 3321-3323 40 Nguyen Minh Tam, Nguyen T Phuong Trang, Nguyen Thi Hoa (2011), “Genetic diversity of an endangered species Fokienia hodginsii (Cupressaceae)”, Afri J Biot., 10(71), pp 15838-15844 41 Nkongolo K K., Gervais S., Michael P., Zhou Y (2014), “Comparative analysis of Inter Simple Sequence Repeats and Simple Sequence Repeats markers: Genetic analysis of Deschampsia cespitosa populations growing in metal contaminated regions in Canada”, Amer J Bioc Biot., 10 (1); pp 69-80 42 Parasharami V A., Thengane S R (2012), “Inter population genetic diversity analysis using ISSR markers in Pinus roxburghii (Sarg.) from Indian provenances”, Int J Biodivers Conserv., (5), pp 219-227 43 Peakall R., Smouse P E (2006), GenAlEx V5: Genetic Analysis in Excel Population genetic software for teaching and research, Australian National University, Canberra, Australia (http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/) 44 Porebski S., Bailey L G., Baum B R (1997), “Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components”, Plan Mol Biol Rep., 15(1), pp 8-15 63 45 Rohlf F J (1992), NTSYS-PC: Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.0, State University of New York (Stony Brook, New York) 46 Semagn K., Bjornstad A and Ndjiondjop M N (2006), “An overview of molecular marker methods for plants”, Afri J Biot., (25), pp 2540-2568 47 Shannon C., Weaver W (1949), The mathematical theory of communication, University of Illinois Press, Urbana, USA 48 Shaw J E., Small R L (2005), “Chloroplast DNA phylogeny and phylogeography of the North American plums (Prunus subgenus Prunus section Prunocerasus, Rosaceae)”, Amer J Bot., 92, pp 2011-2030 49 Tam N M., Hoa N T., Trang N T P (2009), “Genetic variation in threatened conifer Cunninghamia lanceolata var konishii using ISSR markers: Implications for conservation”, J Biol., 31(2), pp 66-72 50 Tam N M., Trang N T P (2012),” Molecular identification of Cupressaceae (Coniferales) in Vietnam based on 18S-rRNA sequence”, Afri J Biot., 11 (18), pp 4158-4162 51 Tsumura Y., Ohba K., Strauss S H (1996), “Diversity and inheritance of intersimple sequence repeat polymorphisms in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica)”, Theo App Genet., 92, pp 40-45 52 Vekemans X., Beauwens T., Lemaire M., Roldan-Ruiz I.(2002), “ Data from amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers show indication of size homoplasy and of a relationship between degree of homoplasy and fragment size”, Mol Ecol., 11, pp.139-151 53 Vendramin G G., Lelli L., Rossi P., Morgante M (1996), “A set of primers for the amplification of 20 chloplast microsatellites in Pinaceae” Mol Ecol., 5, pp 595-598 54 Xiliao S, Jie X, Yin Y Z (2010), “Isolation and characterization of polymorphic microsatellite markers in Calocedrus macrolepis Kurz”, Hort Sci., 45 (1), pp 169-171 64 55 Wang M B., Hao Z Z (2010), “Rangewide genetic diversity in natural populations of Chinese pine (Pinus tabulaeformis)”, Bio Gene., 48, pp 590– 602 56 Wang D.L, Li, Z.C (2004), “Genetic diversity of Calocedrus macrolepis (Cupressaceae) in Southwestern China”, Bio Chem Sys Ecol., v.32, no.9 57 Wu Z Y., Liu J F., Hong W., Pan D M., Zheng S Q (2011), “Genetic diversity of natural and planted Glyptostrobus pensilis populations: a comparative study”, Chin J App Ecol., 22(4), pp 873 58 Yang C P., Wei L., Jiang J., Liu G F., Zhao G Y (2005), “Analysis of genetic diversity for nineteen populations of Pinus sibirica Du Tour with technique of ISSR”, J Nor For Univ., 33, pp 1–3 59 Yap I V., Nelson R J (1996) Winboot: a program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence of UPGMAbased dendrograms, IRRI, Manila 60 Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D (1994), “Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR) anchored PCR amplification”, Genome, 20, pp 176-183 65 ... quần thể loài nhƣ quần thể loài khác Đa dạng di truyền đa dạng thành phần gen cá thể loài loài khác nhau; đa dạng gen di truyền đƣợc quần thể quần thể Đa dạng di truyền biểu đa dạng biến dị di. .. thành hóa học cịn đƣợc ý Công ƣớc quốc tế Đa dạng sinh học (1994) xác định Đa dạng sinh học bao gồm cấp: (i) đa dạng loài (đa dạng di truyền hay đa dạng nguồn gen), (ii) đa dạng loài (đa dạng thành... cá thể quần thể, đa dạng di truyền quần thể Bách xanh thấp [56] 17 Năm 2010, Xiliao cộng [54] sử dụng thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền quần thể Bách xanh Trung Quốc Kết phân tích 34 mẫu Bách