Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm, Sinh học, Tế bào, Tế bào da, Điều trị vết thương, Tế bào gốc mỡ

Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đã được y học thế giới lựa chọn như là liệu pháp hữu hiệu để chữa khỏi một số căn bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy, xương khớp…Trên thế giới,

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐOÀN HOÀNG THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU

TRỊ VẾT THƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐOÀN HOÀNG THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN

TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU

1 TS Đinh Văn Hân

2 PGS TS Ngô Giang Liên

Hà Nội - 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Đinh Văn Hân và PGS TS Ngô Giang Liên – những người thầy đã tận tâm, nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn cũng như động viên, cổ vũ tinh thần cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong những năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học Tế bào - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa học

Xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng trong điều trị Bỏng – Viện Bỏng Quốc Gia đã quan tâm,

hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin được gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học tập để em hoàn thành bản luận văn này!

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương Error! Bookmark not defined 1.2 Công nghệ mô – tế bào làm lành vết thương Error! Bookmark not defined 1.2.1 Tổn thương da và nhu cầu chế tạo chế phẩm điều trị vết thương Error! Bookmark not defined

1.2.2 Một số loại tế bào và vật liệu điều trị vết thương từ nuôi cấy tế bào Error!

Bookmark not defined

1.3 Vai trò tế bào gốc trong liền vết thương Error! Bookmark not defined 1.4 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Error! Bookmark not defined

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined

2.1 Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.3 Trang thiết bị và vật tư Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu: Error! Bookmark not defined 2.2.1 Thu mô mỡ và phân lập tế bào Error! Bookmark not defined 2.2.2 Nhân rộng tế bào Error! Bookmark not defined 2.2.3 Xác định số lượng tế bào: Error! Bookmark not defined 2.2.4 Xác định khả năng tạo dòng (colony) của tế bàoError! Bookmark not defined

2.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào da nuôi

cấy Error! Bookmark not defined

2.2.5.1 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tăng sinh nguyên bào sợi

Error! Bookmark not defined

2.2.5.2 Đánh giá ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mô mỡ lên khả năng di cư của

nguyên bào sợi Error! Bookmark not defined

2.2.5.3 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tăng sinh tế bào sừng Error! Bookmark not defined

2.2.5.4 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến sự di cư tế bào sừng Error! Bookmark not defined

2.2.6 Phương pháp chế tạo tấm tế bào gốc mỡ cho thí nghiệm đồng nuôi cấy Error! Bookmark not defined

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 3.1 Đặc điểm phân lập và hình thái tế bào Error! Bookmark not defined 3.2 Khả năng tạo dòng của tế bào (CFU-F) Error! Bookmark not defined

3.3 Ảnh hưởng tế bào gốc mỡ lên sự tăng sinh và di cư tế bào da qua thí nghiệm

đồng nuôi cấy Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tác động của tế bào gốc mỡ đến nguyên bào sợiError! Bookmark not defined

3.3.2 Tác động của tấm tế bào gốc mỡ đến tế bào sừngError! Bookmark not defined

BÀN LUẬN Error! Bookmark not defined 4.1 Về đặc điểm tế bào phân lập Error! Bookmark not defined 4.2 Tinh lọc tế bào, đặc điểm hình thái và khả năng tạo colony Error! Bookmark not defined

4.3 Ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ lên tế bào da nuôi cấy Error! Bookmark not defined

4.3.1 Ảnh hưởng của tế bào gốc tới nguyên bào sợi daError! Bookmark not defined

4.3.2 Ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào sừngError! Bookmark not defined

4.4 Chế phẩm tấm tế bào gốc trên giá đỡ Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

KIẾN NGHỊ 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau của

quá trình liền vết thương Error! Bookmark not defined

Hình 2 Mô phỏng thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ bằng

phương pháp đồng nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình 3 Tạo vết thương in vitro Error! Bookmark not defined Hình 4 Tách mô mỡ bằng enzym collagenase Error! Bookmark not defined Hình 5 Đĩa tế bào sau 48h nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình 6 Tế bào sau 4 và 10 ngày nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình 7 Tế bào gốc mỡ trên kính hiển vi đảo ngược 50X(A) và 100X(B) Error! Bookmark not defined

Hình 8 Hình thái tế bào gốc mỡ sau khi nhuộm Giemsa (100X)Error! Bookmark not defined

Hình 9 Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ 1 và 5 (50X)Error! Bookmark not defined

Hình 10 Tế bào gốc mỡ tạo colony ở ngày thứ 10 và 20 (50X)Error! Bookmark not defined

Hình 11 Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa Error! Bookmark not defined

Hình 12 Biểu đồ so sánh số lượng tế bào thu được giữa các thí nghiệm đồng nuôi

cấy tấm tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi ở ngày thứ 2.Error! Bookmark not defined

Hình 13 Tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi

(50X) Error! Bookmark not defined Hình 14 Sự gia tăng số lượng nguyên bào sợi theo thời gian.Error! Bookmark not defined

Hình 15 So sánh số lượng tế bào thu được giữa các thí nghiệm đồng nuôi cấy tấm

tế bào gốc với tế bào sừng Error! Bookmark not defined

Hình 16 Tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ lên sự tăng sinh của tế bào sừng Error! Bookmark not defined

Hình 17 Tế bào sừng độ che phủ đạt 100 , tế bào sừng hình ovan và đa diện mọc dày xếp khít nhau ngay trước khi tạo vết cạo để đồng nuôi cấy với tấm tế bào gốc

mỡ và tấm nguyên bào sợi (50X) Error! Bookmark not defined

Hình 18 Ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ lên di cư và biệt hóa của tế bào sừng (50X)

Error! Bookmark not defined

Hình 19 So sánh hình thái tế bào gốc mô

mỡ……….Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AB Antibiotic/Antimycotic - Kháng sinh

ADSCs Adipose-Derived Stem Cells - Tế bào gốc mỡ

DMEM Dubeco‘s Modified Eagle Medium

EGF Epidermal Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng biểu bì

FBS Fetal Bovine Serum - Huyết thanh bào thai bê

FGF Fibroblasts Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi HGF Hepatocyte Growth Factor

ITS-X Insulin, Transferin, Selen - X

KGF Keratinocyte Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng tế bào sừng MCS Mesenchymal stem cells - Tế bào gốc trung mô

PBS Phosphat Buffer Saline - Dung dịch đệm phosphat

PDGF Pletelet-Derived Growth Factor

TB Tế bào

TGF Transforming Growth Factor VEGF Vessle Endothelial Growth Factor

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào gốc là một trong những lĩnh vực sinh học lôi cuốn nhất hiện nay

Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đã được y học thế giới lựa chọn như là liệu pháp hữu hiệu để chữa khỏi một số căn bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy, xương khớp…Trên thế giới, có một số nguồn tế bào gốc được đưa vào ứng dụng như tế bào gốc tủy xương và tế bào gốc máu cuống rốn, các tế bào gốc từ 2 nguồn này chủ yếu là tế bào gốc tạo máu nên được ứng dụng trong nghiên cứu

và điều trị các bệnh về máu, còn các bệnh cần có sự tái tạo thuộc hệ thống trung

mô thì ít được ứng dụng Trong khi đó, các bệnh của trung mô lại rất thường gặp như các vết thương, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim…Một nguồn TB gốc khác đang được kỳ vọng nhiều chính là tế bào gốc phôi, mặc dù có tiềm năng lớn nhưng việc nghiên cứu và sử dụng còn rất khó khăn về công nghệ và đặc biệt là

bị cản trở bởi vấn đề y đức (sử dụng tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc hủy đi một phôi vốn có thể trở thành một con người) Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác các tế bào gốc từ phần phụ của thai như bánh rau, dây rốn Thành công về công nghệ đã có thể tách và nhân lên các tế bào gốc nhưng chỉ có những bệnh nhân có bảo quản dây rốn – bánh rau…khi sinh ra mới có hy vọng được dùng các nguồn tế bào gốc này Hiện nay, chỉ có số lượng rất ít người được lưu giữ dây rốn hay bánh rau sau khi sinh ra, đồng thời chi phí cũng rất tốn kém và xác suất người lưu trữ mô lại có các bệnh cần được điều trị bằng các tế bào gốc này cũng không phải cao

Tế bào gốc mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng khác nhau Mô mỡ là loại mô có sẵn với số lượng lớn và dễ dàng thu hồi nên đây là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tương lai có thể

sử dụng để ghép tự thân và đặc biệt là không gặp phải những vấn đề y đức Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một trong những dạng tế bào quan trọng di cư đến vùng tổn thương để thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thương

2

Tế bào gốc trung mô đã được nghiên cứu tách từ mô mỡ nhưng trong thành phần tế bào được tách còn nhiều dạng tế bào khác như bạch cầu, hồng cầu…Tỷ lệ tế bào gốc trung mô thay đổi nên khó xác định chính xác cần sử dụng bao nhiêu tế bào là cần thiết và bao nhiêu tế bào trong hỗn dịch tế bào mới tách

là đủ để cho một lần ghép điều trị vết thương Do đó, cần nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình tách và tinh lọc tế bào gốc trung mô Nếu như các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thương thuộc

hệ thống trung mô đặc biệt là vết thương và vết bỏng

Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thương bằng ghép tế bào gốc là rất lớn, cụ thể tại Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang các vết thương mạn tính Hàng năm tại miền tây Châu Âu có khoảng 150.000 người cần được điều trị bằng da nhân tạo Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu người bị loét

và chi phí lên tới hơn 1 tỷ Euro dành cho điều trị

Tại Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn về bỏng [8] Tuy chưa có con số thống kê cụ thể nhưng chỉ tính riêng tại Viện Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị thì nhu cầu về ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc

mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau:

1 Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều kiện nuôi cấy invitro

2 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương

Diễn biến liền vết thương nói chung đều trải qua các giai đoạn đông máu, viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo [3] Tuy quá trình liền vết thương có nhiều

cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thương Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con người cần có da Thành phần tế bào da người chủ yếu bao gồm 2 loại là nguyên bào sợi (Fibroblasts) và tế bào sừng (Keratinocytes) Nguyên bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhưng lại tương tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh Hai loại tế bào này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thương da Khi da bị tổn thương, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện để tế bào sừng từ bờ mép vết thương tăng sinh che phủ bề mặt làm lành vết thương

Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn

tăng sinh, chúng tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu

mô hoá và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu

mô bám và trượt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ vết thương Chúng tạo ra protein đệm mà trong đó collagen tạo nên sự bền vững và toàn vẹn của mô Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số yếu tố tăng trưởng (growth factors - GF) kích thích liền vết thương như TGF-β, PDGF, KGF [44], [45], [67], [76] Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thương nhanh hơn Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thương Ngày thứ 2 sau khi bị thương bị bỏng, nguyên bào sợi xuất hiện ở vết thương do sự dịch chuyển từ mô liên kết bên cạnh Sản xuất các siêu sợi actin

4 của cơ trơn chuyển nguyên bào sợi thành myofibroblast, gây co kéo làm hẹp vết thương (1-2 mm/24 giờ) Tổng hợp men Metalloproteinase, collagenase gây thoái huỷ protein khoảng kẽ; men Stomalysin thoái huỷ protein màng nền Điều hoà tổng hợp và thoá biến collagen thông qua FGF-, TGF- Sắp xếp collagen theo cấu trúc mô Trong khoảng thời gian từ 5-7 ngày, các nguyên bào sợi tăng sinh, và được kích thích tiết PDGF, TGF-beta để điều khiển quá trình tổng hợp

và lắng đọng các thành phần đệm gian bào bao gồm: fibronectin, laminin, glycosaminoglycans (GAGs) và collagen Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thương đã liền

Tế bào sừng (Keratinocytes) tạo nên lớp biểu bì bảo vệ cơ thể Biểu bì

gồm nhiều lớp tế bào biểu mô lát tầng sừng hóa, thành phần chính là các tế bào sừng gồm nhiều lớp tế bào sắp xếp chặt chẽ với nhau [1] Lớp mầm hay còn gọi

là lớp đáy chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tồn tại, tự tái sinh nhiều lần

và nhanh trong suốt cuộc sống của con người Giữa các tế bào sừng có các cầu nối gian bào làm kết nối chặt chẽ giữa chúng với nhau Các tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên Trong các tế bào của lớp mầm biểu bì thì chỉ có 10 là tế bào mầm biểu bì còn lại là các tế bào đang ở các giai đoạn gián phân Bình thường sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhưng khi da bị tổn thương thì chúng tăng cường phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô Các tế bào biểu mô sẽ di cư vào trung tâm của vết thương

ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của biểu bì Trong quá trình di cư chúng cần đệm gian bào đủ chất lượng như trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám vào và trượt dọc theo các sợi đó để di chuyển vào trung tâm vết thương Trong trường hợp các vết thương mạn tính, cấu trúc đệm gian bào bị tổn thương không

5 hồi phục, vết thương trở nên xơ sợi, các nguyên bào sợi nghèo nàn hoặc không thể thực hiện đầy đủ chức năng nên các tế bào biểu mô không thể phân chia hay

di cư vào vết thương Chính các mối tương tác chặt chẽ giữa hai loại tế bào trên

mà trong điều trị cần chú ý tới các điều kiện để cả hai cùng tăng sinh, cùng biệt hoá, cùng thực hiện chức năng liền vết thương thì vết thương mới nhanh liền

Hình 1 Sơ đồ sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau

của quá trình liền vết thương

(Nguồn: Werner S et al (2003), Physiol Re;83:835-870), [79]

A 12-24 giờ sau bị thương, nguyên bào sợi quanh tổn thương được kích hoạt

B Từ 3-7 ngày sau bị thương, nguyên bào sợi di cư vào vùng tổn thương, tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào

C Từ 1-2 tuần sau bị thương, mô hạt hình thành, nguyên bào sợi chuyển

dạng thành myofibroblast gây co hẹp vết thương và tiết collagen

6

1.2 Công nghệ mô – tế bào làm lành vết thương

1.2.1 Tổn thương da và nhu cầu chế tạo chế phẩm điều trị vết thương

Như chúng ta đã biết da là cơ quan lớn nhất của cơ thể và có vai trò là một

cơ quan bảo vệ cơ thể trước các tác động với môi trường xung quanh Da bảo vệ các cơ quan phía dưới da và bảo vệ cơ thể chống lại các mầm bệnh và vi sinh vật Da trực tiếp tiếp xúc với các yếu tố độc hại tiềm tàng như vi khuẩn, nhiệt, các tác động cơ học và hóa học Trong 25 năm qua, các cố gắng lớn đã tạo ra các vật liệu thay thế mang tính bắt chước da người [50] Ở da công nghệ mô, các vật liệu tổng hợp hay sinh học được kết hợp với các tế bào nuôi cấy để tạo ra các mô

có chức năng của da [74]

Các vật liệu thay thế da này được chế tạo dựa trên các tiến bộ về công nghệ

mô và đã được ứng dụng trong lâm sàng, chúng thúc đẩy sự liền vết thương cấp

và mạn tính và được sử dụng như một cơ quan phức hợp cho hệ thống thử nghiệm cơ bản hoặc các nghiên cứu về dược [59] Một vấn đề chính trong việc tăng sinh tế bào là đáp ứng yêu cầu cần đạt đủ số lượng các tế bào cần thiết, trong khi vẫn đảm bảo được tính chất bình thường của tế bào và cả chức năng của chúng Các

tế bào này sau đó chỉ được sử dụng cho các mục đích hoặc là tạo vật liệu thay thế da phù hợp cho cấy ghép hoặc là cho các thử nghiệm in vitro [27], [66]

Có rất nhiều lý do gây nên tổn thương da bao gồm các hội chứng do gen, chấn thương cấp tính, vết thương mạn tính hoặc các can thiệp ngoại khoa Một trong các lý do phổ biến nhất là tổn thương da do bỏng Ngay khi da bị tổn thương, hàng loạt các vấn đề phức hợp bắt đầu diễn ra: các tế bào miễn dịch bị lôi kéo tới vùng thương tổn, mô đệm mới được sinh ra bởi nguyên bào sợi, tiếp theo là tái biểu mô hóa do tế bào sừng đảm nhiệm và cuối cùng là sự tái phân bố mạch của vết thương [54] Quá trình liền vết thương phức tạp này được kích thích và kiểm soát bởi các cytokine và các yếu tố tăng trưởng khác nhau [25] Kích thước vết thương là yếu tố chủ đạo cho biểu mô hóa Tổn thương toàn bộ lớp da với kích thước lớn hơn 1 cm đường kính thì cần phải ghép da để đề phòng

7 tạo sẹo dẫn đến di chứng về chức năng hay thẩm mỹ [55] Mảnh ghép hoàn hảo nên phải sẵn có, không gây đáp ứng miễn dịch, che phủ và bảo vệ nền vết thương, làm tăng nhanh liền vết thương, ít gây đau và ít tạo sẹo

Trong trường hợp tổn thương diện tích rộng các tế bào có chức năng liền vết thương của bệnh nhân không đủ khả năng làm lành tổn thương mà cần phải ghép da tự thân nhưng nguồn da tự thân cũng không phải vô hạn nên ghép da tự thân cũng chỉ cứu được những bệnh nhân bỏng sâu 50 diện tích cơ thể là chủ yếu Trong lĩnh vực điều trị bỏng và chấn thương lớn, mặc dù đã có nhiều tiến

bộ trong cứu chữa như cắt hoại tử - ghép da ngay, tăng độ giãn rộng của da ghép [14], sử dụng da đồng loại hay các vật liệu thay thế da khác nhau [9], [10], [11], [12] nhưng các rối loạn về protein, thay đổi hệ thống miễn dịch làm cho vết thương trở nên chậm lành hay rất khó lành [2], [7]

Ngoài ra chúng ta còn gặp các loại vết thương mạn tính rất khó lành như các vết loét do tiểu đường, loét do viêm tắc tĩnh mạch, loét điểm tỳ, loét xạ trị…

mà không thể can thiệp bằng phẫu thuật ghép da nguy cơ thất bại rất cao do khả năng tiếp nhận mảnh ghép của vết thương rất kém và tình trạng bệnh nhân không cho phép phẫu thuật Số lượng bệnh nhân này ngày càng tăng cao cùng sự phát triển kinh tế - xã hội và tuổi thọ con người [10], [26] Các vết thương này bị gián đoạn giai đoạn tăng sinh hoặc tế bào tham gia liền vết thương bị chuyển dạng [7], [9], [13], [23], [38] Để khắc phục hạn chế này nhằm thay thế các tế bào đã tổn thương, công nghệ nuôi cấy tế bào da phát triển

Từ những năm trước, một số nhà nghiên cứu cho rằng điều trị vết thương vết bỏng trong tương lai sẽ trở nên đơn giản, nhanh chóng và dễ dàng che phủ tổn thương sau cắt hoại tử Nhưng thực tế, điều đó còn rất xa vời Khái niệm này

đã dẫn đến một số quan niệm sai trầm trọng dẫn đến việc đưa ra những hứa hẹn quá sớm về công nghệ mô da mà chậm được nhận ra trên thực tế lâm sàng Khái niệm sai này là coi da như một mô giống như xương sụn và sẽ liên quan đơn giản tới nơi có thay đổi về công nghệ mô Dù da không phải là một mô nhưng là

8 một tổ chức hoàn toàn tổng hợp mang đến bởi sự kết hợp tế bào từ 3 nguồn gốc phôi gồm ngoại bì trung bì và ống thần kinh Những thành công hiện đại về tạo

ra những sản phẩm thay thế da đã trở nên bị hạn chế hơn so với mong đợi và bây giờ những sản phẩm da công nghệ mô đang được mô tả như vật liệu thay thế da giúp liền vết thương và sửa chữa, thay thế da tạm thời và thường hỗ trợ cho việc tái sinh Quá trình liền vết thương, vết bỏng có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập các mô tế bào đã bị tổn thương Do đó, quan niệm mới trong điều trị các tổn thương ở bất cứ cơ quan nào trên cơ thể là các tế bào tổn thương phải được thay thế bằng các tế bào khỏe mạnh [4]

Cho đến ngày nay, người ta đã chế tạo được các tấm nguyên bào sợi, tấm tế bào sừng, thậm chí cả các tấm vật liệu chứa cả hai loại tế bào trên mà người ta gọi là các vật liệu tương đương da hoặc da nhân tạo…[57], [70] Tuỳ theo nguồn gốc tế bào sừng trên tấm vật liệu là tự thân hay khác gen đồng loài (gọi tắt là đồng loài) mà người ta chế được vật liệu có tính chất vĩnh viễn (không thải ghép) hoặc tạm thời

Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tương đương da được ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thương mạn tính trong thẩm mỹ và nghiên cứu thuốc…

So với ghép da tử thi, các vật liệu này có thuận lợi lớn là không phụ thuộc nguồn

da người cho, việc sản xuất chúng gần như vô hạn và hầu như không có nguy cơ lây nhiễm bệnh do có thể kiểm soát trước được nguồn cho tế bào bằng các xét nghiệm tầm soát các bệnh lây truyền qua ghép mô/tế bào Có hai thành phần chính của vật liệu tương đương da là thành phần khuôn và thành phần tế bào Thành phần khuôn hay được sử dụng là collagen, acid hyaluronic, polymer tổng hợp hoặc sinh tổng hợp Thành phần tế bào bao gồm các tế bào da như nguyên bào sợi, tế bào sừng là hai tế bào chủ yếu, ngoài ra có thể có tế bào sắc tố… Đã

có những sản phẩm thương mại sẵn có trên thị trường như Epicell, Integra, Transcyte, Apligraft, Dermagraft…

9

1.2.2 Một số loại tế bào và vật liệu điều trị vết thương từ nuôi cấy tế bào

Trị liệu tế bào nói chung đã mang lại một số kết quả đáng kể trong lâm sàng, một số tế bào được nuôi cấy và ứng dụng phổ biến là:

Tế bào sừng (Keratinocyte) Trong vài thập niên trở lại đây, cấy ghép tế

bào sừng tự thân nuôi cấy đã được triển khai tại các trung tâm điều trị bỏng lớn ở Anh, Mỹ, Nhật Việc cấy ghép tế bào sừng lên vết thương góp phần giải quyết

sự thiếu hụt nguồn da lành Thành công do ghép tế bào sừng nuôi cấy còn nhiều hạn chế, do khi đặt tế bào sừng nuôi cấy lên vết thương bỏng sâu, nền vết thương thiếu các yếu tố trung bì do chưa hoặc hình thành chậm màng đáy Để khắc phục điều đó, người ta đã sử dụng cấy ghép kết hợp fibroblasts và tế bào sừng [40] Ứng dụng tế bào sừng nuôi cấy, người ta đã chế tạo ra các tấm vật liệu thay thế biểu bì Để sản xuất vật liệu thay thế biểu bì, một mẩu da sinh thiết khoảng 2-5cm2 cần phải được lấy từ bệnh nhân Công việc này có thể phải kết hợp với lần phẫu thuật cắt hoại tử của bệnh nhân bỏng Rồi sau đó, biểu bì được tách khỏi lớp trung bì và các tế bào sừng đơn lẻ được phân lập nhờ enzyme và nuôi cấy cùng với nguyên bào sợi chuột đã bất hoạt khả năng phân chia Môi trường nuôi cấy tăng sinh được sử dụng có chứa FBS và các chất cần thiết khác; tuy nhiên, cũng có thể làm tăng sinh các tế bào này trong điều kiện không có tế bào dị loại Hiện nay, đã có các vật liệu thay thế biểu bì tự thân được thương mại hóa cho sử dụng trên lâm sàng như: Epicel, EpiDex, EpiBase, MySkin, Laserskin, Bioseed-S

Đã có một số nghiên cứu thử nghiệm ghép tế bào biểu bì đồng loại như Celaderm [17], [42]; tuy nhiên, hiệu quả và tính an toàn của các sản phẩm này phải được khẳng định bằng nghiên cứu lâm sàng có đối chứng Các sản phẩm đồng loại có lợi ích là giảm chi phí sản xuất so với chi phí sản xuất sản phẩm tự thân Hơn bao giờ hết, sự thiếu sót của cả hai sản phẩm là chúng khó bám và do

đó dễ dẫn đến việc tạo thành nốt phồng [80]

Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào có nguồn gốc trung mô, chúng sản

sinh ra collagen có vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa vết thương, phục

10 hồi cấu trúc và chức năng của mô [5] Ở mức độ phân tử, lớp trung bì rất quan trọng cho các tế bào biểu bì phát triển và trưởng thành chúng tiết ra các yếu tố như các sợi fibrin gắn kết, các yếu tố kết dính để gắn biểu bì vào trung bì Vết bỏng sâu thiếu các thành phần trung bì hoặc lớp trung bì chưa hình thành hoặc hình thành chậm Cần thiết phải tạo ra một lớp trung bì mới để tạo điều kiện cho

da ghép tự thân hoặc tế bào sừng nuôi cấy che phủ lên vết thương cho kết quả tối

ưu nhất [40] Hiện nay, các nhà nghiên cứu đều cho rằng, vật liệu thay thế da lý tưởng nhất là phải thay thế được cả lớp trung bì và biểu bì Sự tương tác giữa các yếu tố thuộc lớp biểu bì và trung bì sẽ kích thích sự trưởng thành của từng lớp Boyce và Hansbrough đã tạo ra vật liệu thay thế da hỗn hợp (composite subtitues) gồm nguyên bào sợi người nuôi cấy được cấy lên tấm màng collagen-glycosaminoglycan sau đó cho tế bào sừng phát triển lên trên, vật liệu này đã được thử nghiệm thành công trên mô hình chuột, nhưng còn một số hạn chế khi thử nghiệm lâm sàng Một xu hướng khác, đơn giản hơn và không đòi hỏi cao về công nghệ đó là sử dụng fibroblasts nuôi cấy đưa lên vết thương Nguyên bào sợi sẽ tổng hợp các thành phần của trung bì, tạo điều kiện cho việc ghép da tự thân hoặc cấy ghép tế bào sừng thành công [33], [40], [70]

Để điều trị bỏng sâu, cả lớp biểu bì và lớp trung bì của da cần được thay thế, việc điều trị bằng tấm tế bào biểu bì đơn thuần sẽ dẫn đến chất lượng liền vết thương thấp Tương phản với tấm biểu bì nuôi cấy, các cấu trúc trung bì từ công nghệ có thể dự phòng co kéo vết thương và tạo ra tính bền vững cơ học tốt hơn Vật liệu tương đương trung bì và biểu bì phải được ghép kế tiếp nhau việc làm cho tuần hoàn hóa trung bì tốt sau khi loại bỏ nền vết thương là cần thiết trước khi ghép lớp biểu bì [35] Một số vật liệu này là mảnh ghép đồng loại đã được xử lý bằng hóa chất, ví dụ Alloderm không có thành phần tế bào gây ra đáp ứng miễn dịch thải ghép [77] Ngược lại, Dermagraft lại có các nguyên bào sợi

từ da bao quy đầu của người được nuôi cấy trên lưới polyglactin có khả năng giáng hóa [72] Trong các vật liệu này, các tế bào tiết protein đệm gian bào, hàng

11 loạt các yếu tố tăng trưởng và cytokin vào trong vết thương cho đến khi chúng trải qua quá trình tự hủy bình thường sau vài tuần ghép

Purdue (1997) sử dụng tấm fibroblasts nuôi cấy là Dermagraft và so sánh với ghép da tử thi cho 66 bệnh nhân bỏng sâu được cắt hoại tử Tác giả nhận thấy, tấm fibroblasts nuôi cấy có kết quả tốt tương đương với da tử thi trong việc hình thành mô hạt, kết quả về da ghép tự thân là tương đương, nhưng tấm fibroblasts dễ bóc khỏi mô hạt để ghép da tự thân nên không gây chảy máu như

da tử thi Tiếp tục theo dõi di chứng bỏng, tác giả nhận thấy vùng ghép fibroblasts có kết quả rất tốt về thẩm mỹ [61] Hansbrough (1997) đã đánh giá khả năng của Dermagraft che phủ vết bỏng sau cắt hoại tử trên 10 vết thương có

so sánh với da tử thi Tác giả nhận thấy, khả năng bám dính, khả năng sống của Dermagraft là tương đương da tử thi, kết quả da ghép sống tương đương vùng ghép da tử thi Không thấy có biểu hiện thải loại miễn dịch trong khi 4/10 vùng ghép da tử thi có biểu hiện thải loại lớp thượng bì [33]

1.3 Vai trò tế bào gốc trong liền vết thương

Mặc dù có nhiều tiến bộ đáng kể trong y tế và chăm sóc vết thương bằng các can thiệp ngoại khoa, việc điều trị các tổn khuyết da diện rộng và vết thương mạn tính vẫn còn là thách thức lớn với y học hiện nay Trong liền vết thương, tế bào gốc trung mô được xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau [65] Đã và đang có rất nhiều người quan tâm cả về khoa học nghiên cứu và lĩnh vực lâm sàng điều trị vết thương về tiềm năng và vai trò của các trị liệu tế bào dựa trên MSC trong việc kích thích tăng nhanh quá trình sửa chữa và tái tạo

mô vết thương Các nghiên cứu với MSC tủy xương đã cho thấy việc điều trị vết thương bằng tế bào MSC tủy xương đều làm tăng nhanh quá trình liền vết thương, tăng quá trình biểu mô hóa và tăng tạo mạch [26], [82] Người ta thấy MSC làm tăng nhanh liền vết thương ở cả vết thương cấp tính ở chuột có tăng và không gây tăng đường máu và cả ở vết thương cấp tính trên người [26]

12 Các nghiên cứu gần đây gợi ý rằng, MSC có khả năng tiết ra nhiều cytokin và các chất hóa ứng động khác nhau vốn có vai trò quan trọng cho hoạt động sửa chữa mô, thậm chí trên cả các mô hình tổn thương thận và não [73] MSC làm nhanh quá trình liền vết thương là do ít nhất có 2 cách thức khác nhau bao gồm thông qua tăng biệt hóa tế bào và thông qua các tín hiệu ngoại lai Các MSC tủy xương đã được báo cáo là có thể biệt hóa thành tế bào sừng trong các nghiên cứu có sử dụng EGFP [82] Trong các vết thương này, một phần trăm các

tế bào có biểu hiện EGFP dương tính ở cả trung bì và biểu bì cũng có biểu hiện với keratin vốn là marker chuyên biệt của tế bào sừng Tuy nhiên, với tỷ lệ được đưa ra là quá thấp nên MSC vẫn chưa được coi chắc chắn là có trách nhiệm đối với quá trình sửa chữa mô thông qua tăng biệt hóa chuyển dạng và tái sinh hoặc phá hủy mô [58], [82] Những chứng cớ tích cực hơn cũng đã cho thấy, MSC có thể thúc đẩy liền vết thương thông qua các tín hiệu ngoại lai được tiết ra mà cải thiện các đáp ứng với tổn thương của các tế bào da cư trú tại đó Các báo cáo gần đây bắt đầu xác định những tương tác ngoại lai này giữa MSC và các dạng tế bào chuyên biệt khác trong vết thương da [15], [22], [81] Khi nghiên cứu các vết thương được điều trị bằng dịch nổi nuôi cấy MSC (dịch chiết ngoại bào MSC), các tác giả nhận thấy dịch chiết ngoại bào MSC đã làm vết thương nhanh đóng kín và nó tăng hấp dẫn với các đại thực bào và các tế bào nội mô đầu dòng thâm nhập đến vết thương [22] và các thí nghiệm in vitro chỉ ra rằng dịch ngoại bào MSC cũng thúc đẩy tế bào sừng và tế bào nội mô tăng sinh Hơn nữa, MSC tủy xương còn tiết ra các chất hóa ứng động với đại thực bào, tế bào sừng và các tế bào nội mô Các quan sát này rõ ràng chỉ ra rằng MSC tủy xương là một nguồn các tín hiệu ngoại lai có tác dụng điều khiển các đáp ứng tế bào quan trọng trong sửa chữa vết thương da

Do đó, một trong những hướng nghiên cứu khác trong điều trị vết thương

là sử dụng các tế bào gốc Người ta thấy chúng đảm nhiệm việc đánh giá sự thiếu hụt sinh lý học về các thành phần đệm và các cytokine, chúng sửa chữa các thiếu

13 hụt đó bằng cách tạo ra những yếu tố thích hợp thúc đẩy liền vết thương Điều này có nghĩa là tế bào gốc hoạt động như một cỗ máy có kiểm soát tương tác các thông tin ngược một cách thông minh có thể tự điều chỉnh hệ thống sinh học Tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn đều đã được nghiên cứu sử dụng trong điều trị vết thương mạn tính để thúc đẩy các đáp ứng liền vết thương [75]

Tế bào gốc là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới Đây là các tế bào còn chưa hay rất ít biệt hoá nên chúng có khả năng biệt hoá theo nhiều hướng và tạo ra nhiều loại tế bào khác nhau Ngoài ra, chúng cũng có khả năng tự sinh ra các tế bào giống hệt nó Thông thường các tế bào phân chia theo phương thức nhân đôi đối xứng tạo ra hai tế bào giống hệt nhau về mức độ biệt hoá Tế bào gốc không chỉ có khả năng phân chia đối xứng mà còn có khả năng phân chia không đối xứng thành hai tế bào khác nhau, trong đó một tế bào giữ nguyên mức độ biệt hoá cũng như giữ nguyên vai trò là tế bào gốc và một tế bào thứ hai đã biệt hoá hơn, chúng sẽ tiếp tục biệt hoá thành các tế bào tiền thân

để sau đó phát triển thành tế bào chuyên biệt tham gia vào cấu trúc và chức năng của mô, cơ quan Nhờ đó mà số lượng tế bào gốc được duy trì hoặc tăng lên chứ không mất đi do quá trình biệt hoá tế bào

Những nghiên cứu về tế bào gốc đã chứng minh, hàng ngày cơ thể chúng

ta thay thế những tế bào già chết là do nguồn tế bào gốc biệt hoá thành những tế bào chức năng Khi bị thương các tế bào gốc từ các ổ (niche) có thể ở gần vết thương hoặc từ các mô khác nhau như tuỷ xương… sẽ di cư đến và biệt hoá thành các tế bào chuyên biệt có chức năng liền vết thương Khi nguồn tế bào gốc này không đủ đáp ứng với những tổn thương tế bào do tổn thương diện tích rộng,

do cơ thể bị suy yếu… thì hậu quả là gây ra những vết thương vết loét lâu lành, thậm chí không liền được Do đó công nghệ tế bào gốc đang mang lại những hy vọng lớn trong việc khắc phục những nan giải hiện nay trong liền vết thương Những tế bào gốc phôi có tiềm năng lớn thay thế toàn bộ các tế bào chức

14 năng của cơ thể Nhưng việc sử dụng tế bào gốc phôi vào lĩnh vực liền vết thương hay bất cứ lĩnh vực nào khác đang gặp phải những vấn đề về đạo đức, cần có nguồn thay thế Hơn nữa, một báo cáo gần đây cho thấy tế bào gốc phôi của người trong nuôi cấy có biểu hiện protein không phải của người và giả thiết đặt ra là có thể từ protein chuột từ fibroblasts chuột của lớp nuôi (feeder layer), do đó tính an toàn của tế bào gốc phôi còn phải tiếp tục nghiên cứu [51]

Một số nguồn tế bào gốc khác nhau từ máu cuống rốn, tế bào gốc máu ngoại vi và tuỷ xương cũng đang được nghiên cứu [19], [32], [37], [75] Một nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ bFGF và VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xương cao hơn rất nhiều so với fibroblasts trung bì Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xương tại chỗ vết thương

để thúc đẩy liền vết thương

Một nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ bFGF và VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xương cao hơn rất nhiều so với fibroblasts trung bì Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xương tại chỗ vết thương để thúc đẩy liền vết thương [32]

Tuy nhiên có tác dụng liền vết thương vết bỏng nhưng các nguồn tế bào gốc từ các mô của cơ thể như máu tuỷ xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn, não,

mỡ, gan… đều rất hạn chế về số lượng nên tính ứng dụng chưa cao Trong khi

đó, khai thác các nguồn tế bào gốc trung mô trưởng thành cũng đang là một trong những hướng nghiên cứu điều trị vết thương Ngoại trừ các trường hợp ghép tế bào gốc trung mô đồng loại vốn sẵn có nguồn tế bào rất trẻ như tế bào gốc trung mô từ màng ối, dây rốn và máu cuống rốn thì đối với các trường hợp ghép tế bào gốc trung mô tự thân chỉ có thể lấy từ 2 nguồn chính là tủy xương và

mô mỡ, các nguồn khác từ mô gan, não và cơ hầu như không có khả năng ứng dụng trong điều trị vết thương Nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương chủ yếu là tế bào gốc tạo máu đã và đang được ứng dụng trong điều trị các bệnh về cơ quan tạo máu nhưng chúng có rất ít các tế bào trung mô vốn tham gia vào việc tái tạo vết

15 thương Tuy có một số nghiên cứu cho thấy tế bào gốc trung mô tủy xương làm tăng khả năng liền vết thương mạn tính nhưng tính ứng dụng chưa cao bởi rất hạn chế về số lượng tế bào trung mô Do đó tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được coi là nguồn tế bào gốc trưởng thành tự thân lý tưởng cho các nghiên cứu về y học tái tạo, công nghệ mô và liền vết thương

1.4 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ

Tế bào gốc mô mỡ được xác định là tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung

mô lần đầu tiên được mô tả là dạng tế bào từ tủy xương có khả năng tạo dòng, bám dính bề mặt nuôi cấy [31] mà có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào sụn và tế bào xương [56] Sau đó , chúng được xác định là có mặt ở rất nhiều mô

cơ quan khác nhau như cơ, não, và mô mỡ [52] Ngày nay, tế bào gốc trung mô

từ tủy xương và mô mỡ được xác định là rất giống nhau về quần thể tế bào và kiểu hình tế bào [52]

Tế bào gốc đa tiềm năng đã được phát hiện trong mô mỡ của người và được gọi là tế bào gốc mô mỡ Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng tế bào gốc mô mỡ có thể điều trị một số bệnh về khớp, mà liệu pháp điều trị khác không thành công Mô mỡ còn được sử dụng để tạo hình một số bộ phận trong

cơ thể như ngực, má, cằm Đây được coi như là cuộc cách mạng trong lĩnh vực tạo hình thẩm mỹ Tế bào gốc mô mỡ thể hiện các đặc điểm của tế bào gốc trung

mô như hình thái dạng nguyên bào sợi, là tế bào bám bề mặt nuôi cấy, có các dấu ấn biệt hóa của tế bào trung mô, có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào cơ…Do mô mỡ là loại mô sẵn có với số lượng lớn và dễ dàng thu hồi mà ít gây những bất lợi cho bệnh nhân nên tế bào gốc mô mỡ có thể sẽ là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tương lai đặc biệt các trường hợp sử dụng ghép tự thân Các nhà nghiên cứu đề xuất nhiều cách thức phân lập

tế bào gốc mô mỡ khác nhau, có tác giả phân lập theo cách kinh điển là nuôi mô

mỡ trong đĩa nhựa có môi trường dinh dưỡng và chờ cho tế bào tự mọc từ các mẩu mô ra và thu các tế bào có hình sao hoặc hình thoi là tế bào gốc trung mô

16

Có tác giả lại dùng collagenase để phá hủy cấu trúc mô sau đó ly tâm lọc lấy các

tế bào Môi trường nuôi cấy cũng được công bố theo nhiều công thức khác nhau, các tác giả dùng môi trường cơ bản khác nhau như DMEM, DMEM-F12, CMRL1066 ngay DMEM thì cũng có tác giả dùng môi trường cơ bản là DMEM có hàm lượng glucose cao nhưng có tác giả dùng môi trường có hàm lượng glucose thấp, hoặc như thành phần các yếu tố bổ sung cũng chưa thống nhất Khối tế bào thu được có thành phần tế bào khác nhau gồm tế bào gốc trung mô, tế bào máu có tác giả sử dụng nguyên khối tế bào sau khi phân lập

để điều trị vết thương nhưng cũng có tác giả sử dụng có chọn lọc chỉ tế bào gốc trung mô thuần nhất Cách thức sử dụng tế bào để tăng tối đa hiệu quả các lần ghép điều trị vết thương cũng khác nhau, có tác giả dùng khối tế bào tiêm vào vết thương, có tác giả phun hỗn dịch tế bào lên vết thương nhưng cũng có tác giả nuôi cấy tế bào gốc trung mô trên giá đỡ và ghép vào bề mặt vết thương Chính

vì các lý do trên mà cần có những nghiên cứu đánh giá để xây dựng nên quy trình phù hợp cũng như tiêu chuẩn khối tế bào dùng điều trị cũng như chỉ định hay cách thức sử dụng tế bào gốc trung mô trong điều trị vết thương

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng của tế bào gốc mỡ đối với các bệnh liên quan đến liền vết thương Theo Hyoju Kim và cộng sự (2012) điều trị bằng laser công suất thấp với cấy ghép tế bào gốc mỡ trên chuột hủy miễn dịch Nhóm tác giả cho rằng sự kết hợp này tăng cường phản ứng của tế bào về biểu hiện gen và sự bài tiết của các yếu tố tăng trưởng và phát triển tế bào thông qua màng ty thể, giúp tăng đáng kể số lượng nang lông và tuyến bã nhờn[39] Sheng-Ping Huang (2013), trên chuột Sprague-Dawley bị gây loét bằng chùm tia điện tử sau đó được điều trị bằng ghép tế bào gốc mỡ Kích thước vết thương sau khi điều trị nhỏ hơn đáng kể sau 3 tuần Tác giả cho rằng tế bào gốc mỡ có liên quan với sự phát triển của các mạch máu mới [69] Ann Katharin Reckhenrich

và cộng sự (2014), chậm liền vết thương và hình thành sẹo là một trong những biến chứng thường gặp nhất sau khi can thiệp phẫu thuật Do vậy sử dụng tế bào

17 gốc trung mô từ mô mỡ như một nhân tố trung gian trong việc kích hoạt vật liệu sinh học giúp liền các vết khâu phẫu thuật [62]

Trong công nghệ sinh học da, mục đích cuối cùng trong nghiên cứu và điều trị là để nhanh chóng tạo ra một cấu trúc hoàn hảo phục hồi hoàn toàn chức năng da

Trong số bệnh nhân bỏng, có nhiều bệnh nhân bỏng nặng không đủ nguồn

da thay thế đã dẫn đến suy mòn, suy kiệt và tử vong Viện Bỏng Quốc Gia trong

5 năm đã nghiên cứu trị liệu tế bào trong điều trị vết thương vết bỏng, các tấm tế bào da nuôi cấy đã được chế tạo và sử dụng trong điều trị đạt nhiều kết quả tốt góp phần cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện rộng hoặc tổn thương khuyết

da rộng hoặc những bệnh nhân vết thương mạn tính lâu liền

Viện Bỏng Quốc Gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào sừng để điều trị vết thương và vết bỏng Tuy nhiên, việc nuôi cấy tế bào da

tự thân không đáp ứng kịp nhu cầu lâm sàng do quy trình cần thời gian dài, việc nuôi cấy các tế bào da đồng loại đáp ứng kịp thời về mặt thời gian nhưng gặp phải vấn đề thải ghép Mô mỡ tự thân dễ dàng lấy hơn, nhất là vùng bụng rất thích hợp để nuôi cấy tế bào gốc mỡ [41]

Xuất phát từ các cơ sở khoa học và thực tiễn về tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, cần thiết phải nghiên cứu thiết lập quy trình chuẩn

và có hiệu quả tách tế bào cao nhất, các tế bào cần được tinh lọc và thể hiện tính gốc như khi chúng tồn tại trong cơ thể người Việc đánh giá tác động của nguồn

tế bào gốc sau khi tách tới sự tăng sinh và di cư của cả 2 loại tế bào da gồm nguyên bào sợi và tế bào sừng là cơ sở tiếp tục cho việc định hướng và chế tạo chế phẩm điều trị vết thương trong tương lai

Tế bào gốc mô mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào xương, tế bào tiết insulin, tế bào sụn [45], [84], [85] Tác giả Xu W (9-2014) đã biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô

mỡ thành tế bào dạng nguyên bào sợi để điều trị vết thương ở thanh quản [36]

18 Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một trong những dạng tế bào quan trọng di cư đến vùng tổn thương để thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thương

Trước khi ứng dụng tế bào gốc trung mô vào lĩnh vực điều trị vết thương, cần đánh giá tiền lâm sàng bằng các thử nghiệm trong labo về tác động của chúng đối với các tế bào da như nguyên bào sợi và tế bào sừng Nếu như các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thương thuộc

hệ thống trung mô đặc biệt là vết thương và vết bỏng

Tế bào gốc trung mô có các dấu ấn bề mặt và dấu ấn gen tương tự như tế bào gốc trung mô tủy xương Điều thuận lợi hơn là tế bào gốc mô mỡ lại dễ phân lập và có khả năng tăng sinh mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô tủy xương

Do đó, tế bào gốc mô mỡ có nhiều hy vọng được ứng dụng rộng rãi trong sửa chữa và tái tạo mô

Khám phá vai trò của tế bào gốc mô mỡ đối với liền vết thương da, chúng tôi khảo sát liệu tế bào gốc mô mỡ và sự tương tác qua tiếp xúc tế bào giữa tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi da và tế bào sừng của người có thúc đẩy sự tăng sinh và di cư không Hơn nữa, sự tiết collagen được đánh giá và hoạt động

di cư của nguyên bào sợi cũng như tế bào sừng được nghiên cứu trên mô hình vết thương thực nghiệm in vitro

19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

ADSCs: tế bào gốc được phân lập từ mẫu mô mỡ 30 mẫu mô mỡ được thu

từ bệnh nhân di chứng bỏng cần phẫu thuật ghép da

Tế bào sừng và nguyên bào sợi đã được phân lập từ mẫu da thu từ phẫu thuật cắt bỏ bao quy đầu của 05 trẻ em

Các bệnh nhân hoặc người nhà bệnh nhân này đều đồng ý hiến phần mỡ hoặc phần da bỏ đi dùng cho nghiên cứu và được chấp nhận bởi ban đạo đức nghiên cứu y sinh bệnh viện Tiêu chuẩn người hiến mô đạt yêu cầu về sàng lọc HIV, HBsAg, HCV và giang mai với test nhanh âm tính

Tiêu chuẩn về pháp lý: Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân đồng ý hiến phần mô bỏ đi trong các phẫu thuật điều trị di chứng bỏng Các mẫu hồ sơ hiến

mô được ghi chép theo quy định của Bộ Y tế được hội đồng đạo đức trong nghiên cứu sinh y của Viện Bỏng Lê Hữu Trác thông qua

2.1.2 Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu

- DMEM và DMEM-F12 do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Huyết thanh bào thai bê (FBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Collagenase do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Epilife do hãng Gico/Life tech cung cấp

- EDGS do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Antibiotic/Antimycotic do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Trypsin/EDTA do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Phosphate bufferd saline (PBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp

2.1.3 Trang thiết bị và vật tư

- Máy ly tâm, bể ổn nhiệt

20

- Tủ ấm CO2 (Incubator) hoạt động ở 370C, CO2 5%

- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu

- Kính hiển vi đảo ngược

- Thiết bị để thanh trùng khô, thiết bị thanh trùng ướt (nồi hấp áp lực)

- Ống ly tâm falcol thể tích 15ml, 50ml, falcol do hãng Corning cung cấp

- Đĩa petri đường kính 60mm, 100mm do hãng Corning cung cấp

- Pipet aid, đầu pipet loại 5ml, 10ml, 25ml

- Găng tay vô trùng

- Các dụng cụ khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Thu mô mỡ và phân lập tế bào

Mô mỡ dưới da được lấy vô trùng từ phòng mổ và bảo quản ngay trong tube môi trường, giữ ở 40C và vận chuyển về labo Môi trường bảo quản mô mỡ bao gồm DMEM có 500U/ml penicillin, 500microgam/ml streptomycin và amphotericin B

Xử lý mô mỡ và phân lập tế bào gốc tại labo nuôi cấy tế bào:

- Rửa mô mỡ 3 lần bằng PBS để loại bỏ các cấu trúc thuộc mạch máu, da

- Mô mỡ được phân tách bằng Collagenase, nồng độ collagenase trong tube

- Cấy vào đĩa petri sao cho đạt 20.000 TB/cm2 bề mặt nuôi cấy

- Mỗi đĩa d=100mm sau đó được bổ sung ít nhất đủ 8ml môi trường DMEM/1% kháng sinh/10% FBS

- Đặt đĩa vào incubator ẩm, nhiệt độ 370C và CO2 5%

- Quan sát tế bào và tiến hành thu tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin khi mật độ tế bào đạt 80 diện tích che phủ

21

- Các tế bào thu được sau đó được đếm xác định số lượng Sau đó, bảo quản lạnh sâu hoặc cấy trở lại đĩa nuôi với mật độ 5000 TB/cm2

cho tới thế hệ thứ 5 để cung cấp cho nghiên cứu tiếp theo

2.2.2 Nhân rộng tế bào

- Kiểm tra tình trạng tế bào, đánh giá mức độ che phủ của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy (độ che phủ đạt khoảng 70 có thể cấy chuyển làm thí nghiệm)

- Hút bỏ dịch nổi trong đĩa nuôi cấy rồi đem rửa bằng dung dịch đệm PBS

- Thêm dung dịch Trypsin/EDTA 1X với thể tích 0,1ml/cm2, đặt đĩa nuôi cấy vào tủ ấm với tiêu chuẩn nhiệt độ 370

C, CO2 5% trong 5 phút Sau khi lấy ra ngừng quy trình trypsin bằng 0,1 ml/cm2

môi trường nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm, đếm số lượng tế bào

- Ly tâm ở tốc độ 1600 vòng/phút trong 5 phút Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm

và bổ sung môi trường nuôi cấy

- Khối tế bào thu được cấy chuyển sang đĩa khác để gia tăng số lượng tế bào hoặc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.3 Xác định số lượng tế bào:

Phương pháp này sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer

Sau khi tiến hành quy trình trypsin, lấy 1ml hỗn dịch tế bào đã trypsin pha

tỷ lệ 1:1 với chất nhuộm màu Trypan-blue Hút hỗn dịch tế bào và chất nhuộm màu bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm Đếm số lượng tế bào dưới kính hiển vi

Để xác định tính gốc của tế bào thông qua khả năng tự đổi mới của chúng, hỗn dịch các tế bào đơn lẻ được chuẩn bị và cấy trong đĩa nuôi cấy nhựa có

22 đường kính 60mm ở mật độ là 50 TB/cm2 Đĩa nuôi cấy sau đó được duy trì trong 2-3 tuần để theo dõi sự phát triển của các colony Đĩa tế bào nuôi cấy sau

đó được cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa, một nhóm tế bào được xác định là đơn vị colony khi có ít nhất là 50 tế bào Khả năng tạo dòng được tính toán theo tỷ lệ số colony đạt được so với số tế bào được cấy Cụ thể các bước tiến hành như sau:

Bước 1 Cấy tế bào cần làm thí nghiệm trong đĩa có đường kính 60mm với mật độ tế bào 50TB/cm2

, mỗi đĩa cho 4mm môi trường nuôi cấy, thay môi trường sau mỗi 3 ngày

Bước 2 Theo dõi tạo colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về:

- Hình thành colony chưa?

- Mỗi colony có khoảng bao nhiêu tế bào?

- Hình thái tế bào?

Bước 3 Nhuộm giemsa sau 3 tuần

Bước 4 Tính tỷ lệ số colony/số tế bào được cấy, mỗi colony khi đó được

xác định là có từ 50 tế bào trở lên

2.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào

da nuôi cấy

Để xác định hiệu quả của các yếu tố hòa tan bởi ADSCs lên sự tăng sinh và

di cư của hai loại tế bào, nguyên bào sợi da và tế bào sừng được đồng nuôi cấy với tế bào gốc mô mỡ trong 2 khoang đĩa để tránh sự tiếp xúc trực tiếp giữa các loại tế bào nhưng lại cho phép sự trao đổi các yếu tố có khả năng khuếch tán

23

Hình 2 Mô phỏng thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ

bằng phương pháp đồng nuôi cấy

Tế bào gốc mô mỡ được cấy trên insert chứa màng polycarbonate của đĩa transwell, màng polycarbonate có kích thước lỗ là 0,45micromet và được tráng collagen, nguyên bào sợi và tế bào sừng được cấy ở khoang phía dưới Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mỡ đến hai loại tế bào da nuôi cấy này được đánh giá qua sự tăng sinh tế bào da và khả năng di cư của chúng theo cách thức mô tả dưới đây

2.2.5.1 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tăng sinh nguyên bào sợi

Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×104

TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung

mô bao gồm DMEM/1 FBS/1 AB

Nguyên bào sợi được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh

Tế bào MSC được cấy trên insert với mật độ 5000 TB/cm2

và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 11 ngày trước khi đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi, khi đó MSC đạt 70-80 độ che phủ và vẫn ở tình trạng chưa biệt hóa

Tấm tế bào gốc trung mô chứa cả insert sau đó được đặt vào các giếng nguyên bào sợi và bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy MSC mới

24 Thí nghiệm đối chứng gồm:

1 Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào

2 Insert có tế bào là nguyên bào sợi da cấy ở mật độ 5x103TB/insert và duy trì trong môi trường tăng sinh MSC trong 6 ngày trước khi đồng nuôi cấy Tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, các giếng nguyên bào sợi được trypsin và đếm số lượng tế bào cũng như xác định tỷ lệ sống/chết của tế bào thu được

2.2.5.2 Đánh giá ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mô mỡ lên khả năng di cư của nguyên bào sợi

Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×104

TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung

mô bao gồm Dulbecco's Modified Eagle‘s Medium (DMEM) được bổ sung 2mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml amphotericin B (Invitrogen/GIBCO), 10% FBS (PAA)

Nguyên bào sợi được cấy trong 6 ngày (đạt 90 độ che phủ) trước khi đồng nuôi cấy để phân tích di cư làm liền vết cạo

Mô hình thí nghiệm đồng nuôi cấy

Đồng nuôi cấy, nguyên bào sợi/tế bào sừng và

tấm MSC

- Tạo vết cạo nguyên bào sợi

- Phân tích thời gian liền vết cạo

- Đếm số lượng tế bào Nguyên bào sợi/ tế

bào sừng nuôi cấy

trong giếng trong 6

ngày, mật độ cấy

50.000TB/giếng

MSC nuôi cấy trong insert trong 11 ngày, mật độ cấy 50TB/cm2

Môi trường nuôi cấy MSC

DMEM/10%FBS/1%AB Thay môi trường sau mỗi

2 ngày

D2 Cấy nguyên bào sợi vào

khoang dưới giếng

DMEM/1%FBS/1%AB

Cấy nguyên bào sợi vào khoang dưới giếng transwel với số lượng 50.000TB/giếng trong

Đồng nuôi cấy, đặt insert

có nguyên bào sợi vào giếng

Đồng nuôi cấy, đặt insert không có tế bào vào giếng

D7 - Trypsin nguyên bào

sợi ở khoang dưới và

- Chụp ảnh trước khi trypsin

- Trypsin nguyên bào sợi ở khoang dưới và đếm số lượng

- Chụp ảnh trước khi trypsin

2.2.5.3 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tăng sinh tế bào sừng

Với tất cả các thí nghiệm, tế bào sừng được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 3×104 TB/giếng trong môi trường Epilife được bổ sung EDGS trong 24 giờ để tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy Sau đó tế bào sừng chỉ được nuôi cấy trong môi trường Epilife mà không có EDGS Tế bào sừng được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh

26

Tế bào gốc mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm2

và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80 -90 độ che phủ

Tấm tế bào gốc mỡ cả insert sau đó được đặt vào các giếng tế bào sừng và bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ là DMEM chỉ có 2 FBS Thí nghiệm đối chứng gồm:

1 Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào

2 Insert có tế bào là nguyên bào sợi da cấy ở mật độ 5x103 TB/insert và duy trì trong môi trường tăng sinh MSC trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy

Tại các thời điểm 24, 48 giờ và 72 giờ, các giếng tế bào sừng được trypsin

và đếm số lượng tế bào cũng như xác định tỷ lệ sống/chết của tế bào thu được

2.2.5.4 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến sự di cư tế bào sừng

Tế bào sừng được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích di

cư Với tất cả các thí nghiệm, tế bào sừng được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 3x104 TB/giếng và duy trì trong môi trường Epilife được bổ sung EDGS Môi trường nuôi cấy được thay thế sau mỗi 2 ngày và theo dõi cho đến khi tế bào sừng đạt 100 độ che phủ (3 ngày) thì dùng đầu pipet cạo bề mặt tế bào để tạo các khoảng trống tương tự nhau, rửa tế bào bằng PBS Sau đó, tế bào sừng chỉ được nuôi cấy trong môi trường Epilife mà không có EDGS

Tế bào gốc mô mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm2

và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80 -90 độ che phủ và vẫn ở tình trạng chưa biệt hóa

Tấm tế bào gốc mô mỡ cả insert sau đó được đặt vào các giếng tế bào sừng Khoang trên là tấm tế bào gốc mô mỡ được bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ là DMEM với 2 FBS Khoang dưới là tế bào sừng với vết cạo đồng kích thước được duy trì trong môi trường Epilife đơn thuần

27 Thí nghiệm đối chứng gồm 1/ nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào, 2/ insert có tế bào là nguyên bào sợi da và duy trì trong môi trường tương tự với tế bào gốc mô mỡ là DMEM với 2 FBS

Cứ sau mỗi 24 giờ, các vết cạo ở khoang tế bào sừng được chụp ảnh và phân tích khoảng cách thu hẹp do tế bào sừng di cư

Hình 3 Tạo vết thương in vitro Nguyên bào sợi được nuôi cho đến khi

đạt 100% độ che phủ (A), tạo vết cạo với kích thước đồng nhất 2mm bằng dụng

cụ nhựa (B) Tế bào sừng được nuôi cho đến khi đạt 100% độ che phủ (C) Tạo vết cạo với kích thước đồng nhất 2mm bằng dụng cụ nhựa (D).(50X)

Từ các thí nghiệm phân tích chúng tôi xây dựng được quy trình các bước thí nghiệm đánh giá tác động của tấm tế bào gốc đến tế bào sừng như sau:

DMEM/10%FBS/1%AB Thay môi trường sau mỗi

2 ngày

D2 Cấy tế bào sừng vào

khoang dưới giếng

Cấy tế bào sừng vào khoang dưới giếng transwell với số lượng 30.000TB/giếng trong môi trường Epilife D5 Đồng nuôi cấy, đặt insert

có TB gốc mỡ vào giếng

Đồng nuôi cấy, đặt insert

có nguyên bào sợi vào giếng

Đồng nuôi cấy, đặt insert không có tế bào vào giếng

- Chụp ảnh trước khi trypsin

- Trypsin tế bào sừng ở khoang dưới và đếm số lượng

- Chụp ảnh trước khi trypsin

2.2.6 Phương pháp chế tạo tấm tế bào gốc mỡ cho thí nghiệm đồng nuôi cấy

Tế bào gốc được cấy trên các giá đỡ là các tấm vật liệu nuôi cấy hoặc che phủ vết thương Khi tế bào bám dính và đạt mật độ yêu cầu, tấm vật liệu được sử dụng trong phân tích và đánh giá tác dụng Các bước cụ thể như sau:

- ADSCs được tinh lọc và nhân rộng nhờ các lần cấy chuyển đến P5 thì sử dụng để chế tạo tấm tế bào gốc

- Tế bào được cấy trên màng polycarbonat có kích thước lỗ 3µm và được tráng collagen typ I Mật độ tế bào cấy ban đầu là 50TB/cm2

29

- Duy trì tế bào trong môi trường nuôi cấy ADSCs như đã mô tả bao gồm: DMEM có 10 FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml amphotericin B

- Các đĩa nuôi cấy được đặt trong tủ ấm ẩm ở 370C có 5% khí CO2

- Môi trường nuôi cấy được thay sau mỗi 3 ngày và theo dõi sự phát triển của tế bào qua kính hiển vi đảo ngược

- Khi tế bào đạt 90 độ che phủ thì coi như tấm tế bào đã được chế tạo và bắt đầu cho các thử nghiệm tiếp theo

30

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đặc điểm phân lập và hình thái tế bào

Xử lý mô mỡ để phân lập tế bào gốc trung mô

Hình 4 Tách mô mỡ bằng enzym collagenase (A) Thu mô mỡ (B) Rửa sạch

mô mỡ theo quy trình (C) Cắt lọc mô mỡ (D) Mô mỡ sau khi tách bằng enzym collagenase phân thành 3 lớp đặc trưng sau khi ly tâm: (1) lớp mỡ, (2) dịch nổi, (3) sinh khối tế bào.

1

2

3