Cảm biến sinh học ứng dụng trong chẩn đoán sớm bệnh alzheimer

Cảm biến sinh học ứng dụng trong chẩn đoán sớm bệnh alzheimer Cảm biến sinh học ứng dụng trong chẩn đoán sớm bệnh alzheimer Cảm biến sinh học ứng dụng trong chẩn đoán sớm bệnh alzheimer luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN KIẾN THẠCH CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN SỚM BỆNH ALZHEIMER LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành : Vật lý kỹ thuật NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS TRƯƠNG THỊ NGỌC LIÊN Hà Nội – Năm 2013 Lời cảm ơn Lời luận văn xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Trương Thị Ngọc Liên, người thầy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cơng việc sống giúp tơi hồn thành tốt luận văn Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy cô, anh chị Phịng thí nghiệm Vật liệu điện tử, Phịng Vật lý đo lường - Viện vật lý kỹ thuật, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiện vật tư, trang thiết bị tận tình giúp đỡ công tác nghiên cứu, học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Công Hảo anh chị Phòng Khoa học Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện thời gian công sức giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô anh chị thuộc Viện Vật Lý Kỹ Thuật, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người tận tình dạy dỗ có góp ý q báu giúp tơi hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thành viên nhóm Biosensors Viện Vật lý kỹ thuật, Đại học Bách Khoa Hà Nội có chia sẻ giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn tới gia đình bạn bè tôi, người đồng hành suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình Tác giả Nguyễn Kiến Thạch Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHĨA 2011B DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Bệnh nhân Auguste D 12 Hình 1.2 Ảnh mơ não người a) Não bình thường b) Não người bị bệnh Alzheimer [9] 15 Hình 1.3 Ảnh mơ tế bào nơ-ron thần kinh a) Nơ-ron người bình thường; b) Nơ-ron người bị bệnh Alzheimer với mảng lão hóa Amyloid đám rối sợi thần kinh [9] 16 Hình 1.4 Chuỗi peptite Aβ vị trí APP [21] 23 Hình 1.5 Mô hai chế phân giải APP a) Phân giải gen amyloid (Non Amyloidogenic); b) Phân giải gen amyloid (Amyloidogenic)[21] 24 Hình 2.1 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo chung hệ cảm biến sinh học 27 Hình 2.2 Mơ hình cấu trúc liên kết kháng thể - kháng nguyên 29 Hình 2.3 Cơ chế hoạt động enzyme đóng vai trò chất xúc tác sinh học 30 Hình 2.4 Mơ hình cấu trúc DNA RNA 31 Hình 2.5 Các phương pháp cố định đầu thu lên bề mặt cảm biến Hấp thụ vật lý, 2.Liên kết cộng hóa trị, Bẫy, 4.Liên kết chéo phân tử, Hóa rắn [16] 36 Hình 2.6 Sơ đồ nguyên lý cảm biến sinh học dòng: a) cảm biến sinh học dòng loại thứ nhất, b) cảm biến sinh học dòng loại thứ hai.[25] 40 Hình 2.7 Mơ hình cảm biến điện hóa sử dụng ISE a) ISE thông thường với lớp chuyển tiếp thể lỏng b) ISEs với lớp tiếp giáp rắn [25] 42 Hình 2.8 Các dạng điện cực in lưới: (a) hệ điện cực; (b) hệ điện cực 44 Hình 2.9: Cấu trúc mảng in lưới điện cực phân bố điện cực làm việc 45 Hình 2.10: Vi ảnh cảm biến vi mảng Các chấm sáng điện cực platin 46 Hình 3.1 Biểu diễn vector Fresnel mặt phẳng phức 50 Hình 3.2 Tập hợp điểm M mặt phẳng Nyquist tạo nên đường phổ tổng trở đặc trưng cho hệ khảo sát 51 Hình 3.3 Mạch tương đương Randles cảm biến điện hóa thơng thường 52 Hình 3.4 a Ngun lý trao đổi điện tích cảm biến sinh học điện hóa xác định kháng thể; b phổ tổng trở tương ứng với mạch tương đương Randles 53 Hình 3.5 Điện cực điện hóa cacbon (DEP chip) 56 Hình 3.6 Hệ AutoLab PGSTAT 12 56 Hình 3.7 Quy trình cơng nghệ chế tạo cảm biến Mab Amyloid β/ pyrenyl/ DEP chip 57 Hình 3.8 Quy trình cơng nghệ chế tạo cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip 59 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHĨA 2011B Hình 3.9 Ảnh SEM điện cực in cacbon biến tính hạt vàng có kích thước nano sử dụng phương pháp quét vòng CV (từ -0,6 đến +0,5V với điện cực chuẩn Ag/AgCl) với số vòng khác a) 10 vòng; b) 15 vòng; c) 20 vịng 60 Hình 3.10 Đặc trưng dòng - phương pháp CV với 10 vòng quét, tốc độ quét 50mV/s, dải quét từ -0,6 V ÷0,5 V 60 Hình 3.11 Sơ đồ cấu trúc phân tử axit 16-mercaptohexadecanoic (MHDA) 61 Hình 3.12 Sơ đồ mơ tả q trình xử lý NHS-EDC cố định kháng thể lên hạt nano vàng 62 Hình 3.13 Quy trình cơng nghệ chế tạo cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip 63 Hình 4.1 Phổ tổng trở ứng với nồng độ kháng nguyên Amyloid β(1-40) khác cảm biến Mab Amyloid β/ pyrenyl/ DEP chip 65 Hình 4.2 Đường đặc trưng chuẩn cảm biến Mab Amyloid β/ pyrenyl/ DEP chip với RCT hàm nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) 67 Hình 4.3 Phổ trở kháng phức ứng với số vòng quét khác cảm biến chế tạo theo quy trình chế tạo cảm biến B 69 Hình 4.4 Phổ trở kháng phức ứng với nồng độ kháng nguyên Amyloid β(1-40) khác cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip 70 Hình 4.5 Đường đặc trưng chuẩn cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip với RCT hàm nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) 72 Hình 4.6 Phổ trở kháng phức ứng với nồng độ kháng nguyên Aβ1-42 khác cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip 73 Hình 4.7 Đường đặc trưng chuẩn cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip với RCT hàm nồng độ kháng nguyên Aβ(1-42) 75 Hình 4.8 Đường đặc trưng chuẩn Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip với RCT hàm nồng độ BSA 76 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 55 Bảng 4.1 Giá trị thành phần mạch tương đương Randles cảm biến Mab Amyloid β/ pyrenyl/ DEP chip 67 Bảng 4.2 Giá trị thành phần mạch tương đương Randles cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip 71 Bảng 4.3 Giá trị thành phần mạch tương đương Randles cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip 74 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APH: anterior pharynx-defective APOE: apolipoprotein E APP: Amyloid precursor protein BACE: β-site APP cleaving enzyme BSA: Bovine serum albumin CT: Medical imaging with computed tomography DEP chip: Disposable Electrochemical Printed DMSO: Dimethyl Sulfoxide DNA: DeoxyriboNucleic Acid EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide EIS : Electrochemical Impedance Spectroscopy FDA: Food and Drug Administration IUPAC: Internatonal Union of Pure and Applied Chemistry LOD: Limit of detection Mab : Mono Antibody MHDA: 16-Mercaptohexadecanoic acid MRI: Magnetic resonance imaging NHS: N-hydroxysulfosuccinimide PBS: Phosphate Buffered Saline PET: positron emission tomography PiB: the Pittsburgh Compound B QCM : Quartz crystal microbalance RNA: RiboNucleic Acid SAM: Self-Assembled monolayer SEM: Scanning Electron Microscop SPCEs : Screen-printed carbon electrodes SPECT: single photon emission computed tomography WHO: World Health Organization Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B MỤC LỤC Lời cảm ơn DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 10 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ BỆNH ALZHEIMER VÀ AMYLOID BETA 12 Tổng quan bệnh Alzheimer 12 1.1 Các giai đoạn phát triển bệnh 13 1.2 Nguyên nhân 15 1.3 Phòng chống chăm sóc 18 Các phương pháp chẩn đoán điều trị bệnh Alzheimer 20 2.1 Các phương pháp chẩn đoán 20 2.2 Các phương pháp điều trị 21 Protein Amyloid Beta 23 CHƯƠNG II CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA 26 Cảm biến sinh học 26 1.1 Tác nhân phát 27 1.2 Đầu thu sinh học 28 a Kháng thể/kháng nguyên 28 b Enzyme 29 c Axit Nucleic/DNA, RNA 30 d Tế bào mô tế bào 32 e Chất mô sinh học 32 1.3 Bộ chuyển đổi 33 a Chuyển đổi điện hóa 33 b Chuyển đổi quang 33 c Chuyển đổi áp điện 34 d Chuyển đổi nhiệt 35 e Chuyển đổi vi 35 1.4 Các phương pháp cố định thành phần sinh học lên vật liệu rắn 36 a Hấp thụ vật lý 36 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHĨA 2011B b Liên kết cộng hóa trị 37 c Bẫy 38 d Liên kết chéo phân tử 38 e Hóa rắn 38 Cảm biến điện hóa 39 2.1 Cảm biến sinh học đo dòng 39 2.2 Cảm biến sinh học đo 40 2.3 Cảm biến sinh học đo độ dẫn 42 Công nghệ điện cực in cacbon 43 Ứng dụng cảm biến sinh học 46 4.1 Chẩn đốn bệnh y tế chăm sóc sức khỏe 47 4.2 Quản lý chất lượng thực phẩm 47 4.3 Quản lý môi trường 48 CHƯƠNG III CHẾ TẠO CẢM BIẾN CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA PHỔ TỔNG TRỞ PHÁT HIỆN AMYLOID β(1-40) VÀ AMYLOID β(1-42) 49 Nguyên lý hoạt động cảm biến điện hóa phổ tổng trở 49 1.1 Phổ trở tổng trở (EIS – Electrochemical Impedance Spectroscopy) 49 1.2 Cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở 51 Công nghệ chế tạo 55 2.1 Hóa chất thiết bị 55 a Hóa chất 55 b Thiết bị 56 2.2 Công nghệ chế tạo 57 a Cảm biến Mab Amyloid β/ pyrenyl/ DEP chip 57 b Cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip 58 c Cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip 63 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 Đặc trưng phổ tổng trở EIS 64 Hoạt động cảm biến Mab Amyloid β/ pyrenyl/ DEP chip 65 Cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip 68 a Ảnh hưởng mật độ AuNPs tới hiệu suất cố định kháng thể 68 b.Hoạt động cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip 70 Cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip 73 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B Ảnh hưởng nồng độ BSA đến kết đo phổ tổng trở 76 KẾT LUẬN 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B Từ đường chuẩn nhận thấy giá trị RCT thay đổi không đáng kể nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) thấp (từ nM đến µM) tăng tuyến tính nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) cao (t àM ữ 200 àM) iu ny cho thấy cảm biến sử dụng để xác định nồng độ Aβ dải nồng độ cao Tiến hành fit đường chuẩn phần tuyến tính sử dụng cơng thức tính giới hạn phát (LOD): LOD = 3STDEV/ blank Slope Trong đó: STDEV/blank sai số bình phương trung bình RCT mẫu blank Slope độ dốc đường tuyến tính Chúng xác định giới hạn phát (LOD) cảm biến 2,04µM Từ kết thấy có hiệu suất cố định kháng thể lên bề mặt điện cực cảm biến khơng cao giới hạn phát cảm biến lớn Cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip a Ảnh hưởng mật độ AuNPs tới hiệu suất cố định kháng thể Sau tạo AuNPs lên bề mặt điện cực cảm biến theo phương pháp điện hóa qt vịng CV với số vịng qt khác nhau, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng mật độ AuNPs tới hiệu suất cố định kháng thể cảm biến Chúng ghi nhận phổ EIS cảm biến có mặt AuNPs cố định kháng thể từ đánh giá hiệu suất cố định kháng thể Aβ thông qua biến đổi tương đối RCT theo biểu thức: % RCT = RCT ( Mab Aβ ) − RCT ( AuNPs ) RCT ( Mab Aβ ) Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 68 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHĨA 2011B Hình 4.3 Phổ trở kháng phức ứng với số vòng quét khác cảm biến chế tạo theo quy trình chế tạo cảm biến B Từ kết thu %RCT hình 4.3, chúng tơi thấy số vịng quét tăng lên %RCT tăng tăng cao số vòng quét 20CV Điều phù hợp với kết khảo sát sơ mật độ AuNPs Khi số vịng qt tăng mật độ hạt nano vàng tăng màng SAM tạo thành bề mặt điện cực nhiều Điều dẫn đến làm tăng hiệu suất cố định kháng thể bề mặt điện cực làm tăng biến đổi tương đối điện trở RCT tăng số vòng quét chế tạo hạt nano vàng Chính lý trên, chúng tơi chọn phương pháp chế tạo AuNPs với số vòng quét 20 CV để chế tạo cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip phục vụ cho nghiên cứu xác kháng nguyên Aβ Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 69 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B b.Hoạt động cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip Chúng tiến hành khảo sát hoạt động cảm biếm với dải nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) từ nM ÷ 200 µM thu phổ EIS hình 4.4 Hình 4.4 Phổ trở kháng phức ứng với nồng độ kháng nguyên Amyloid β(1-40) khác cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip Chúng nhận thấy kết phổ EIS tương tự cảm biến sử dụng gốc pyrenyl, đường kính bán cung tăng lên tăng nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) Tuy nhiên, khác với cảm biến sử dụng gốc pyrenyl, cảm biến sử dụng màng SAM đường kính bán cung phổ EIS tăng đáng kể so với mẫu blank nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) thp (t 1nM ữ àM) v tng nhanh nng khỏng nguyờn A(1-40) cao (10àM ữ 200àM) Giỏ trị thành phần mạch tương đương Randles trình bày bảng 4.2 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 70 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B Bảng 4.2 Giá trị thành phần mạch tương đương Randles cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip Amyloid β 1-40 Các đại lượng mạch tương đương Randles (µM) RCT (kΩ) Cdl (µF) RS (kΩ) Blank 0.92 ± 0.04 14.47 ± 2.31 3.01 ± 0.02 0.001 1.03 ± 0.06 11.44 ± 1.97 3.17 ± 0.23 10% 0.01 1.10 ± 0.05 3.83 ± 0.41 2.79 ± 0.30 16% 0.1 1.33 ± 0.06 3.47 ± 0.10 2.90 ± 0.31 31% 1.62 ± 0.11 2.85 ± 0.39 2.86 ± 0.29 43% 10 1.77± 0.05 3.40 ± 0.20 2.63 ± 0.26 48% 100 2.72 ± 0.25 3.80 ± 0.08 3.13 ± 0.31 66% 200 3.16 ± 0.15 3.5 ± 0.05 3.08 ± 0.32 71% %RCT Kết cho thấy giá trị RCT ứng với mẫu blank cảm biến sử dụng màng SAM 0.92 kΩ nhỏ nhiều so với giá trị RCT cảm biến sử dụng gốc pyrenyl Điều cho thấy với có mặt AuNPs bề mặt điện cực làm tăng đáng kể độ dẫn điện cực cảm biến Đây điều cần thiết cảm biến điện hóa sử dụng phương pháp EIS %RCT thay đổi từ 10% đến 71% tương ứng vi nng khỏng nguyờn A(1-40) t 1nM ữ 200àM %RCT thay đổi đáng kể so với mẫu blank nồng độ kháng nguyên thấp So với cảm biến sử dụng gốc pyrenyl cảm biến sử dụng màng SAM có thay đổi %RCT lớn khảo sát nồng độ kháng nguyên Điều chứng tỏ lượng kháng thể Aβ cố định điện cực làm việc cảm biến sử dụng màng SAM nhiều dẫn tới thay đổi %RCT lớn Có thể giải thích tăng cuả %RCT bề mặt điện cực cảm biến sử dụng màng SAM có nhiều kháng thể Aβ cố định nên có khả bắt cặp với nhiều kháng nguyên Aβ(1-40) tạo nên lớp màng kháng thể - kháng nguyên bao phủ bề mặt điện cực làm việc với diện tích lớn cảm biến sử dụng gốc Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 71 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B pyrenyl Điều chứng tỏ việc sử dụng màng SAM làm tăng hiệu suất cố định kháng thể lên bề mặt điện cực làm việc cảm biến Từ bảng số liệu đưa đường đặc trưng chuẩn cảm biến hình 4.5 Hình 4.5 Đường đặc trưng chuẩn cảm biến Mab Amyloid β/ SAM/ DEP chip với RCT hàm nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) Từ đường đặc trưng chuẩn cảm biến chúng tơi thấy có hai vùng rõ rệt vùng nồng độ thấp (1 nM ÷ µM) vùng nồng độ cao (10 µM ÷ 200 µM) Trong hai vùng này, giá trị RCT biến đổi tuyến tính so với nồng độ kháng nguyên Do đó, cảm biến sử dụng màng SAM phát kháng nguyên Aβ(1-40) hai dải nồng độ thấp nồng độ cao Tiến hành fit đường đặc trưng chuẩn dải nồng độ từ nM ữ àM ca giỏ tr RCT chỳng tụi tính giới hạn phát (LOD) cảm biến B 2,65 nM Kết lần khẳng định việc sử dụng màng SAM chế tạo cảm biến làm tăng hiệu suất cố định kháng thể Aβ bề mặt điện cực cảm biến Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 72 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B Cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip Chúng khảo sát hoạt động cảm biến với dải nồng độ kháng nguyên Aβ(1-42) hai vùng nồng độ vùng nồng độ thấp từ 0,1 nM ÷ 0,1 µM vùng nồng độ cao 10 µM ÷ 200 µM Chúng tơi thu phổ EIS hình 4.6 Hình 4.6 Phổ trở kháng phức ứng với nồng độ kháng nguyên Aβ1-42 khác cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip Tương tự hai cảm biến trên, nhận thấy đường kính bán cung phổ EIS cảm biến tăng lên nồng độ kháng nguyên tăng tăng nhanh Sử dụng phần mềm Autolab data analysis để fit đường phổ EIS ta thu giá trị thành phần mạch tương đương Randles bảng 4.3 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 73 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B Bảng 4.3 Giá trị thành phần mạch tương đương Randles cảm biến Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip Amyloid β 1-42 Các đại lượng mạch tương đương Randles (µM) RCT (kΩ) Cdl (µF) RS (kΩ) Blank 1.96 ± 0.17 5.48 ± 1.17 2.31 ± 0.26 0.00001 2.26 ± 0.05 4.65 ± 0.16 3.28 ± 0.32 13% 0.001 2.53 ± 0.18 4.78± 0.39 2.91 ± 0.24 23% 0.01 2.64 ± 0.26 5.83 ± 0.47 2.57 ± 0.24 26% 0.1 2.71 ± 0.04 5.07 ± 0.47 2.65 ± 0.05 28% 10 3.6± 0.16 4.06 ± 1.06 2.61 ± 0.18 46% 100 4.65 ± 0.17 3.30 ± 0.87 2.43 ± 0.13 58% 200 5.71 ± 0.48 2.27 ± 0.48 2.15 ± 0.07 66% %RCT Từ bảng số liệu ta thấy %RCT cảm biến sử dụng kết hợp màng SAM với protein G thay đổi đáng kể so với mẫu trắng nồng độ kháng nguyên thấp (0,1nM ÷ 0,1µM) Ở dải nồng độ thấp, %RCT cảm biến thay đổi nhiều so với %RCT cảm biến sử dụng màng SAM nồng độ khảo sát Điều giải thích kháng thể cố định có tính định hướng tốt kháng nguyên tới bặt cặp với kháng thể dễ dàng với số lượng nhiều so với kháng thể có tính định hướng kém; lớp màng kháng thể-kháng nguyên bao phủ bề mặt với diện tích lớn hơn, dẫn tới cản trở trao đổi điện tích dung dịch chất điện ly với bề mặt điện cực Kết cho thấy việc cố định protein G trước cố định kháng thể Aβ làm tăng tính định hướng kháng thể Aβ cố định bề mặt cảm biến Tuy nhiờn, di nng cao (10àM ữ 200àM), %RCT cảm biến không khác nhiều so với cảm biến sử dụng màng SAM nồng độ khảo sát Điều giải thích với nồng độ kháng thể Aβ (200µg/mL) số lượng kháng thể cố định điện cực cảm biến B C gần tương đương nhau, cho nên, dải nồng độ kháng nguyên Aβ(1-42) cao kháng nguyên Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 74 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B đến bắt cặp với hầu hết kháng thể cố định bề mặt điện cực tạo nên trạng thái bão hịa Vì thế, thay đổi %RCT hai cảm biến Từ bảng số liệu trên, đưa đường chuẩn cảm biến C hình 4.7 Hình 4.7 Đường đặc trưng chuẩn cảm biến Mab Amyloid β/ protein G SAM/ DEP chip với RCT hàm nồng độ kháng nguyên Aβ(1-42) Đường đặc trưng chuẩn cảm biến gồm hai vùng tuyến tính đường chuẩn cảm biến sử dụng màng SAM Tiến hành fit đường chuẩn dải tuyến tính giá trị RCT dải nồng độ 0,1nM ữ 10 àM, chỳng tụi tớnh c gii hn phát (LOD) cảm biến C 0,57 nM Kết lần khẳng định việc cố định protein G trước cố định kháng thể làm tăng tính định hướng kháng thể cố định lên bề mặt điện cực làm việc cảm biến, làm tăng khả phát kháng nguyên Aβ(1-42) cảm biến Cảm biến sử dụng để khảo sát nồng độ Aβ(1-42) dải nồng độ thấp nồng độ cao Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 75 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B Ảnh hưởng nồng độ BSA đến kết đo phổ tổng trở BSA huyết bò sử dụng yếu tố môi trường phần tử sinh học enzyme, kháng thể, kháng nguyên Việc có mặt BSA q trình nghiên cứu gây ảnh hưởng tới kết đo phổ trở kháng phức giá trị RCT Trong nghiên cứu này, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BSA tới giá trị RCT cảm biến sử dụng kết hợp protein G với màng SAM xác định nồng độ Aβ(1-42) với nồng độ 100 µM pha dung dịch ammoniac nồng độ 0,02% có chứa BSA với nồng độ thay đổi từ ÷ 5mg/mL Kết thu đường đặc trưng chuẩn hình 4.8 Hình 4.8 Đường đặc trưng chuẩn Mab Amyloid β/ protein G - SAM/ DEP chip với RCT hàm nồng độ BSA Từ đường chuẩn ta thấy nồng độ BSA gần không ảnh hưởng tới kết đo RCT nồng độ BSA thay đổi từ ÷ 2,5 mg/mL đáng kể nồng độ 5mg/mL Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 76 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHĨA 2011B KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tơi chế tạo thành công ba cảm biến sinh học điện hóa theo ba phương pháp khác ứng dụng để xác định nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) Aβ(1-42), dấu sinh học phát sớm bệnh Alzheimer Các kết mà nghiên cứu đạt là: Đã đưa ba quy trình cơng nghệ chế tạo cảm biến sinh học điện hóa để xác định nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) Aβ(1-42) Đã chế tạo hạt vàng kích thước nano (AuNPs) bề mặt điện cực cacbon DEP chip phương pháp điện hóa qt vịng CV với kích thước hạt trung bình khoảng 40 ÷ 60 nm với độ đồng cao; đồng thời chọn quy trình tối ưu để chế tạo AuNPs điện cực cacbon DEP chip phương pháp điện hóa quét vòng với số vòng quét 20 CV, điện quét từ -0,6V ÷ +0,5V, tốc độ quét 50mV/s Đã chế tạo thành công màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) MHDA để nâng cao hiệu suất cố định kháng thể Aβ lên bề mặt điện cực làm việc cảm biến sinh học Đồng thời, việc cố định protein G lên màng SAM trước cố định kháng thể Aβ làm tăng tính định hướng kháng thể cố định điện cực cảm biến, nhờ làm tăng hiệu suất bắt cặp kháng nguyên với kháng thể Đã cố định kháng thể Aβ lên bề mặt điện cực làm việc cảm biến sinh học có so sánh ba phương pháp cố định để lựa chọn phương pháp chế tạo tối ưu cho dải nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) Aβ(1-42) Khảo sát hoạt động cảm biến để xác định kháng nguyên Aβ(140) Aβ(1-42) với nồng độ từ nM đến 200 µM phương pháp đo phổ EIS cảm biến Từ đó, chúng tơi xây dựng đường đặc trưng chuẩn tìm giới hạn phát 2,04 µM, 2,65 nM 0,57 nM Đã khảo sát ảnh hưởng nồng độ BSA đến kết đo RCT cảm biến Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 77 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B Từ kết thu được, thấy phương pháp chế tạo cảm biến kết hợp sử dụng màng SAM với protein G cho kết tốt việc nâng cao hiệu suất cố định kháng thể giới hạn xác định kháng nguyên Aβ(1-40) Aβ(1-42) Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 78 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Việc nghiên cứu, ứng dụng cảm biến sinh học chẩn đoán bệnh y học ngày phát triển mạnh mẽ mở rộng cho nhiều loại bệnh Nghiên cứu đưa số quy trình chế tạo cảm biến sử dụng không cho riêng cảm biến phát nồng độ kháng nguyên Aβ(1-40) Aβ(1-42) dấu sinh học giúp chẩn đốn sớm bệnh Alzheimer, mà cịn sử dụng để chế tạo cảm biến phát kháng nguyên bệnh khác Các nghiên cứu kết nghiên cứu đạt đề tài cung cấp hướng phát triển triển khai thực mẫu thực bệnh nhân nhằm đưa chẩn đoán sớm bệnh Alzheimer giúp bác sĩ, chuyên gia y tế có phác đồ điều trị hiệu bệnh Alzheimer Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 79 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B TÀI LIỆU THAM KHẢO Bezbaruah A.N., Kalita H , Sensors and biosensors for endocrine disrupting chemicals: State-of-the-art and future trends, Treatment of Micropollutants in Water and Wastewater, ISBN: 9781843393160, IWA Publishing, London, UK Byrne B., Stack E., Gilmartin N., O’Kennedy R (2009), Antibody-based sensors: Principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins, Sensors 9, pp 4407-4445; doi: 10.3390/s90604407 Chang E.S.-H., Liao T.-Y, Lim T.-S., Fann W., Chen R.P.-Y (2009), A new Amyloid-like β-Aggregate with Amyloid characteristics, except fibril morphology, J Mol Biol 385 , pp 1257 –1265 Chen J.-C., Chung H.-H., Hsu C.-T., Tsai D.-M., Kumar A.S., Zen J.-M (2005), A disposable single-use electrochemical sensor for the detection of uric acid in human whole blood, Sensors and Actuators B 110, pp 364–369 Chikae M., Fukuda T., Kerman K., Idegami K., Miura Y., Tamiya E (2008), Amyloid-β detection with saccharide immobilized gold nanoparticle on carbon electrode, Bioelectrochemistry 74, pp 118 - 123 Geng J., Yu H., Ren J., Qu X (2008), Rapid label-free detection of metalinduced Alzheimer’s amyloidb peptide aggregation by electrochemical method, Electrochemistry Communications 10, pp 1797 - 1800 http://vi.wikipedia.org/wiki/Alzheimer http://www.understanding-dementia.com/stages-of-alzheimers.html http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2012/dementia_20120411/en/ 10 Hyde D., Kleine R.D., MacLaurin S.A., Miller E., Brooks D.H., Krucker T., Ntziachristos V (2009), Hybrid FMT– CT imaging of amyloid-β plaques in a murine Alzheimer's disease model, NeuroImage 44, pp 1304 – 1311 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 80 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B 11 Keusgen M (2002), Biosensors: new approaches in drug discovery, Naturwissenschaften 89, pp 433–444; doi: 10.1007/s00114-002-0358-3 12 Koyun A., Ahlatcıoğlu E., Ipek Y.K (2012), Biosensors and Their Principles, A Roadmap of Biomedical Engineers and Milestones, ISBN: 978-953-51-0609-8, InTech, 2012 13 Lien T.T.N., Chikae M., Ukita Y., Takamura Y (2011), Labelless impedance immunosensor based on polypyrrole-pyrole carborxylic acid copolymer for hCG detection, Talanta 85(5), pp 2576 – 2580 14 Lien T.T.N., Viet N.X., , Chikae M., Ukita Y., Takamura Y (2011), Development of Label-Free Impedimetric Hcg-Immunosensor Using ScreenPrinted Electrode, J Biosens Bioelectron 2, pp 107 doi: 10.4172/2155- 6210.1000107 15 Link C.D., Fonte V., Roberts C.M., Hiester B., Silverman M.A., Stein G.H (2008), The β amyloid peptide can act as a modular aggregation domain, Neurobiology of Disease 32, pp 420–425 16 Monošík R., Streďanský M., Šturdík E (2012), Biosensors - classification, characterization and new trends, Acta Chimica Slovaca, Vol 5, No 1, 2012, pp 109 - 120, DOI: 10.2478/v10188-012-0017-z 17 Simon D (2011), Physico-chemical characterization of beta-amyloid oligomers and study of their function in biological processes at molecular level, Ph.D thesis, the University of Szeged, Litvia 18 Song S., Wang L., Li J, Zhao J, Fan C (2008), Aptamer-based biosensors, Trends in Analytical Chemistry, Vol 27, No 19 Tuan V.D., Cullum B (2000), Biosensors and biochips: advances in biological and medical diagnostics, Fresenius J Anal Chem 366, pp 540–551 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 81 LUẬN VĂN CAO HỌC VẬT LÝ KỸ THUẬT- KHÓA 2011B 20 Vandersteen A (2012), Aggregation and toxicity of Amyloid-beta peptide in relation to peptide sequence variation, Ph.D thesis, the University of Twente, Belgium 21 Verdile G., Fuller S., Atwood C.S., Laws S.M., Gandy S.E., Martins R.N (2004), The role of beta amyloid in Alzheimer’s disease: still a cause of everything or the only one who got caught?, Pharmacological Research 50, 397–409 22 Wang J (2000), From DNA biosensors to gene chips, Nucleic acids research, vol.28, No.16, pp 3011-3016 23 Wang J (2002), Electrochemical nucleic acid biosensors, Analytica Chimica Acta 469, pp 63–71 24 Wang J (2008), Electrochemical Glucose Biosensors, Chem Rev 108, pp 814 −825 25 Hart J.P., Crew A., Crouch E., Honeychurch K.C., Pemberton R M., “Analytical Letters” 2004, 37, pp 789-830 26 Collier W A., Janssen D., Hart A.L., “Biosensors & Bioelectronics” 1996, 11, pp 1041-1049 27 Galan-Vidal C.A., Munoz J., Dominguez C., Alegret S., “Sens Actuator BChem” 1997, 45, pp 55-62 Học viên: Nguyễn Kiến Thạch 82 ... b) cảm biến sinh học dòng loại thứ hai.[25] Cảm biến sinh học dịng điển hình cảm biến đo nồng độ glucose máu ứng dụng rộng rãi y tế bệnh nhân tiểu đường Ngồi cịn có cảm biến sinh học cảm biến sinh. .. Tùy thuộc vào tín hiệu đầu chuyển đổi mà cảm biến sinh học phân loại thành cảm biến sinh học dòng, cảm biến sinh học cảm biến sinh học độ dẫn Các loại cảm biến đề cập chi tiết phần chương b Chuyển... [25] Các cảm biến sinh học sinh học thường cảm biến sinh học đánh dấu, chế tạo phức tạp tốn nhiều hóa chất để chế tạo dung dịch phân tích 2.3 Cảm biến sinh học đo độ dẫn Cảm biến sinh học độ dẫn