Nhằm góp phần tỉm kiểm các loại dược liệu cho tác dụng trị đái tháo đường, đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định câc loài thuộc họ Moraceae cho câc cao phân đoạn có tốc dụng [r]
(1)KẾT LUẬN
1 CTP CP chiết xuất từ dứa dại với iiều íương đương 7,2 g dược liệu/kg 14,4g dược liệu/kg "có tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây tổn thương
gan cấp bang PAR tren chuột nhắt trắng.
2 C T P C P chiết xuẩt từ dứa dại với liều tương đương 7,2 g dược !iệu/kg có tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan mo hình gây ton thương gan PAR chuột nhắt trắng.
TÀI LIỆU THAM KHẦO _
1 Phạm Hoàng Phiệt (2001), Tồng quan tình hình
viêm gan siêu vi B việt N am ' Hội thảo khoa học
điều trị viêm gan B ngày nay: Triển vọng cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính, Hồ Chí Minh tháng 12/2001
2 Ngơ Hữu Hà (2004), Nghiên cứu tình hình ngộ
độc cấp thuốc thường gặp trung tâm chống độc
Bệnh viện Bạch M năm 2002 -2003, Luận văn tốt nghiệp Bác s ĩ chuyên khoa cấp II, Trường đại học Y Hà Nội, tr4
3 Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Ky thuật, Hà Nội, tr 792 - 794.
4 Kathleen A.D (1998), Hepatic principles Tocxicoíogic emergencies, Jeanman M.Roche, pp
213-225.
5 Dhawan B.N (1997), Hepatoprotective activity o f
natural products experimental evaluation. International workshop on medicinal plants their bioactivity, screening and evaluation Lucknow, L15
6 Hewawasam R.P., Jayatilaka K.A., Pathirana c., Mudduwa L.K (2003), Protective effects o f
Asteracantha longifolia extract in mouse liver injury induced by cacbon tetrachloride and paracetamol
Pharm pharmacol 55(10), pp 14 13 -1
7 Lin S c , Chung T.C., Un c c (2000),
Hepatoprotective effects o f Artium lappa on carbon tetrachlorid and acetaminophen- induced live damage
Am J Chin Med 28 (2), pp 163-173.
8 Stephan u., Ruepp, Robert p Tonge and al (2002), Genomics and proteomics analysis of
acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicological science? vol 65, pp 135-150.
9 Đào Văn Phan (2004), Các thuốc giảm đau chống viêm. Nhà xuất Y học tr 61 - 65
10 Londonkar R and Kamble A (2009), Evaluation of free radical scavenging activity of Pandanus odoratissimus International journal of pharmacology 5(6), pp 377-380
SÀNG LỌC I N V I T R O TÁC DỤNG ứ c CHÉ a - GLUCOSIDASE
CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC HỌ DÂU TẰWI (MORACEAE)
CN Trịnh Túy An (Nghiên cứu viên, TT ĐT&NCPT Thuốc Có Nguồn Gốc Tự Nhiên, Đ H Y D ợ c TP HCM) DS Nguyễn Linh Nhâm (Học viên cao học, Đ ạÍH ọc Y Dược TP Hồ Chí Minh) Hướng dẫn: PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy (Bộ Môn Dược Liệu, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh) TĨM TẮT
Nhằm góp phần tỉm kiểm loại dược liệu cho tác dụng trị đái tháo đường, đề tài thực với mục tiêu xác định câc loài thuộc họ Moraceae cho câc cao phân đoạn có tốc dụng ức chế enzym a-glucosidase Để iài được tiến hành 21 mẫu thực vật thuộc chi Artòcarpus, Ficus Moms, thu hài từ thàng - 1 năm 2014 Khảo sát điều kiện tiến hành thử nghiệm, sàng lọc mẫu cao chiết cho tẩc dụng ức chế mạnh nhẩt, đảnh giá kết phần mềm Sigma Plot 10.0, phân lập vẩ tinh chế chất tinh khiết Từ 60 phận dùng 21 dược liệu, thu 180 cao chiết dạng cắn khơ Sàng lọc 180 mẫu cao tồn phần, nồng độ 0,01 mg/ml, mẫu cao cồn thân vầ (Ficus aurìculata) thu hâi Bình Dương cho tác dụng ức chế mạnh nhẫỉ (91,95% ± 0,012) Phàn tốch và-xốc định ICõo cao phân đoạn từ mẫu cao toàn phần trên, cao phân đoạn ethyl acetat cho già trị ICso
thấp (0,162 pig/mi) Từ phân đoạn ethyl acetat, phân lập h chất tinh khiết Fa1 (1,2 mg) Fa2 (9,8
mg) với độ tinh khiễt 82,06% 95,70%.
Từ khóa: đ ắi thào đường SUMMARY
SC R EEN IN G IN VITRO BIO ACTIVE a-GLU CO SID ASE INHIBITORY IN SOM E S P E C IE S O F MORACEAE FAMILY
Trinh Tuy An Bachelor of Science in Biology (Research and Development of Natural based Medicines, University of Medicine and Pharmacy, HCMC.)
Nguyen Linh Nham Pharmacist (University o f Medicine and Pharmacy, HCMC.) instructor. Huynh Ngoc Thuy Assoc Prof., Dr (Department of Pharmacognosy, University of Medicine and Pharmacy, HCMC.)
By selecting plants which have great inhibition o f a-glucosidase, this research tend to find out some medical plants from Moraceae family that are the potential sources o f lead compounds to study for new medicaments for the treatment o f diabetes mellitus The samples o f 21 plants o f three genera Artocarpus, Ficus and Morus were collected in provinces o f southern part o f Vietnam in September, 2014 The inhibitory activity o f extracts against yeast a-glucosidase (Sigma) was determined using modified procedure described by Wang et al (2013) 60 parts used o f 21 plants were extracted to give 180 extracts Modifying the procedure gave the results that the solvent
(2)-solube was DMSO 100% (Sigma); the concentration o f enzyme and PNPG were 0.1 u/ml and 0.1 mM,
respectively; the absorbance was determined after 30 minutes when adding PNPG Among the 180 extracts
tested, ranging to 0.01 mg/ml, the result showed that the most active extract was the extract from sterm o f Ficus
auriculata which was collected at Binh Duong (91.95% ± 0.012) Fraction and determining the ICso o f fractions
from this extract The ICso o f ethyl acetat fraction was lowest (0.162 ụg/ml) From the ethyl acetat fraction,
isolation two pure compounds that were Fa1 (1.2 mg) and Fa2 (9.8 mg) with the purity tested on HPLC were 95.46% and 95.13%, respectively.
Keywords: Ficus auriculata
ĐẶT VẤN ĐÈ VÀ MỤC TIỀU NGHIÊN u Theo số liệu ỉhống kê năm 2011, toàn gỉớí có khoảng 347 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, với 3,'4 triệu người chết (2004)(17) Tại Việt Nam, số người mắc bệnh đái tháo đường 3,16 triệu người (2012), tương tương ,2 % dân số trưởng thành.
Một ỉrong số phương pháp điều trị đái tháo đường khống chế lượng đương huyết sau ăn cách ngăn cản hấp thu carbohydrate qua việc ức chể enzym thủy giải carbohydrat a-glucosidase Hiện thị trường lưu hành nhiều loại thuốc điều trị đái tháo đường theo chế nêu acarbose, voglibose migliỉol lại gây tác dụng phụ dày ruột Chính mặt hạn che ỉhức đẩy việc tìm kiếm dược liệu có khả năng điều hồ đường huyết, hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân đái ỉháo đường để hạn chế tác dụng phụ từ việc sử dụng thuốc tong hợp.
Những thuộc họ Dâu tằm (Moraceae) từ lâu được sử dụng rộng rãi dân gian với nhiều công dụng khác nhau, ỉrong số sake, mít, ngái, dâu tằm sử đụng với mục đích trị đái tháo đường Đây loài quan tâm nghiên cứu giới, theo kết công bổ, số chất phân lập từ thuộc họ Dâu íằm đa chứng minh tác dụng hạ đường huyết luteolin, oxyresveratroí, 1-deoxynojirimicin Những dược liệu khác thuộc họ Dâu tằm tương đồng íhành phần hóa học nên kỳ vọng có the cho íác dụng trị đái tháo đường họ đưực nghiên cửu.
Nhằm góp phần tìm kiếm loại dược liệu cho tác đụng trị đái tháo đường, đề íài "Sàng !ọc in vitro tác dụng ức chế enzym a-giucosidase cùa số loài thuộc họ Dâu tằm (Moraceae)” thực với mục tiêu tim kiếm xác định loài thuộc họ Moraceae cho cao phân đoạn có tác dụng ức chế enzym a-giucosidase dựa phương pháp nghiên cưu thích hợp chọn lọc từ cac tài liẹu tham khảo.
ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 1 ĐỐI tượng ng hiên cứu
1.1 Nguyên liệu
21 mau thực vậí !à lồi thuộc chi lớn Artocarpus, Ficus Morus họ Moraceae íhu hái ờ nhiều tỉnh thành khác Kiên Giang, Đồng Tháp, thành phố Hồ Chí Minh, Binh Dương, Binh Phươc, Lâm Đồng, Bình Định Phú Thọ Thơi gian thu mẫu kéo dài íừ tháng đến hết tháng 11 năm 2014 Mẫu thu hái xác định lồi, xử íý sơ bộ, mã hóa lưu mẫu Bộ mơn Dưực liệu, Đại học Y Dược TP.HCM.
Mẫu chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần cloroform, ethanol % vẩ nước; sau loại dung mơi thu cao tồn phần tương ứng để tiến hành thử nghiệm sàng lọc in vitro trên mơ hình ỉhử íác dụng ức chế a- glucosidase.
1.2 Dung mơi hóa chất
Dùng cho thử nghiệm hoạỉ tính ức chế a- glucosidase: a-glucosidase íừ Sacchammyces cerevisiae, p-nitrophenyl a-D-glucoside (PNPG), potassium monophosphat, potassium diphosphaí, dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma); MeOH (Merck) nước cất hai lần.
Dùng cho chiết xuất phân lập chất tinh khiết định hướng ưc chế a-glucosidase: n-hèxan PA, chloroform PA, ethyl acetat PA, methanol PA acid formic (Chemsol Labscan); silica ge! F254 (Merck) dùng cho sắc ký lớp mỏng; silica gel (Trung Quốc) cỡ hạt mịn ( - ụm) dùng cho sắc ký cột.
ì.3.Dụng cụ thiết bị
Máy Ẻlisa iMarkTM Microplate Absorbance Reader (BIO-RAD); hệ thống HPLC-PD A 2695 (Waters); máy đo pH eco Testr pH2; cân phân tích BP - 221 s (Satorius); cột sắc ký thủy tinh, dài 60 cm, đường kính trong cm, có Khóa; đĩa 96 giếng dụng cụ íhường quy khác phịng thí nghiệm.
1.4 Nơi thực đề tà ĩ
Khâu chuần bị mẫu chiết xuất tách phân đoạn được thực Bộ môn Dược liệu, phần thử nghiệm in vitro sàng iọc tác dụng ức chế a-glucosidase Ổược tiến hành Bộ mơn Sinh hố, Khoa Dược, Đại học Y DượcTP.HCM
Bảng Mẫu dùng cho thử nghiệm sàng lọc in vitro tác dụng ức chế a - giucosidase
Tên khoa học Bộ phận dùng
Tên Việt Nam
Vùng thu hái Artocarpus altilis (Park.)
Fosb
Lá, thân, rề Sake TP Hơ Chí Minh Artocarpus
heterophyllus Lam
Lá, thân, rễ Mít TP Hồ Chí Minh Artocarpus integer
(Thunb.) Merr
Lá, thân Mít tổ nữ
TP Hị Chí Minh Ficus aurículata Lour Lá, thân, rễ Vả Tĩnh Binh
Phước Ficus aurìculata Lour Lá, thân Vả TP Huế Ficus aurículata Lour Lá, thân, rẽ Vả
rừng
• Tĩnh Binh Dương Ficus benjamina L Lá, thân,
rễ, rễ phụ
Si TP Hồ Chí Minh Ficus elastica Roxb ex
Horn
Lá, thân, rễ, rễ phụ
Đa búp đỏ
TP Hồ Chí Minh Ficus heterophyllus L Lá, thân, rề Vú bị Tĩnh Bình
Phước
(3)-Ficus hirta Vahl Lá, thân, thân rễ
Vú bò Tỉnh Binh Phước Ficus hispida L.f Lá, thân, rễ Ngái Tỉnh Bình
Phước Ficus hispida L.f Lá, thân Ngái TP Hồ Chí
Minh Ficus microcarpa L.f Lá, rể phụ Gừa Tỉnh Đồng
TUA*ỉ 1\aụ Ficus pumila L Lá,thân Sung
thằn lằn
TP, Hồ Chí Minh Ficus racemosa L Lá, thân, rê Sung TP Hơ Chí
Minh Ficus regliosa L Lá, thân, rê BỊ ổề TP Hơ Chí
Minh Morus alba L Lá, thân, rế Dâu
tằm
Tỉnh Bình Định Morus alba L Lá, thân, rễ Dâu
tằm
TP HỒ Chí Minh Morus alba L Lá, thân, rễ Dâu
tằm
Tình Kiên Giang Morus alba L Lá, thân, rễ Dâu
tằm
Tỉnh Lâm Đồng Morus alba L Lá, thân, rễ Dâu
tằm
Tình Phú Thọ 2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế ơ-glucosidase
Dược liệu xay nhỏ thành bột, rây qua rây mm 20 g dược liệu chiết kiệt phương pháp đun hòi lưu 95 ° c lấn lượt với ba dung môi có độ phân cực tăng dần: chloroform, ethanoi nước Loại dung mơi thu cao tồn phần Cao tồn phần mẫu thử hịa tan dung môi DMSO (tỷ iệ DMSO sử dụng khảo sát) Nồng độ dung dịch mẹ của mau thử iẩ mg/ml Pha dung dịch đẹm kaii phosphat 50 mM (pH 6,8), dung dịch a-glucosidase 0.1 u/mi PNPG 0.1 mM dung dịch đệm phosphat Nồng độ chất mẫu thử ià nồng độ cuổi trong giếng.
Đề tài tham khảo 146 tài liệu báo cáo thử nạhiệm tác dụng ức chế a-glucosidase từ năm 1992 đen năm 2014, đáng lưu ý số lượng nghiên cứu vấn đề tăng đột biến từ năm 2005 đến 2014 số đó, 23 tài liệu tham khảo có đối tượng nghiên cứu dược liệu thuộc họ Moraceae Sau tham khảo đối chiểu quy trình, quy trinh nghiên cứu Wang Z.W cộng (2013)(19) chọn đề tham khảo xây dựng quy trinh sàng lọc in vitro tác dụng ức chế a-glucosidase quy trình thử nghiệm tiến hành thời gian ngắn (90 phút), lượng enzym PNPG sử dụng vừa đủ cho phản ứng xảy hoàn toàn, quy trinh có tính lập lại điều kiện tiến hành thử nghiệm phù hợp với khả phịng thí nghiệm chơ Quỳ trình bao gồm năm bước chính: (1) thêm vào giếng 150 \xị đệm phosphate (50 mM, pH 6.8), 10 ịil mẫu thử (1 mg/ml) và 10 \xì enzym (0.1 u/m!) —> (2) ủ ở 37 ° c 60 phút - * (3) them 30 PNPG (0.1 mM) — (4) ủ tiếp ở 37 ° c tròng 30 phút ’->• (5) đo độ hấp thu bứớc song 415 nm Tiến hanh đồng thời mẫu trắng, mẫu chứng, mẫu chứng trắng mẫu thử đĩa 96 giếng; loại mẫu gồm cốc thành phan phản ứng khác nhau:
Bảng So sánh thành phần íham gia phản ứng giữa cảo loại mẫu
Mầu thử Enzym PNPG Đêm
I/ỉẫu trắng + +
Mấu chuấn + + +
Mâu chứng trắng
+ + +
Mâu thứ + + + +
Dưới xúc tác enzym a-giucosỉdase, phản ứng phân giải PNPG cho hai sản phầm ià a-D- glucose p-nitrophenol (P N P ) PNP chát màu vàng, có cực đại hấp thu 415 nm, PNP sinh ra định lượng cách đo độ hấp thu quang bước sóng 15 nm Khi ỉhêm vào hỗn hợp phản ứng mẫu cao chiết dược liệu có tác dụng ức che a-glucosidase, dẫn đến giảm hàm lượng PNP sinh ra, màu vàng nhạt hẳn So sánh hàm lượng PNP sinh mẫu thử (có diện tác
nhân gây ức chế
a-glucosidase) mẫu chuẩn (a-glucosidase hồn tồn khơng bị ức chế) để xác định phần trăm ức chế a- glucosidase mẫu cao chiết dược ííệu.
Quá trinh sàng lọc in vitro íác dụng ửc chế a- glucosidase tiến hành đĩa 96 giếng, bao gồm năm thiết kế thỉ nghiệm chính: (1) khảo sát tỷ lệ DMSO hòa tan mẫu tốt nhẩt (khảo sát tỷ lệ 10, 25, 50, 75 100%), (2) khảo sốt ảnh hưởng dung mơi hịa tan mẫu lên íhành phần tham gia phản ứng (khảo sát nhiều đung môi khác DMSO, methanol hỗn hợp DMSO - methanol (1:1)), (3) khảo sáí động học phản ứng a- glucosidase PN FG (theo dõi ổn định độ hấp ỉhu quang sau thời gian phản ứng để lựa chọn thời điểm đo), (4) dò liều toi thiếu ức che a-giucosidase írên 0% của cao chiết (giảm dần từ nồng độ ban đầu mẫu thử ià mg/ml) (5) xác định IC50 phân đoạn íừ mẫu cao chó tác dụng ức chế a-glucosidase mạnh Tùy theo thiết kế thí nghiệm có sơ đồ bố ỉrí thí nghiệm tương ứng đĩa 96 giếng Trên mỗi đĩa 96 giếng bố trí đầy đủ mẫu trắng, mẫư chứng, mẫu chưng trắng va mẫu thử với số mẫu thử đảm bảo có tính ỉhống kê Thử nghiệm lặp lại lần láy giá trị trung binh xác ổịnh độ lệch chuẩn tương đối Ầp dụng phần mềm Sigrria Plot 10.0 dựng đường phi tuyến để tư xác định IC50 Kết quả phần trăm tác dụng ức chế a-giucosidase rnẫu thử tính tốn theo cơng thức:
% ứ c che a-glucosidase = X 100
2.2 Phân lạp chất tinh khiết theo định hướng cho tác dụng ức chế a-glucosidase
Chọn mẫu có tác dụng ức chế a-giucosỉdase mạnh nhất đề tiến hành thu mâu lượng lớn, khảo sát đặc điểm hình thái thực vật, cấu tạo vi học dược liệu tươi bột dược liệu định tính sơ thành phần hóa íhực vật Chiết nóng dược liệu ở 95 ° c với cồn % 12 giờ, lọc dịch chiết loại dung môi thu cao toàn phần Phân tách phân đoạn tư cao toàn phần kỹ thuật lắc phân bố lỏng - lịng lần lượt với dung mơi có độ phân cực khác nhau: chloroform, ethyl acetat methanol Sàng lọc in vitro
tác dụng ức chế a-glucosicfase phân đoạn
(4)-nảy, từ phân đoạn cho tác dụng ức chế a-glucosidase mạnh nhất, phận lập phân đoạn nho phương pháp sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi khai triển CHCI3 - EtOAc, tăng dần độ phân cực theo tỷ íệ từ (100:0) đến (85:5) Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi phân tfch CHCI3 - MeOH - Acid formic (8,5:1,5:0,5) Tinh chế chất thu bằng phương pháp kết tinh phân đoan.
K E T Q U A NGHIÊN c ứ u
Từ 60 phận dùng dược liệu, thu 180 mẫu cao chiết ở dạng cắn khô Các mẫu bảo quản 12 - 15 c lọ nâu tránh ánh sáng Kết khảo sát tỷ lệ DMSO hòa tan mẫu cho thấy mẫu ían hồn tồn DMSO 10 0% Kếỉ khảo sát ảnh hưởng dung mơi hịa tan mẫu chứng minh dung môi không ảnh hưởng đáng ke đến íhành phan tham gia phản ứng (DMSO cho tác dụng ức chế a-glucosidase 8,23%) Kếỉ khảo sát động học phản ứng a- glucosidase PNPG đến kết iuạn chọn thơi điểm đo độ hấp thu phút ihứ 30 sau thêm PNPG Sàng lọc in vitro tốc dụng ức chế a-c|lucosidase 180 mâu cao chiết nồng độ mau thử 1; 0,5 và 0,25 mg/mi nồng độ 0,25 mg/ml 75 mẫu cho kết quả phan trăm ức chế a-glucosidase 60%, 45 mẫu % , 24 mẫu % 16 mẫu 90% Tiểp tục sàng lọc in vitro tác dụng ức chế a- glucosidase 16 mẫu trên, nồng đọ 0,125 mg/mi có mẫu cho kết phần trăm ức chế 80%.
Bảng 16 mâu ức chế a - glucosidase 90 % nồng độ 0,25 mg/ml
STT Mâu thử % ứ c chế a-Gỉucosidase
1 FaLH2 90.68% ± 0.008
2 FaTH3 91.64% ±0.003
3 FaRB2 96.56% ± 0.020
4 FaRB3 97.87% ± 0.004
5 FaTBD1 98.42% ± 0.006
6 FaTBD2 96.32% ± 0.009
7 FheT1 94.19% ±0.049
8 FraL3 94.46% ± 0.001
9 MaRH1 97.00% ± 0.045
10 MaTK2 90.20% ±0.017
11 MaLB2 96.50% ± 0.045
12 MaLB3 93.20% ±0.010
13 AaR3 92.20% ± 0.006
14 AhT1 94.00% ± 0.031
15 AhT2 91.40% ±0.014
16 AÌL3 97.94% ±0.013
Bảng mẫu ức chế a - gỉucosidase 90 % nồng đọ 0,25 0.125 mg/ml
Mầu thử % c chê a-Glucosidase 0.25 mg/mi 0.125 mq/ml
FaLH2 90.68 ±0.008 85.90 ±0.016
FaTBD2 96.32 ± 0.009 91.69 ±0.006 MaLB2 96.50± 0.045 86.67 ± 0.008 MaLB3 93.20 ± 0.010 88.52 ±0.010 AhT2 91.40 ± 0 14 91.07 ±0.007 AÌL3 97.94 ± 0 13 98.72 ± 0.003
Bảng IC50 cao phân đoạn từ mẫu cao thân
Và (Ficus auriculata) thu hái Bình Dương
Cao phân đoan ỈC50
CHCb 2.365
EtOAc 0.162
MeOH 4.200
Từ mẫu có tác dụng mạnh này, dị liều tối thiểu ức chế a-glucosidase % cao chiết Kết cho thấy nồng độ 0,01 mg/mi mẫu cao thân Vâ (Ficus aurícúlata) thu hài Bỉnh Dương cho íác dụng ức chế a-glucosidase mạnh nhấí (91,95% ± 0,012) Sau phân ìách cao phân đoạn chloroform, ethyl aceíat methanol íừ mẫu cao toàn phần ỉrên, xác định ịCso cao phân đoạn Cao phân đoạn ethyl acetaí cho giá trị IC50 ìhấp (0,162 ỉ-tg/mỉ), thấp nhiều lần so vởi IC50 chứng dương genisíein (10,21 |ig/ml) oxyresveratrol (10 ,11 ng/mi), chứng minh cao phân đoạn ethyl acetaí cho tác dụng ức chế a-glucosidase mạnh nhất.
Tiếp tục tiến hành sàng lọc phân đoạn nhỏ của cao phân đoạn ethyi acetat Kỹ thuật sắc ký cộí được dùng để íách phân đoạn ethyi acet với hệ dung mơi khai triển CHCÍ3 - EtOẢc, tăng dần độ phan cực theo tỷ iệ từ (100:0) đến (85:5); kiềm tra phân đoạn thu đứợc sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi phẩn tích CHCI3 - MeOH - Acid formic (8,5:1,5:0,5); gộp phân đoạn tương tự thu 15 phân đoạn nhỏ.
Trong phân đoạn E 15 tách chấỉ Kết tủa Fa1 (1,2 mg) Fa2 (9,8 mg) Tinh chế kiểm tra độ tinh khiết cua Fa1 va Fa2 sắc ký lỏng cao áp (HPLC-PDA) Độ tinh khiết peak Fa1 đạt 82,06% Fa2 95>0%
BÀN LUẬN
So với nghiên cứu trước đó, đề tài khảo sát sàng lọc, bồ sung liệu ioài chưa báo cáo tài liệu tham khảo Ficus benjamina,
Ficus elasỉica, Ficus hirta, Ficus heterophyllus &
Artocarpus interger. Đề tài bỗ sung kết
sàng lọc phận dùng chưa nghiên cứu loài Morus alba (rễ), Artocarpus alitis (rễ), Ficus
racemosa (lá & rễ); đồng thời ỉập lại kết nghiên cứu
ờ lồi Morus alba (iá), Artocarpus àlitis (íá), Ficus pumela, Ficus hispida, Ficus religiosa, Ficus racemosa
(vỏ thân), Artocarpus heterophyllus (lá, vỏ thân) cho thấy liệu cho tác dụng ức chế a- glucosidase mạnh Đã có nghiên cứu in vivo Ahiam EI-Fishawy cộng sự(3) cho thấy dịch chiết Ficus
(5)KẾT LUẬN V À KIẾN NGHỊ
Hiện naỹ tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường íên đến mức báo đọng vằ đối tượng bệnh lan rộng khắp vùng miền, iứa tuổi Việc phất điếu trị bệnh trề nên gây nhiều biến chứng nghỉêm trọng Đề tài có tính cấp thiết việc tim kiêm nghiên cứu nguồn dữợc liệu phòng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường trong bổi cảnh chưa có nghiên cứu thống kê so sánh tác dụng trị đái tháo đường dược liệu trên mơ hình thử nghiệm Nghiên cứu sử dụng phương pháp sàng iọc in vitro trước khỉ thử in VIVO, cho phép sàng lọc số iượng lớn mẫu thử, có khả nang lặp lại, có tinh thống kê với íhời gian thử ngắn chi phí khơng q tốn Đề ỉài mang tính ứng dụng việc phat huy đại hoá việc sừ dụng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu nước cũng phát triển vùng trồng dược liệu Đề tài mở hướng nghiên cứu in vivo mẫu cho tác đụng ức chế ò-glucosidase mạnh để tiến hành phân lập chẩị tinh khiết theo định hướng từ kết sàng lọc, thừ hoạt tính, xác định cấu trúc định iượng nhắm xem xét khả ứng dụng làm chát đánh dầu dùng cho công tác kiểm nghiệm sau này.
TÀI ŨỆU THAM KHẢO
1 Bộ mơn Dược Liệu (2009), Giảo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu, Khoa Dược - Đại học Y Dược TP hỉo Chí Minh.
2 Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Hà Nội Ahlam El-Fishawy1, Rawia Zayed, Sherif Afifi, (2011), “Phytochemical and pharmacological studies of Ficus auriculata Lour” , Journal o f Natural Products, 4,
184-195 _
4 Chan H.-H , Tian-Shung Wua cs., (2010), "Potent a-glucosidase inhibitors from the roots o f Panax japonicus c A Meyer var major”, Phytochemistry, 71,
1360-1364.
5 Chandrasekar Uma, Duraisamy Gomathi, Manokaran Kalaiselvi, (2012), "In vitro Ơ - amylase and a - glucosidase inhibitory effects of ethanolic extract of Evoivulus alsinoides(L.y, International research journal o f Pharmacy, 3(3), 226-229
6 Elya, Eva Kurnia Septiana CS-, (2012), “Screening of a-Glucosidase Inhibitory Activity from Some Plants of Apocynaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, and Rubiaceae”, Journal o f Biomedicine and Biotechnology, 2012,1-6
7 Feng J-, Xiu-Wei Yang, Ru-Feng Wang, (2011), “Bio-assay guided isolation and identification of
a-glucosidase inhibitors from the leaves of Aquilaria sinensis’1, Phytochemistry, 72, 242-247
8 Ferreres F., Paula B Andrade cs , (2013), “In vitro studies of a-gfucosidase inhibitors and antiradical constituents of Glandora diffusa (Lag.) D.c Thomas infusion”, Food Chemistry, 136,1390-1398
9 Jabeen B., Abdul Jabbar cs., (2013), "Isolation of n o f n r i i l O A Í V I Ạ A Ị D l ? / a mir» O Ỉ O S «“ *_
n c u u i c t i b v j i I i p v u i 11 w i l l I i u V / i i i o o t c f W c i / u V O I l U W i i i y U "
glucosidase inhibitory activity”, Phytochemistry, 96, 443- 448.
10 Kim JS, Kwon c s , Son KH, (2000), “Inhibition of a - glucosidase and amylase by luteolin, a flavonoid.”, Biosci Biotechnol Biochem. 64, 2458-2461
11 Kim S.D, (2013), “a-Glucosidase inhibitor from Buthus martensi Karsch”, Food Chemistry, 136, 297-300
12 Li Y., Wenyi Kang cs„ (2012), “Antioxidant, a- glucosidase inhibitory activities in vitro and ailoxan- induced diabetic rats protective effect of Indigofera stachyodes Lindl Root”, Journal o f Medicinal Plants Research, 6(9), 1524-1531
13 Lordan s., R Paul Ross cs.,(2013), ‘The a- amylase and a-giucosidase inhibitory effects of Irish seaweed extracts”, Food Chemistry, 141, 2170-2176
14 Liu G., Zheng-Tao Wang cs., (2014), “Diterpenoids and phenylethanoid glycosides from the roots of Clerodendrum bungei and their inhibitory effects against angiotensin converting enzym and a-giucosidase", Phytochemistry.
15 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, 288.
16 Ryu H.W., Ki Hun Park cs„ (2011), “a- Glucosidase inhibition and antihyperglycemic activity of prenylated xaníhones from Garcinia mangostana", Phytochemistry, 72, 2148-2154
17 Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ, (2010), “Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030”, Diabetes Res Clin Pract, 87(1), 4-14
18 Tao.Y., Yi Wang cs., (2012), “Rapid screening and identification of a-glucosidase inhibitors from mulberry leaves using enzym-immobilized magnetic beads coupled with HPLC/MS and NMR", Biomedical Chromatography.
19 Wang z w , Ling-Yi Kong cs., (2013), “a- Glucosidase inhibitory triterpenoids from the stem barks of Uncaria laevigata", Fitoterapia, 90, 30-37
20 Yang z., Yufeng Zhang cs., (2012), "Bioassay- guided screening and isolation of a-glucosidase and tyrosinase inhibitors from leaves of M alba”, Food
Chemistry, 131, 617-625
Phụ lục ■ Két chiẻt xuắt cao thừ nghiệm
TEN KHOA HỌC KET QUA CHIÊT XUẢT (q)
CHCIs EtOH h20
Ký hìêu KL cao Ký hiệu KL cao Ký hiêu KL cao
Artocarpus alitis A.a.L.1 1,84 A.a.L.2 1,83 A.a.L.3 2,96
A.a.T.1 0,4 A.a.T.2 0,54 A.a.T.3 • 1,32
A.a.R.1 0,97 A.a.R.2 0,75 A.a.R.3 2,48
Artocarpus heterophyìus A.h.L.1 1,03 A.h.L.2 1,42 A.h.L.3 4,69
A.h.T.1 0,32 A.h.T.2 0,31 A.h.T.3 0,7
A.h.R.1 0,4 A.h.R.2 0,39 A.h.R.3 1,19
Artocarpus interger A.i.L.1 1,3 A.i.L.2 2,41 A.i.L.3 5,44
A.i.T.1 0,23 A.i.T.2 0,42 A.i.T.3 1,00
Ficus auriculata Huế
F.a.Lh.1 0,61 F.a.Lh.2 0,86 F.a.Lh.3 4,43
(6)Ficus auriculata F.a.LB.1 0,47 F.a.LB.2 0,96 F.a.LB.3 3,61
Bình Phước F.a.TB.1 0,29 F.a.TB.2 0,85 F.a.TB.3 1,11
F.a.RB.1 0,31 F.a.RB.2 1,79 F.a.RB.3 1,66
Ficus aurículata F.C.L.1 0,24 F.C.L.2 0,56 F.C.L.3 1,31
Bình Dương F.C.T.1 0,36 F.C.T.2 1,01 F.C.T.3 1,83
F.C.R.1 1,49 F.C.R.2 0,78 F.C.R.3 2,25
Ficus benjamina F.b.L.1 1,54 F.b.L.2 0,57 F.b.L.3 2,39
F.b.T.1 0,24 F.b.T.2 0,31 F.b.T.3 0,79
F.b.Rf.1 0,93 F.b.Rf.2 0,73 F.b.Rf.3 1,72
F.b.R.1 0,36 F.b.R.2 0,29 F.b.R.3 1,18
Ficus elastic F.e.L.1 1,26 F.e.L.2 1,16 F.e.L.3 4,21
F.e.Rf.1 0,78 F.e.Rf.2 0,3 F.e.Rf.3 3,27
F.e.T.1 0,72 F.e.T.2 0,67 F.e.T.3 2,38
F.e.R.1 0,87 F.e.R.2 2,8 F.e.R.3 1,89
Ficus heterophylus F.he.L.1 0,7 F.he.L.2 1,31 F.he.L.3 2,28
F.he.T.1 0,29 F.he.T.2 0,28 F.he.T.3 0,86
F.he.R.1 1,34 F.he.R.2 0,46 F.he.R.3 0,99
Ficus hispida F.hi.L.1 0,67 F.hi.L.2 0,9 F.hi.L.3 4,71
Bình Phước F.hi.T.1 0,26 F.hi.T.2 0,33 F.hi.T.3 0,68
F.hi.R.1 0,37 F.hi.R.2 0,74 F.hi.R.3 1,77
Ficus hispida F.hi.LH.1 0,81 F.hi.LH.2 0,98 F.hi.LH.3 3,78
TP HCM F.hi.TH.1 0,17 F.hi.TH.2 0,38 F.hi.TH.3 0,62
Ficus hirta F.hir.T.1 0,28 F.hir.T.2 0,43 F.hir.T.3 1,4
F.hir.L1 0,96 F.hir.L.2 0,63 F.hir.L.3 4,23
F.hir.Tr.1 0,52 F.hir.Tr.2 0,61 F.hir.Tr.3 5,20
Ficus racemosa F.ra.L.1 1,41 F.ra.L.2 1,48 F.ra.L.3 3,63
F.ra.T.1 0,15 F.ra.T.1 0,61 F.ra.T.1 1,29
F.ra.T.1 0,23 F.ra.T.1 0,54 F.ra.T.1 1,75
Ficus regiiosa F.re.L.1 0,92 F.re.L.2 0,88 F.re.L.3 3,03
F.re.T.1 0,19 F.re.T.2 0,32 F.re.T.3 0,51
F.re.R.1 0,34 F.re.R.2 0,61 F.re.R.3 0,85
Ficus microcapa F.m.L.1 1,34 F.m.L.2 2,98 F.m.L.3 4,66
F.m.Rf.1 0,80 F.m.Rf.2 0,45 F.m.Rf.3 1,9
Ficus pumiia F.p.L.1 0,92 F.p.L.2 2,12 F.p.L.3 3,66
F.p.T.1 0,32 F.p.T.2 0,28 F.p.T.3 1,2
Morus alba M.a.LH.1 1,71 M.a.LH.2 1,45 M.a.LH.3 5,79
TP HCM M.a.TH.1 0,35 M.a.TH.2 0,57 M.a.TH.3 1,59
M.a.RH.1 0,74 M.a.RH-2 1,74 M.a.RH.3 3,79
Morus alba M.a.LP.1 2,99 M.a.LP.2 2,81 M.a.LP.3 6,56
Phú Thọ M.a.TP.1 0,38 M.a.TP.2 0,95 M.a.TP.3 1,28
M.a.RP.1 1,04 M.a.RP.2 1,73 M.a.RP.3 4,48
Morus aịba M.a.LK.1 1,98 M.a.LK.2 1,72 M.a.LK.3 3,34
Kiên Giang M.a.TK.1 0,62 M.a.TK.2 1,04 M.a.TK.3 1,12
M.a.RK.1 1,24 M.a.RK.2 1,74 M.a.RK.3 1,8
Morus alba Lâm Đồng
M.a.LL.1 1,37 M.a.LL.2 2,49 M.a.LL.3 6,87
M.a.TL.1 0,40 M.a.TL.2 1,10 M.a.TL.3 1,84
M.a.RL.1 0,77 M.a.RL.2 1,59 M.a.RL.3 2,63
Morus alba M.a.LB.1 5,03 M.a.LB.2 6,01 M.a.LB.3 6,4
Bình Định M.a.TB.1 0,28 M.a.TB.2 0,85 M.a.TB.3 1,07
M.a.RB.1 1,35 M.a.RB.2 3,24 M.a.RB.3 3,95
Phụ lục Kết sàng lọc ỉá c dụng ức chế a-giucosidase 180 mẫu cao chiết
Mẫu % ức chế a ' Glucosidase
1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,25 mq/ml 0,125 mq/ml 0,05 mq/m! 0,025 mq/ml 0,01 mq/mi
AaL1 - 42,02 ± 0,007 77,33 ± 0,036 - _ - _
AaL2 70,45±0,012 88,52 ± 0,004 68,49 ±0.015 - _ _
AaL3 - 2,38 ± 0,026 - - _
-AaT1 56,23 ±0,070 88,53 ±0,104 66,31 ± 0,062 - _
-AaT2 98,03 ±0,101 67,83 ±0,018 81,81 ±0,012 - - -
-AaT3 - - - -
-AaR1 94,18 ± 0,141 33,42 ± 0,062 46,30 ± 0,045 - - - _
(7)-AaR3 86,74 ± 0,030 79,12 ±0,015 92,20 ± 0,006 61,03 ±0,019 - -
-** AhL1 - 7,53 ± 0,057 58,34 ± 0,043 - - -
-AhL2 78,94 ± 0,031 79,12 ±0,018 84,68 ± 0,011 - - -
-AhL3 74,10 ±0,013 78,85 ±0,019 82,17 ±0,011 - - -
-AhT1 17,65 ±0,133 50,36 ±0,109 94,00 ± 0,031 72,65 ± 0,009 - -
-AhT2 82,17 ±0,035 72,85 ± 0,030 91,40 ±0,014 91,07 ±0,007 88,57 ±0,014 87,62 ± 0,021 85,71 ±0,019
AhT3 50^36 ± 0,036 75,00 ±0.016 84.23 ± 0.004 - - -
-AhR1 - 35,30 ± 0,048 85,93 ± 0,039 - - -
-AhR2 89,96 ± 0,059 64,87 ± 0,050 77,60 ±0,015 - - -
-AhR3 8,60 ± 0,026 15,86 ±0,024 - - - -
-AÍL1 25,27 ± 0,095 57,26 ± 0,054 59,32 ± 0,036 - - -
-AÍL2 75,09 ±0,018 69,18 ±0,016 85,75 ± 0,005 - - -
-AÍL3 65,23 ± 0,029 73,03 ± 0,023 97,94 ±0,013 98,72 ± 0,003 88,74 ± 0,044 89,87 ± 0,007 87,66 ± 0,009
AĨT1 24,28 ±0,071 56,45 ± 0,042 76,43 ± 0,043 - - -
-AÍT2 76,43 ± 0,022 77,33 + 0,015 87,90 ± 0,009 - - - ~
AÍT3 - - -
-FaLH1 29,30 ±0,139 49,01 ± 0,057 63,35 ±0,019 - - -
-FaLH2 94,80 ± 0,007 99,28 ± 0,004 90,68 ± 0,008 85,90 ±0,016 87,03 ± 0,004 90,39 ± 0,009 92,29 ± 0,008
FaLH3 77,69 ±0.,30 85,84 ± 0,006 82,53 ±0,026 - - -
-FaTH1 - 59,53 ±0,032 25,46 ± 0,032 - - -
-FaTH2 47,85 ±0,019 85,61 ± 0,006 65,68 ±0,016 - - -
-FaTH3 32,35 ± 0,023 85,98 ±0,002 91,64 ±0,003 60,61 ±0,021 - -
-FaLB1 - 93,36 ± 0,046 78,72± 0,048 - - -
-FaLB2 62,49 ± 0,049 87,95 ± 0,024 54,24 ±0,032 - - -
-FaLB3 93,36 ± 0,011 86,35 ± 0,009 61,38 ±0,024 - - -
-FaTB1 - 81,92 ±0,060 65,31 ± 0,027 - -
-FaTB2 78,84 ±0,012 85,61 ±0,016 55,84 ± 0,042 - - -
-FaTB3 86,10 ±0,020 73,19 ±0,017 56,70 ± 0,025 - - - ~
FaRB1 62,98 ±0,019 62,98 ± 0,020 68,02 ±0,015 - - -
-FaRB2 85,73 ±0,007 79,21 ± 0,043 96,56 ± 0,020 52,11 ±0,030 - -
-FaRB3 92,25 ±0,004 84,01± 0,009 97,87 ± 0,004 45,59 ± 0.06D - -
-FaLBDI 59,78 ± 0,059 - - -
-FaLBD2 49,08 ± 0,047 37,52 ± 0,059 60,52 ± 0,024 - -
-FaLBD3 57,64 ±0,016 19,07 ±0,033 66,52 ±0,010
-FaTBDI 37,12 ±0,050 14,56 ±0,040 98,42 ± 0,006 77,90 ± 0,008 -
-FaTBD2 31,88 ±0,021 10,34 ±0,034 96,32 ±0,009 91,69 ±0,006 83,12 ±0,019 86,15 ±0,015 91,95 ±0,012
FaTBD3 44,83 ± 0,029 35,23 ± 0,027 70,16 ±0,011 - -
-FaRBDI 12,08 ±0,042 75,55 ± 0,075 23,87 ± 0,031 - -
-FaRBD2 6,99 ± 0,024 - 5,2 ±0,031 -
-FaRBD3 56,77 ± 0,011 46,87± 0,020 28,97 ±0,027 -
-FbL1 _ - 72,08 ± 0,056 - -
-FbL2 58,06 ±0,031 70,23 ± 0,020 50,92 ±0,019 - -
-FbL3 93,24 ± 0,004 80,69 ±0,017 32,59 ± 0,055 - -
-FbTl 88,68 ± 0,047 63,35 ± 0,050 43,17 ±0,026 - - -
-FbT2 13,53 ±0,066 63,35 ± 0,022 55,54 ±0,019 - - -
-FbT3 50,80 ± 0,025 74,42 ±0,015 75,06 ±0,014 - - -
-FbR1 49,94 ± 0,069 10,82 ±0,091 77,37 ± 0,009 - - -
-FbR2 14,88 ±0,068 71,22 ±0,020 73,31 ±0,019 - - -
-FbR3 47,11 ±0,024 - 88,81± 0,011 - - -
-FbRfl 59,04 ± 0,070 48,09 ± 0,080 89,29 ± 0,032 - - -
-FbRf2 77,74 ±0,031 57,57 ± 0,020 59,90 ±0,026 - - -
-FbRf3 99,75 ± 0,004 48,59 ± 0,027 53,38 ±0,019 - - -
-FeL1 - - -
-FeL2 24,02 ± 0,022 25,62 ± 0,029 35,08 ± 0,028 - - -
-FeL3 44,11 ±0,022 30,28 ± 0,026 61,28 ±0,014 - - -
-FeT1 54,51 ±0,114 - 67,54 ± 0,035 - - -
-FeT2 54,00 ± 0,049 3,64 ± 0,033 53,64 ±0,038 - - -
-FeT3 46,58 ± 0,024 83,12 ±0,010 65,21 ±0,013 - - -
-FeR1 _ 54,29 ± 0,046 70,92 ±0,012 - - -
-FeR2 98,40 ± 0,005 59,10 ±0,017 36,10 ±0,022 - - -
-FeR3 49,35 ± 0,029 45,56 ± 0,022 55,31 ± 0,024 - - -
-FeRfl - 4,95 ± 0,060 41,34 ±0,096 - - -
-FeRf2 42,50 ±0,028 44,11 ±0,024 78,46 ±0,014 - - -
(8)-FeRf3 19,94 ±0,037 43,96 ±0,020 88,65 ±0,006 ~ - ~
-FheL1 - 76,42 ± 0,072 66,38 ± 0,044 - - -
-FheL2 - 77,584 ±0,013 44,250 ± 0,021 - - -
-FheL3 - 75,55 ±0,018 62,27 ±0,052 - - -
-FheT1 - - 94,19± 0,049 76,20 ±0,018 - -
-FheT2 - 49,64 ±0,019 8,73 ± 0,022 - - -
-FheT3 - 46,29 ±0,011 26,70 ±0,015 - -
-Fhe R1 16,89 + 0,052 24,75 ± 0,029 45,50 ±0,031 - - -
-FheR2 89,49 ±0,033 63,31 ±0,012 41,95 ±0,023 - - -
-FheR3 24,72 ± 0,039 71,92 ±0,007 74,68 ±0,010 - - -
-FhiL1 89,66 ±0,091 77,43 ± 0,084 5,25 ± 0,048 - - -
-FhiL2 3,70 ±0,072 41,60 + 0,026 - - - -
-FhiL3 - 65,20 ± 0,005 - ~ - -
-FhiT1 - 42,46 ± 0,029 - - - ~
-FhiT2 71,92 + 0,041 55,38 ±0,023 3,36± 0,040 - - -
-FhiT3 85,87 ± 0,006 70,37 ±0,016 44,36 ±0,019 - - -
-FhiR1 0,95 ±0,066 - 58,06 ±0,017 - - ~ ~
FhiR2 44,88 ± 0,039 70,20 ±0,029 60,89 ±0,010 - - -
-FhiR3 6,460 ±0,017 78,12 ± 0,010 75,02 ±0,015 - - -
-FhiLHI - 16,97 ±0,071 - - - -
-FhtLH2 6,12 ±0,041 06,63 ± 0,005 - - - -
-FhiLH3 89,84 ±0,010 44,36 ± 0,027 - - - -
-FhiTHI 44,36 ±0,039 56,59 ± 0,024 - - - ~
-FhiTH2 82,08 ±0,013 58,66 ± 0,039 - - - -
-FhiTH3 79,16 ±0,015 77,26 ±0,014 34,02 ± 0,026 - - -
-FhirLI - 17,48 ±0,083 40,91 ±0,090 - - -
-FhirL2 - 58,66 ±0,019 - - - -
-FhirL3 66,06 ±0,018 74,68 ± 0,007 53,32 ±0,015 - - -
-FhirH - 82,95 ±0,017 - - - -
-FhirT2 34,20 ±0,029 64,69 ±0,010 47,63 ±0,021 ~ - - ~
FhirT3 94,66 ± 0,005 67,27 ±0,012 22,83 ±0,021 - -
-FhirTrl 55,38 ±0,040 7,67 ± 0,038 38,67 ±0,012 - -
-FhirTr2 60,72 ± 0,010 25,58 ±0,024 35,57 ±0,025 -
-FhirTr3 46,94 ±0,018 36,95 ± 0,024 82,77 ± 0,006 - - ~
-FraH - 70,95± 0,027 - -
-FraL2 54,00 ± 0,027 88,00 ± 0,005 75,54 ± 0,007 -
-FraL3 54,62 ± 0,023 88,15 ±0,004 94,46 ±0,001 46,58 + 0,023
-FraT1 44,00 ± 0,065 74,92 ± 0,020 69,54 ± 0,02
-FraT2 66,46 ±0,014 98,92 ±0,009 76,92 ±0,009 -
-FraT3 81,38 ±0,007 84,62 ± 0,003 63,54 ±0,011 -
-FraR1 46,00 ± 0,042 22,00 ± 0,024 - - -
-FraR2 75,69 ±0,011 86,15 ±0,005 58,62 ±0,018 - - -
-FraR3 74,92 ±0,010 84,62 ± 0,004 67,23 ±0,011 - - -
-FreL1 - 36,31 ±0,095 64,00 ± 0,060 - - -
-FreL2 25,69 ±0,031 58,77 ±0,010 78,46 ±0,011 - - -
-FreL3 66,77 ±0,011 92,31± 0,001 63,23 ± 0,026 - - -
-FreT1 77,23 ±0,083 74,15 ±0,036 22,46 ± 0,038 - - -
-FreT2 75,08 ±0,016 80,62 ±0,016 57,38 ±0,019 - - -
-FreTS 90,46 ±0,014 84,92 ±0,003 19,85 ±0,044 - - -
-FreR1 80,77 + 0,075 - 54,77 ±0,035 - - -
-FreR2 23,85 ±0,050 77,23 ± 0,059 54,92 ±0,036 - - -
-FreR3 46,00 ± 0,020 91,23 ±0,002 73,23 ±0,010 - - -
-FmL1 - - 73,54 ± 0,057 - - -
-FmL2 37,54 ±0,018 93,54 ± 0,004 85,85 ±0,010 - - -
-FmL3 62,46 ± 0,030 86,77 ±0,011 78,31 ±0,030 - - -
-FmRfl - 58,31+0,056 54,62 ± 0,045 - - -
-FmRf2 81,69 ±0,036 64,31± 0,019 57,69 ±0,016 - - -
-FmRf3 98,92 ± 0,008 61,54± 0,011 48,46 ± 0,020 - - -
-FpL1 - - 23,85 ± 0,023 - - -
-FpL2 75,38 ±0,046 58,15 ±0,018 55,69 ±0,011 - - -
-FpL3 68,15 ± 0,017 67,19 ±0,021 46,75 ± 0,030 - - -
-FpT1 - 5,65 ± 0,044 38,46 ± 0,068 - - - ~
FpT2 6,25 ±0,057 67,55 ±0,016 - - - -
(9)-FpT3 77,16 ±0,027 88,70 ± 0,005 72,84 ± 0,009 ~ - _ _
MaLH1 - 94,35 ±0,019 83,28 ±0,011 - - -
-MaLH2 74,28 ±0,018 83,53 ± 0,007 49,52 ± 0,031 - - - _
MaLH3 83,17 ±0.008 69,23 ±0,012 48,68 ± 0,024 - - -
-MaTH1 - - ~ - - -
-MaTH2 70,79 ± 0,025 95,19 ±0,020 46,75 ± 0,025 - - -
-MaTH3 21,27 ±0,026 63,94 ±0,011 53,13 ±0,018 - - -
-MaRH1 - 97,36 ± 0,041 97,00 ±0,045 64,35 ±0,019 - -
-MaRH2 8,05 ± 0,061 95,91 ±0,011 69,35 ± 0,009 - - -
-MaRH3 29,33 ± 0,026 83,29 ± 0,003 50,12 ±0,030 - - -
-MaLP1 - - 15,75 ±0,038 - - -
-MaLP2 68,15 ±0,031 73,32 ± 0,028 48,80 ± 0,022 - - -
-MaLP3 96,63 ± 0,022 63,82 ±0,019 57,33 ± 0,036 - - ~
MaTP1 - 2,88 ± 0,056 84,01 ± 0,031 - -
-MaTP2 46,39 ± 0,040 62,74 ±0,020 75,12 ± 0,011 - -
-MaTP3 46,51 ±0,015 34,38 ±0,019 55,29 ± 0,007 - - -
-MaRP1 50,84 ± 0,058 56,61 ±0,028 41,35 ±0,040 - - - _
MaRP2 93,75 ± 0,022 96,51 ±0,005 60,82 + 0,018 - - -
-MaRP3 86,78 ± 0,007 59,74 ±0,023 42,55 ± 0,022 - - -
-MaLK1 - - 61,46 ±0,022 - -
-MaLK2 - 36,42 ± 0,046 39,06 ± 0,025 - - -
-MaLK3 56,13 ±0,010 55,17 ±0,029 25,00 ± 0,032 - -
-MaTK1 - 60,58 ± 0,068 48,80 ± 0,026 - - -
-MaTK2 - 47,62 ±0,031 90,20 ±0,017 69,68 ± 0,022 ~ -
-MaTK3 32,77 ±0,032 53,22 ± 0,020 75,49 ± 0,002 - - -
-MaRK1 - 32,49 ± 0,072 74,79 ±0,017 - - -
-MaRK2 59,10 ±0,015 68,35 ±0,012 80,81 ± 0,021 - -
-MaRK3 73,81 ±0,026 91,88 ±0,007 66,53 ±0,011 - - -
-MaLL1 - - 33,55 ±0,064 - -
-MaLL2 43,84 ± 0,025 69,89 ±0,011 55,32 ±0,013 -
-MaLL3 75,35 ±0,018 65,83 ±0,014 61,9010,010 - - -
-M a in - 63,45 ± 0,047 - -
-MaTL2 25,07 ±0,018 77,59 ± 0,024 88,24 ± 0,020 -
-MaTL3 21,85 ±0,027 50,70 ± 0,026 71,85 ±0,003 -
-MaRH 78,43 ± 0,041 44,40± 0,050
-MaRL2 39,50 ± 0,038 92,86 ±0,007 64,43 ±0,016 -
-MaRL3 43,28 ±0,018 9,38 ±0,027 32,35 ±0,019
-MaLB1 73,95 ±0,073 59,90 ±0,017 -
-MaLB2 82,91 ±0,021 23,11 ±0,039 96,50 ± 0,045 86,67 ± 0,008 71,52 ±0,028 82,25 ±0,019 82,86 ±0,019 MaLB3 52,66 ±0,016 31,65 ±0,028 93,20 ±0,010 88,52 ±0,010 64,94 ± 0,027 73,77 ±0,019 62,16±0,018
MaTB1 1,40 ±0,050 59,52 ±0,100 81,09 ±0,015 -
-MaTB2 16,67 ±0,035 41,74 ±0,025 75,77 ±0,026 - -
MaTB3 28,29 ± 0,024 40,06 + 0,015 46,64 ±0,010 -
-MaRB1 - 87,39 ± 0,097 11,48 ±0,077 - -
-MaRB2 65,55 ± 0,026 90,76 ± 0,005 69,05 ±0,019 -
MaRB3 82,49 ± 0,008 72,27 ± 0,005 34,31 ±0,018 -