Ứng dụng marker phân tử trong chọn dòng dưa leo mang toàn hoa cái

Ứng dụng marker phân tử chọn Dòng dưa leo mang tồn hoa Nguyễn Trần Đơng Phương 2020 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .5 DANH MỤC BẢNG THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU INFORMATION ON RESEARCH RESULTS PHẦN I - PHẦN MỞ ĐẦU .11 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu (Trong nước) .12 1.1.1 Tổng quan dưa leo 12 1.1.2 Dưa leo toàn hoa (Gynoecious) tầm quan trọng sản xuất hạt giống lai 14 1.1.3 Phân biệt dưa leo toàn hoa (Gynoecious) dưa leo trinh sinh (Parthenocarpic) 16 1.1.4 Tổng quan thị phân tử hỗ trợ chọn giống 16 1.1.5 Phương pháp tìm hiểu phân tích tính trạng thực vật 18 1.1.6 Đặc điểm hoa dưa leo 19 1.1.7 Hiện trạng công trình nghiên cứu liên quan đến nhiệm vụ 20 1.2 Lý nghiên cứu tính cấp thiết đề tài 24 PHẦN - MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu .27 2.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 27 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu: .27 2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 27 2.3 Cách tiếp cận 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu .27 2.4.1 Nguồn vật liệu ban đầu 27 2.4.2 Phương pháp trồng chăm sóc dưa leo 27 2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA 29 2.4.4 Phương pháp xác định chất lượng DNA 29 2.4.5 PCR với mồi 30 2.4.6 Điện di .30 PHẦN - NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA 33 3.2 Tối ưu hóa quy trình nhận diện dịng dưa leo tồn hoa marker phân tử .35 3.2.1 Marker Cs-Female 36 3.2.2 Marker Cs-Female 37 3.2.3 Marker Cs-BCAT 38 3.3 Giải trình tự xác đinh độ đặc hiệu marker Cs-BCAT 39 3.3.1 Phản ứng PCR giải trình tự 39 3.3.2 Phân tích trình tự 40 3.3.3 Thử nghiêm marker dòng 43 3.3.4 Mối tương quan marker phân tử kiểu hình dịng 46 3.3.5 Khả nhận diện dòng dưa leo toàn hoa marker CsBCAT hệ F2 .47 PHẦN - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 4.1 Kết luận 52 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO .53 DANH MỤC HÌNH Hình Kết điện di DNA 10 mẫu tách theo quy trình tối ưu hóa 34 Hình Bản đồ liên kết biểu vị trí locus F NST số việc phân tích hai qn thể F2 WJE F10; WJE F11 (dịng tồn hoa cái) WNE F8 (dịng có hoa đực cái) 36 Hình Gradient nhiệt độ mồi Cs-Female (thang 100bp) 37 Hình Gradient nhiệt độ mồi Cs-Female (thang 100bp) Kích thước 220/204 (allele hoa cái/hoa đực) 37 Hình Khảo sát mồi Cs-BCAT nhiệt độ 47oC (thang 100bp) 38 Hình Khảo sát nhiệt độ mồi Cs-BCAT nhiệt độ 50oC (A), 52oC (B), 54oC (C) (thang 100bp) 39 Hình Kết phân tích sản phẩm PCR với mồi BCAT-S gel agarose 1% (thang 100bp) 40 Hình Thơng tin ACS1G gene dịng tồn hoa 41 Hình Thơng tin giải trình tự với cặp mồi BCAT-S dịng tồn hoa (9.6; 10.6; 11.6) dịng có hoa đực hoa (4.6 14.6) .43 Hình 10 Kết phân tích sản phẩm PCR với mồi Cs-BCAT gel agarose 1%, (thang 100bp) 44 Hình 11 Kết phân tích sản phẩm PCR với mồi Cs-Female1 gel agarose 2%, thang 100bp Kích thước 197/163 (allele hoa cái/hoa đực) 45 Hình 12 Kết phân tích sản phẩm PCR với mồi Cs-Female gel agarose 2.5%, thang 100bp Kích thước 204/222 (allele hoa cái/ hoa đực) 46 Hình 13 Kết điện di sản phẩm PCR với marker CsBCAT 50 mẫu dưa leo F2 Thang chuẩn 100 bp 48 DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR 30 Bảng Nồng độ độ tinh 10 mẫu DNA tách theo quy trình nhà sản xuất 33 Bảng Nồng độ độ tinh 10 mẫu DNA tách theo quy trình tối ưu hóa 34 Bảng Nhiệt độ lai cặp mồi 39 Bảng Thông tin mồi giải trình tự 40 Bảng Kết khảo sát marker kiểu hình 47 Bảng Độ đặc hiệu marker CsBCAT 50 mẫu dưa leo F2 48 PHẦN I PHẦN MỞ ĐẦU 11 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu (Trong nước) 1.1.1 Tổng quan dưa leo Dưa leo (Cucumis sativus L.), thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae), chi Cucumis, lồi C.sativus L., có nhiễm sắc thể 2n=14 Dưa leo cho có nguồn gốc từ Tây Bắc Ấn Độ (Leppik, 1966) Dưa leo trồng sớm Trung Quốc (Tatlioglu, 1993) Đây xem trung tâm khởi nguyên thứ hai dưa leo (Tatlioglu, 1993) Dưa leo trồng khoảng 100 năm trước Công nguyên nơi (Tatlioglu, 1993) Dưa leo thực phẩm quen thuộc bữa ăn nhiều gia đình Loại thực phẩm chứa nhiều dưỡng chất tốt cho sức khỏe Dưa leo chứa phần lớn nước (90%) Dưa leo chứa nhiều loại vitamin (C, B1, B2, B5, B6) nhiều loại khoáng chất tự nhiên (Canxi, Sắt, Magie) (Rahman et al., 2008) Dưa leo chứng minh có tiềm ngừa ung thư vú, buồng trứng, tử cung tuyến tiền liệt (Muruganantham et al., 2016) Dưa leo có thời gian sinh trưởng ngắn cho suất cao Quả dưa leo vừa sử dụng để ăn tươi vừa sử dụng cho chế biến Chính lý mà dưa leo trồng phổ biến Việt Nam nhiều nơi giới Tình hình sản xuất dưa leo giới Việt Nam Theo thống kê tổ chức Lương thực Nơng nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), diện tích trồng dưa leo giới tăng hàng năm Ước tính tổng sản lượng dưa leo tồn giới tính từ năm 1991 17,7 triệu với diện tích canh tác 1,18 triệu Năm 2016, sản lượng lên tới 80,6 triệu 21,44 triệu diện tích canh tác Tổng sản lượng bình qn từ năm 1991 đến 2016 tăng 354% Những quốc gia có sản lượng dưa leo cao là: Trung Quốc (diện tích: 1.702.777 ha, sản lượng (28.247.373 tấn); Iran (82.000 ha, 1.800.000 tấn); Thổ Nhĩ Kỳ (59.000 ha, 1.678.770 tấn); Nga (73.000 ha, 1.000.000 tấn); Mỹ (59.480 ha, 963.000 tấn) (http://faostat.fao.org/site/399/defaulaspx.FAOSTAT/@FAO statistics Division, 2010, 19 March 2010) Ở nước ta, dưa leo trồng nhiều vùng nước thích hợp chủ yếu đồng Nam Bộ miền núi phía Bắc Một số tỉnh trồng nhiều dưa leo như: Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Nam Định, Đồng Nai, Tiền Giang, Cần Thơ với tổng sản lượng năm 2009 577,218 Theo số liệu cục Hải Quan, 12 kim ngạch xuất dưa leo bao tử dạng chế phẩm tháng đầu năm 2009 đạt 22,2 triệu USD, tăng 155,6% so với năm kỳ năm 2008 Tháng năm 2009 kim ngạch xuất sản phẩm đạt gần 1,9 triệu USD nâng tổng kim ngạch dưa chuột nửa đầu năm 2009 lên 24,1 triệu USD Trong đầu năm 2009, xuất mặt hàng dưa leo đến thị trường tăng Trong xuất sang thị trường Nga, Nhật Bản Rumani chiếm ưu vượt trội chiếm 77,5 tổng kim ngạch Niên giám thống kê tháng đầu năm 2019 tổng cục thống kê cho thấy xuất rau (Vegetable) Việt Nam (trong có dưa leo) đạt 2082 triệu USD, đạt 105% so với kỳ 2018 Đặc điểm thực vật học dưa leo (Kirkbride, 1993) Rễ: Dưa leo có rễ phát triển yếu, rễ phân bố tầng đất mặt 30-40 cm Thân: Thân dài trung bình 1-3m, có nhiều tua dễ bám bị Thân trịn hay góc cạnh, có lơng nhiều hay tùy thuộc vào giống Thân thường phân nhánh, nhiên có loại dưa leo hồn tồn không phân nhánh ngang Chiều dài thân tùy thuộc vào điều kiện canh tác giống Các giống canh tác đồng thường dài từ 0,5-2m, giống trồng nhà kính dài 5m, phân nhánh phụ thuộc vào nhiệt độ ban đêm Thân mầm lóng thân điều kiện độ ẩm cao nhiều rễ bất định Lá: Lá đơn, to mọc cách thân, dạng tam giác với dài từ 515cm, rìa ngun có cưa Hoa: Hoa đơn tính Hoa mọc nách thành đôi riêng biệt, hoa đực mọc thành cụm từ 5-7 hoa, dưa leo có hoa lưỡng tính Có giống có ba loại hoa có giống có loại hoa Hoa có màu vàng, thụ phấn nhờ trùng, bầu noãn hoa phát triển nhanh trước nở Trái: Trước lúc non trái dưa leo có gai xù xì, trái lớn gai Trái từ hình thành có màu xanh đậm, xanh nhạt, có hoa văn (sọc, vệt, châm) trái chín chuyển sang màu vàng sậm, nâu hay trắng xanh Phẩm chất trái không tùy thuộc vào hàm lượng chất dinh dưỡng có trái mà cịn tùy thuộc vào độ thịt, chiều dày vỏ thịt, hương vị trái Đặc điểm sinh trưởng Dưa leo thuộc nhóm ưa nhiệt Nhiệt độ thích hợp cho dưa tăng trưởng 30 oC 13 (ban ngày) 18-21oC (ban đêm) Dưa có phản ứng với độ dài ngày khác tùy theo giống, thông thường ngày ngắn kích thích trái Cây thích hợp chiếu sáng 10-12 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng phạm vi 15.000 – 17.000 lux Do rễ dưa leo phát triển tầng đất mặt nên yêu cầu độ ẩm cao (85-90%), đứng đầu họ bầu bí Dưa leo chịu hạn yếu Nếu thiếu nước phát triển tạo nhiều chất gây đắng Dưa leo thời kì khác yêu cầu lượng nước khác Hạt nảy mầm yêu cầu lượng nước 50% hạt Thời kì thân, rễ phát triển cịn yếu, lượng nước tiêu hao nên u cầu nước có mức độ Thời kì hoa, tạo trái cần lượng nước nhiều Đặc điểm gene dưa leo Cơ chế di truyền việc biểu tính trạng dưa leo bị kiểm soát hệ thống di truyền bao gồm: Di truyền theo dòng mẹ lục lạp (chiều dài DNA: 155,293bp), di truyền ti thể (chiều dài DNA 1,685 kb) di truyền theo nhân từ bố mẹ (2n=14) (Weng, 2016) Dưa leo đối tượng nghiên cứu sâu gene Các nhà khoa học độc lập thực giải trình tự gene dịng dưa leo khác Cụ thể dòng 9930 (Chinese Long)(Huang et al., 2009), B10 (North European) (Wóycicki et al., 2011) Gy14 (North American) (phytozome.org) Kết giúp nhà nghiên cứu có nhìn rõ ràng khả thích nghi với điều kiện khí hậu khác dưa leo cung cấp nhiều thông tin gene dưa leo tính trạng liên quan Phiên xác gene dưa leo xây dựng (Yang et al., 2013) Cùng với đó, trình tự dịng dưa leo có liên quan chặt với xác định nhằm xác định gene chịu trách nhiệm cho khác biệt kiểu tính trạng quan trọng (Qi et al., 2013; Yang et al., 2013) 1.1.2 Dưa leo toàn hoa (Gynoecious) tầm quan trọng sản xuất hạt giống lai Tăng suất mục tiêu chính, cuối việc cải tiến giống dưa leo Tuy nhiên, suất tính trạng định lượng Năng suất qui định kiểu gen môi trường, phần tương tác nhỏ kiểu gen mơi trường Ngồi ra, suất có khả di truyền thấp Do đó, tăng suất cách trực tiếp lựa chọn tính trạng suất khó Để cải tiến giống hiệu cho tính trạng này, nhà chọn 14 giống thơng thường chọn tính trạng có khả di truyền cao tương quan tốt với tính trạng suất Những đặc điểm bao gồm tỷ lệ hoa cây, chiều dài thân, số cành cây, kích thước chiều dài Trong số đặc điểm này, tiềm tăng suất cách tăng số hoa chứng minh số nghiên cứu Dưa leo toàn hoa (Gynoecious) dưa leo có hoa Các dịng dưa leo tồn hoa ngày quan trọng sản xuất hạt giống lai Dưa leo toàn hoa cho lượng lớn hoa cái, hoa tập trung Hạt lai tạo từ dịng mẹ tồn hoa có khả đậu nhiều khoảng thời gian tương đối ngắn (Orzolek et al., 2010) Chúng (công ty trách nhiệm hữu hạn hạt giống Tân Lộc Phát) nhận thấy việc sử dụng dịng dưa leo tồn hoa lai tạo mang lại nhiều ý nghĩa to lớn Đầu tiên phải kể đến việc giảm giá thành sản xuất hạt giống lai F1, giảm giá thành sản phẩm từ tăng khả cạnh tranh giống mang đến cho người trồng hạt giống chất lượng mà giá lại phải Cụ thể, sử dụng dịng tồn hoa làm mẹ giảm đáng kể chi phí như: khơng sử dụng bao cách ly đực (giảm 4% chi phí), khơng tốn cơng lao động cho thụ phấn (giảm 51 % chi phí), hoa sớm nên rút ngắn thời gian sinhtrưởng giảm bớt áp lực sâu bệnh (giảm 6% thuốc BVTV), suất sản xuất hạt lai cao tỷ lệ nhiều (giảm 59% giá thành) Cụ thể so sánh chi phí sản suất hạt lai sử dụng dịng dưa leo tồn hoa dòng hoa đực nhiều hoa thể bảng bên ĐVT: triệu đồng Dạng mẹ Phân bón Tồn hoa Thuốc BVTV Vật tư khác Cơng lao động Tổng chi phí Giá thành để có 1kg hạt F1 32,8 11,2 28,2 150,3 221,4 1,10 Hoa đực nhiều 32,8 hoa 10,5 27,2 74,2 145,9 0,45 % Giảm 6% 4% 51% 34% 59% 0% 15 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | GTTCTACTATCTATTCATTCTCCTTTCAAAATCTTTCACATTTAGTCTTTGTTAAGTTTTCAATTTAATA GTTCTACTATCTATTCATTCTCCTTTCAAAATCTTTCACATTTAGTCTTTGTTAAGTTTTCAATTTAATA GTTCTACTATCTATTCATTCTCCTTTCAAAATCTTTCACATTTAGTCTTTGTTAAGTTTTCAATTTAATA GTTCTACTATCTATTCATTCTCCTTTCAAAATCTTTCACATTTACTCTTTGTTAAGTTTTCAATTTAATA GTTCTACTATCTATTCATTCTCCTTTCAAAATCTTTCACATTTACTCTTTGTTAAGTTTTCAATTTAATA 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | TGTAAGTGTTAAAATGTTACAATTTTATTTTTAATATTTGATAATTTGGTTAATAAATCTCAAGATTTTA TGTAAGTGTTAAAATGTTACAATTTTATTTTTAATATTTGATAATTTGGTTAATAAATCTCAAGATTTTA TGTAAGTGTTAAAATGTTACAATTTTATTTTTAATATTTGATAATTTGGTTAATAAATCTCAAGATTTTA TGTAAGTGTTAAAATGTTACAATTTTATTTTTAATATTTGCTAATTTGGTTAATAAATCTTAAGATTTTA TGTAAGTGTTAAAATGTTACAATTTTATTTTTAATATTTGCTAATTTGGTTAATAAATCTTAAGATTTTA 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | CATTTTAAATCTCAATTATTCATTAAATACTCACTTACAAATAAACATTGGTATTAATATTTACTAACTA CATTTTAAATCTCAATTATTCATTAAATACTCACTTACAAATAAACATTGGTATTAATATTTACTAACTA CATTTTAAATCTCAATTATTCATTAAATACTCACTTACAAATAAACATTGGTATTAATATTTACTAACTA CATTTTAAATCTCAATTATTCATTAAATACTCACTTACAAATAAACATTGGTATTAATATTTACTAAGTA CATTTTAAATCTCAATTATTCATTAAATACTCACTTACAAATAAACATTGGTATTAATATTTACTAAGTA 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | ATTAAAAATAATTATAAAGTGAAAGAATAGTTAATTTTAATTAATTATAAATTTGTTTAATTATTTTTAA ATTAAAAATAATTATAAAGTGAAAGAATAGTTAATTTTAATTAATTATAAATTTGTTTAATTATTTTTAA ATTAAAAATAATTATAAAGTGAAAGAATAGTTAATTTTAATTAATTATAAATTTGTTTAATTATTTTTAA ATTAAAAATAATTATAAAGTGAAAGAATAGTTAAGTTTAATTAATTATAAATTTGTTTAATTATTTTTAA ATTAAAAATAATTATAAAGTGAAAGAATAGTTAAGTTTAATTAATTATAAATTTGTTTAATTATTTTTAA 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 430 440 450 460 470 480 490 | | | | | | | | | | | | | | TACATTGTGTGAATGAAGACAAGAAAATAAGTACTTAACAAAAAAGATTGAAATTAAGATGTAAATA TACATTGTGTGAATGAAGACAAGAAAATAAGTACTTAACAAAAAAGATTGAAATTAAGATGTAAATA TACATTGTGTGAATGAAGACAAGAAAATAAGTACTTAACAAAAAAGATTGAAATTAAGATGTAAATA TACATTGTGTGAATGAAGACAAGAAAATAAGTACTTAACAAAAAAGATTGAAATTAAGATGTAAATATTG TACATTGTGTGAATGAAGACAAGAAAATAAGTACTTAACAAAAAAGATTGAAATTAAGATGTAAATATTG 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | -GAAACTGAATTAAAA -GAAACTGAATTAAAA -GAAACTGAATTAAAA AAATCGAAACAGAAAAATAAATGTTAATAGTAAATTTTTAATATTTTAAAACCTAAAAACTGAATTAAAA AAATCGAAACAGAAAAATAAATGTTAATAGTAAATTTTTAATATTTTAAAACCTAAAAACTGAATTAAAA 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | TTAAACTTAAAAATTTTAAAAGTCGTGAATTAAATAGAAACTAGATTCAAAATTAAAAAGATGAAGGTTT TTAAACTTAAAAATTTTAAAAGTCGTGAATTAAATAGAAACTAGATTCAAAATTAAAAAGATGAAGGTTT TTAAACTTAAAAATTTTAAAAGTCGTGAATTAAATAGAAACTAGATTCAAAATTAAAAAGATGAAGGTTT TTAAACTTAAAAATTTTAAAAGTCGTGAATTAAATAGAAACTAGATTCAAAATTAAAAAGATGAAGGTTT TTAAACTTAAAAATTTTAAAAGTCGTGAATTAAATAGAAACTAGATTCAAAATTAAAAAGATGAAGGTTT 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | TGCGTTGAAGTATAATTTTTTT-GTATAATTATTAAATTTTAAAATCATATAATTTATAATATTATAATA TGCGTTGAAGTATAATTTTTTT-GTATAATTATTAAATTTTAAAATCATATAATTTATAATATTATAATA TGCGTTGAAGTATAATTTTTTT-GTATAATTATTAAATTTTAAAATCATATAATTTATAATATTATAATA TGCGTTGAAGTATAATTTTTTTTGTATAATTATTAAATTTTAAAATCATATAATTTATAATATTATAATA 42 14.6-F TGCGTTGAAGTATAATTTTTTTTGTATAATTATTAAATTTTAAAATCATATAATTTATAATATTATAATA 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 710 720 730 740 750 760 770 | | | | | | | | | | | | | | CAAGTTTATACCATGAAATACTATAACAAAATCCGGACTATCTACCACCTACCAAATACATATTGTTAGC CAAGTTTATACCATGAAATACTATAACAAAATCCGGACTATCTACCACCTACCAAATACATATTGTTAGC CAAGTTTATACCATGAAATACTATAACAAAATCCGGACTATCTACCACCTACCAAATACATATTGTTAGC CAAGTTTATACCATGAAATACTATAACAAAATCCGGACTATCTACCACCTACCAAATACATATTGTTAGC CAAGTTTATACCATGAAATACTATAACAAAATCCGGACTATCTACCACCTACCAAATACATATTGTTAGC 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 780 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | | | TGCATATTTGAACGAGTTTTAGAGGAAAAAAAAAAACTTTTCTTGGGGAAAGTAAAAGGGGGTCCCAGAT TGCATATTTGAACGAGGTTT -TGCATATTTGAACGAGGTTT -TGCATATTTGAACGAGGTT TGCATATTTGAACGAGGGTTTTTAGGAAAAAGAGAAA - 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 850 860 870 880 890 900 910 | | | | | | | | | | | | | | TTTAATTTAAAATGGTTTGGCAAAGAAGATGACCCGCGAGAATTAATTCACTTTAACAATTTATTCAGTT - 11.6-F 10.6-F 9.6-F 4.6-F 14.6-F 920 930 940 | | | | | | ATCAAAAAAAAATTTATCATATTTGTCCAT - Hình Thơng tin giải trình tự với cặp mồi BCAT-S dịng tồn hoa (9.6; 10.6; 11.6) dịng có hoa đực hoa (4.6 14.6) Màu xanh dương: vị trí bắt cặp mồi xi Màu xanh lá: vị trí bắt cặp mồi ngược Màu vàng: nucleotide đa hình dịng tồn hoa Màu xám: nucleotide đa hình dịng có hoa đực Hình cho thấy dịng tồn hoa xảy đột biến đoạn dài 56bp vị trí mồi Cs-BCAT qua Đồng thời marker nhận diện dạng dị hợp mang tính trạng tồn hoa 3.3.3 Thử nghiêm marker dòng Một marker sử dụng hỗ trợ chọn tạo giống phải có tính liên kết chặt với gene/tính trạng mục tiêu (để đảm bảo nhận diện xác gene mục tiêu) Vì vậy, thí nghiệm nay, chúng tơi tiến hành khảo sát marker bảng DNA dòng biết 43 rõ kiểu hình bao gồm: dịng tồn hoa dịng có hoa đực hoa nhằm giúp nhận diện marker nhận diện xác dịng khảo sát, đồng thời giúp xác định marker số marker khảo sát có khả phân biệt tốt dịng tồn hoa với dịng có hoa đực hoa Các điều kiện trình tách chiết DNA chu trình nhiệt phản ứng PCR, thành phần phản ứng PCR, thực theo phản ứng tối ưu hóa thí nghiệm Theo đánh giá trước Khin Thinda Win cộng marker Cs-BCAT nằm vùng liên kết gần với locus F (0.3cM) Vì chúng tơi tiến hành phân tích marker 150 cá thể thuộc 15 dòng 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 M 3.1 3.2 3.3 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 M 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 M Hình 10 Kết phân tích sản phẩm PCR với mồi Cs-BCAT gel agarose 1%, (thang 100bp) Quy trình tối ưu hóa với marker Cs-BCAT áp dụng 150 cá thể thuộc 15 dịng Từ hình 10, chúng tơi nhận 111 dưa leo toàn hoa cho băng đồng hợp kích thước 160bp 39 có hoa đực hoa cho băng đồng hợp kích thước 216 bp Trong dịng cho băng kích thước giống nên tiến hành chọn dòng để chọn làm kiểu gene tiêu biểu, ngoại trừ dòng số xuất băng dị hợp, chứng tỏ dòng chưa nên loại khỏi nghiên cứu 44 Khi so sánh với kiểu hình (bảng 7), tỷ lệ sai khác so với kiểu hình 42.86% (4/14), tức tỷ lệ nhận diện xác 57.14% (8/14) Tỷ lệ có chút khác biệt so với nghiên cứu trước Khin Thinda Win đưa với độ nhận diện xác marker lên tới 90% Ngoài ra, so sánh xa có tỷ lệ hoa đực/cái khác với kiểu gene phân tích với marker CS-BCAT, chúng tơi nhận thấy rằng, marker CSBCAT có khả xác định dòng dưa leo trạng thái dị hợp dịng có hoa đực hoa (dòng 2.1; 2.3 2.5) Với mục tiêu chọn lọc marker có khả phân biệt xác tồn hoa có hoa đực hoa cái, tiến hành khảo sát thêm số marker thuộc dạng In/Del nằm vùng liên kết với locus F: Cs-Female1, Cs-Female4 15 dòng Đồng thời từ kết phân tích marker Cs-BCAT 150 cá thể, nhận thấy cá thể cho kiểu gene tượng tự Vì thí nghiệm khảo sát marker tiếp theo, khảo sát 14 cá thể thuộc 14 dòng khác (trừ dòng số 2) Khảo sát marker Cs-Female 1, cho kết sau: 1 3 44 55 66 77 8M M 9101011 1112 1213 1314 14 15 15 200bp 100bp Hình 11 Kết phân tích sản phẩm PCR với mồi Cs-Female1 gel agarose 2%, thang 100bp Kích thước 197/163 (allele hoa cái/hoa đực) Theo kết nghiên cứu trước, marker Cs-Female cho băng đồng hợp tồn hoa kích thước 163 bp băng đồng hợp có hoa đực hoa kích thước 197bp Từ hình 11, chúng tơi nhận thấy kích thước băng hồn tồn trùng khớp với nghiên cứu trước Đối với marker Cs-Female1 nhận diên 11 tồn hoa có hoa đực hoa Tỷ lệ xác so với kiểu hình 8/14 (57.14%) Trong marker có khả nhận diện xác dịng toàn hoa cái, nhiên lại nhầm lẫn có tỷ lệ đực khác thành toàn hoa M 10 11 12 13 14 15 45 M 10 11 12 13 14 15 200bp 100bp Hình 12 Kết phân tích sản phẩm PCR với mồi Cs-Female gel agarose 2.5%, thang 100bp Kích thước 204/222 (allele hoa cái/ hoa đực) Marker Cs-Female cho băng đồng hợp tồn hoa kích thước 220bp băng đồng hợp có hoa đực hoa kích thước 204 bp Sự sai khác băng với tỷ lệ kích thước tương đối nhỏ tiến hành tăng tỷ lệ gel agarose lên 2.5% phân tách thời gian điện di 90V 120 phút Kết khảo sát cho thấy 14 dòng (trừ dòng số 2), marker Cs-Female4 nhận diện toàn hoa có hoa đực hoa Tỷ lệ xác marker so với kiểu hình 3/15 (21.42%) (bảng 7) Ngồi dịng tồn hoa marker nhận diện sai thành dịng có hoa đực hoa 3.3.4 Mối tương quan marker phân tử kiểu hình dòng Khảo sát marker Cs-BCAT, Cs-Female 1, Cs-Female 4, 15 dòng cho thấy, marker Cs-BCAT cho băng đa hình phân biệt rõ với kích thước chênh lệch dịng tồn hoa dịng có hoa đực hoa 56bp so với marker khác Cs-Female (34bp), Cs-Female (18bp) Đồng thời marker Cs-BCAT có khả nhận diện xác dịng tồn hoa Với mục tiêu chọn marker có khả nhận diện xác, phân biệt dạng đồng hợp dị hợp tồn hoa chi phí phân tích thấp để dễ dàng áp dụng cho công tác chọn tạo giống dưa leo tồn hoa Chúng tơi tiến hành chọn xác nhận marker Cs-BCAT marker lý tưởng cho việc chọn lọc tính trạng tồn hoa 46 Bảng Kết khảo sát marker kiểu hình STT Kiểu hình Cs-BCAT Cs-Female1 Cs-Female4 + + Có hoa đực + Có hoa đực +/- Có hoa đực - - + Có hoa đực - - - Có hoa đực + + + Có hoa đực + + + Toàn hoa + + - Toàn hoa + + - Toàn hoa + + - 10 Toàn hoa + + - 11 Toàn hoa + + - 12 Có hoa đực + + + 13 Có hoa đực + + + 14 Có hoa đực - - - 15 Có hoa đực + + - + 3.3.5 Khả nhận diện dịng dưa leo tồn hoa marker CsBCAT hệ F2 Tỷ lệ nhận diện marker CsBCAT dòng (57%) thấp nhiều so với công bố Win cộng (90%) (Win et al., 2015) Tuy nhiên, khảo sát Win cộng thực mẫu thuộc hệ F2 Vì vậy, thí nghiệm tiếp theo, tiến hành khảo sát độ đặc hiệu marker CsBCAT 50 mẫu thuộc hệ F2 cung cấp công ty Tân Lộc Phát Kết điện di sản phẩm PCR độ đặc hiệu marker CsBCAT 50 mẫu F2 trình bày hình 13 bảng 47 Hình 13 Kết điện di sản phẩm PCR với marker CsBCAT 50 mẫu dưa leo F2 Thang chuẩn 100 bp Bảng Độ đặc hiệu marker CsBCAT 50 mẫu dưa leo F2 STT Mẫu F2 Kiểu hình Marker CsBCAT Độ xác 1.92 Hoa > hoa đực Ff + 1.94 Toàn hoa FF + 1.95 Hoa đực > hoa ff + 1.96 Hoa đực > hoa Ff - 1.97 Hoa đực > hoa Ff - 1.98 Toàn hoa FF + 1.99 Hoa đực > hoa Ff - 1.100 Toàn hoa FF + 1.101 Toàn hoa FF + 10 1.102 Hoa đực > hoa Ff - 11 1.103 Hoa đực > hoa Ff - 12 1.104 Toàn hoa FF + 13 1.105 Hoa đực > hoa ff + 14 1.106 Hoa đực > hoa ff + 15 1.107 Toàn hoa FF + 16 1.108 Hoa đực > hoa Ff - 17 1.109 Hoa đực > hoa Ff 48 STT Mẫu F2 Kiểu hình Marker CsBCAT Độ xác 18 1.110 Hoa đực > hoa Ff - 19 1.113 Hoa đực > hoa Ff - 20 1.114 Hoa đực > hoa ff + 21 1.115 Hoa đực > hoa ff + 22 1.116 Hoa đực > hoa Ff - 23 1.117 Hoa đực > hoa Ff - 24 1.118 Toàn hoa FF + 25 1.119 Hoa đực > hoa ff + 26 1.122 Toàn hoa FF + 27 1.123 Toàn hoa FF + 28 1.124 Hoa đực > hoa ff + 29 1.125 Hoa đực > hoa Ff - 30 1.126 Hoa đực > hoa ff + 31 1.127 Hoa đực > hoa ff + 32 1.129 Hoa > hoa đực FF - 33 1.130 Toàn hoa FF + 34 1.131 Hoa đực > hoa Ff - 35 1.132 Hoa đực > hoa ff + 36 1.133 Hoa đực > hoa FF - 37 1.134 Hoa đực > hoa ff + 38 1.135 Hoa đực > hoa Ff - 39 1.136 Hoa đực > hoa ff + 40 1.137 Hoa đực > hoa Ff - 41 1.138 Hoa đực > hoa Ff - 42 1.140 Toàn hoa FF + 43 1.141 Hoa đực > hoa ff + 44 1.142 Hoa đực > hoa FF - 45 1.143 Hoa > hoa đực Ff + 46 1.144 Hoa đực > hoa Ff - 47 1.145 Hoa đực > hoa ff + 48 1.146 Hoa đực > hoa Ff 49 STT Mẫu F2 Kiểu hình Marker CsBCAT Độ xác 49 1.147 Tồn hoa FF + 50 1.148 Hoa đực > hoa Ff - (+): nhận diện đúng, (-): nhận diện sai Từ bảng cho thấy: 100% mẫu ff (14/14) với kiểu hình hoa đực nhiều hoa cái; 10% mẫu Ff (2/21) với kiểu hình hoa nhiều hoa đực; 80% mẫu FF (12/15) với kiểu hình tồn hoa Như vậy, tỷ lệ nhận diện marker CsBCAT dịng tồn hoa hệ phân ly F2 cao so với dòng Trong tất mẫu F2 nhận diện kiểu gen Ff ff, mẫu có kiểu hình tồn hoa Kết quan trọng sàng lọc số lượng lớn mẫu hệ phân ly F2 giai đoạn sớm vườn ươm Tất mẫu nhận diện kiểu gen Ff ff bị loại bỏ, giúp tiết kiệm không gian nhà lưới không lo xảy trường hợp bỏ sót dịng tồn hoa Các dòng nhận diện kiểu gen FF chuyển sang trồng nhà lưới để chọn lọc tiếp với tỷ lệ toàn hoa ~80% Như vậy, marker CsBCAT có tiềm sử dụng để nhận diện sớm dịng dưa leo tồn hoa Việc loại bỏ dịng khơng phải tồn hoa giúp giảm chi phí cơng lao động chăm sóc chi phí nhà lưới cho q trình chọn giống 50 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận Tách chiết thành công DNA từ non dưa leo Tối ưu hóa quy trình tách chiết, giảm 1/2 lượng Plant DNAzol sử dụng, giúp tiết kiệm chi phí cho nghiên cứu Xây dựng quy trình PCR sử dụng marker Female 1, Female 4, BCAT để xác định kiểu gene dưa leo Kết giải trình tự cho thấy marker CsCBAT bắt đặc hiệu vào vùng trình tự có chứa đột biến đoạn 58 bp gen CsBCAT Tỉ lệ tương quan kiểu gene kiểu hình giới tính hoa dưa leo dòng cho marker BCAT (11/15, Female (11/15), Female (7/15) Nhận diện dịng dưa leo tồn hoa giống công ty TNHH Hạt giống Tân Lộc Phát marker phân tử CsBCAT, với tỷ lệ nhận diện 80% hệ phân ly F2 4.2 Kiến nghị Tiếp tục thực giai đoạn hai đề tài, khảo sát marker CsBCAT số mẫu lớn Khảo sát thêm độ đặc hiệu marker phân tử khác, sử dụng phối hợp nhiều marker khác nhằm tăng tỷ lệ nhận diện dòng dưa leo toàn hoa 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Boualem A., S Fleurier, C Troadec, P Audigier, A.P Kumar, M Chatterjee, A.A Alsadon, M.T Sadder, M.A Wahb-Allah, and A.A Al-Doss, 2014 Development of a Cucumis sativus TILLinG platform for forward and reverse genetics PLoS One, 9: e97963 Boualem A., C Troadec, C Camps, A Lemhemdi, H Morin, M.-A Sari, R FraenkelZagouri, I Kovalski, C Dogimont, and R Perl-Treves, 2015 A cucurbit androecy gene reveals how unisexual flowers develop and dioecy emerges Science, 350: 688691 Boualem A., C Troadec, I Kovalski, M.-A Sari, R Perl-Treves, and A Bendahmane, 2009 A conserved ethylene biosynthesis enzyme leads to andromonoecy in two Cucumis species PLoS One, 4: e6144 Collard B.C., and D.J Mackill, 2008 Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 363: 557-572 Cương T.K., 2016 Nghiên cứu ứng dụng thị RAPD chọn tạo giống dưa leo Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học KHoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Delannay I.Y., and J.E Staub, 2010 Use of molecular markers aids in the development of diverse inbred backcross lines in Beit Alpha cucumber (Cucumis sativus L.) Euphytica, 175: 65-78 Galun E., 1962 Study of the inheritance of sex expression in the cucumber The interaction of major genes with modifying genetic and non-genetic factors Genetica, 32: 134163 Hạnh N.T., V.Đ Hòa, N.T.P Thảo, N.T Huệ, N.T Thủy, and P.T.T Hằng, 2011 QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CÁC GIỐNG DƯA CHUỘT, CÁC DÒNG TỰ PHỐI ĐƯỢC PHÂN LẬP VÀ ƯU THẾ LAI Tạp chí Khoa học Phát triển, TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI 53 Huang S., R Li, Z Zhang, L Li, X Gu, W Fan, W.J Lucas, X Wang, B Xie, and P Ni, 2009 The genome of the cucumber, Cucumis sativus L Nature genetics, 41: 12751281 Jat G.S., A.D Munshi, T.K Behera, H Choudhary, P Dash, A Ravindran, and S Kumari, 2019 Genetics and molecular mapping of gynoecious (F) locus in cucumber (Cucumis sativus L.) The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 94: 24-32 Knopf R.R., and T Trebitsh, 2006 The female-specific Cs-ACS1G gene of cucumber A case of gene duplication and recombination between the non-sex-specific 1aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene and a branched-chain amino acid transaminase gene Plant Cell Physiol, 47: 1217-1228 Kumar S., R Kumar, D Kumar, N Gautam, R Dogra, D Mehta, H.D Sharma, and S Kansal, 2016 Parthenocarpic gynoecious parental lines of cucumber introduced from Netherlands for developing high-yielding, quality hybrids Journal of Crop Improvement, 30: 352-369 Leppik E., 1966 Searching gene centers of the genus Cucumis through host-parasite relationship Euphytica, 15: 323-328 Li Z., S Huang, S Liu, J Pan, Z Zhang, Q Tao, Q Shi, Z Jia, W Zhang, and H Chen, 2009 Molecular isolation of the M gene suggests that a conserved-residue conversion induces the formation of bisexual flowers in cucumber plants Genetics, 182: 13811385 Mibus H., and T Tatlioglu, 2004 Molecular characterization and isolation of the F/f gene for femaleness in cucumber (Cucumis sativus L.) Theoretical and Applied Genetics, 109: 1669-1676 Muruganantham N., S Solomon, and M Senthamilselvi, 2016 Anti-cancer activity of Cucumis sativus (cucumber) flowers against human liver cancer International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 8: 39-41 Orzolek M., L Kima, S Bogash, and J Harper, 2010 Agricultural alternative: cucumber production Agricultural Research and Cooperation Extension Bulletin, Pennsylvania State University, UA463 54 Qi J., X Liu, D Shen, H Miao, B Xie, X Li, P Zeng, S Wang, Y Shang, X Gu, Y Du, Y Li, T Lin, J Yuan, X Yang, J Chen, H Chen, X Xiong, K Huang, Z Fei, L Mao, L Tian, T Städler, S.S Renner, S Kamoun, W.J Lucas, Z Zhang, and S Huang, 2013 A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity Nature Genetics, 45: 1510 Rahman A., M Anisuzzaman, F Ahmed, A Islam, and A Naderuzzaman, 2008 Study of nutritive value and medicinal uses of cultivated cucurbits Journal of applied sciences research, 4: 555-558 Tatlioglu T., 1993 13 - Cucumber: Cucumis sativus L In: Kalloo, G., Bergh, B.O (Eds.), Genetic Improvement of Vegetable Crops Pergamon, Amsterdam, pp 197-234 Thi N.K., 2011 Nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép (dưa chuột, ớt) phục vụ chọn tạo giống ưu lai Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ giai đoạn 2007-2010, Viện nghiên cứu rau Trebitsh T., J.E Staub, and S.D O'Neill, 1997 Identification of a 1-aminocyclopropane1-carboxylic acid synthase gene linked to the female (F) locus that enhances female sex expression in cucumber Plant Physiol, 113: 987-995 Weng Y., 2016 The cucumber genome Genetics and Genomics of Cucurbitaceae Springer, pp 183-197 Win K.T., C Zhang, K Song, J.H Lee, and S Lee, 2015 Development and characterization of a co-dominant molecular marker via sequence analysis of a genomic region containing the Female (F) locus in cucumber (Cucumis sativus L.) Mol Breeding, 35: 229 Wóycicki R., J Witkowicz, P Gawroński, J Dąbrowska, A Lomsadze, M Pawełkowicz, E Siedlecka, K Yagi, W Pląder, and A Seroczyńska, 2011 The genome sequence of the North-European cucumber (Cucumis sativus L.) unravels evolutionary adaptation mechanisms in plants PloS one, 6: e22728 Wyenandt C.A., W.L Kline, and D.L Ward, 2017 Effect of fungicide program on the development of downy mildew in three cucurbit crops in New Jersey Plant health progress, 18: 181-185 55 Yang L., D Li, Y Li, X Gu, S Huang, J Garcia-Mas, and Y Weng, 2013 A 1,681-locus consensus genetic map of cultivated cucumber including 67 NB-LRR resistance gene homolog and ten gene loci BMC Plant Biology, 13: 53 Zhang Z., L Mao, H Chen, F Bu, G Li, J Sun, S Li, H Sun, C Jiao, and R Blakely, 2015 Genome-wide mapping of structural variations reveals a copy number variant that determines reproductive morphology in cucumber The Plant Cell, tpc 114.135848 56 ... - - + Có hoa đực - - - Có hoa đực + + + Có hoa đực + + + Toàn hoa + + - Toàn hoa + + - Toàn hoa + + - 10 Toàn hoa + + - 11 Toàn hoa + + - 12 Có hoa đực + + + 13 Có hoa đực + + + 14 Có hoa đực... ff + 1.96 Hoa đực > hoa Ff - 1.97 Hoa đực > hoa Ff - 1.98 Toàn hoa FF + 1.99 Hoa đực > hoa Ff - 1.100 Toàn hoa FF + 1.101 Toàn hoa FF + 10 1.102 Hoa đực > hoa Ff - 11 1.103 Hoa đực > hoa Ff -... ứng dụng phổ biến chọn tạo giống lúa Việt Nam Nhưng rau cụ thể dưa leo việc ứng dụng thị phân tử hỗ trợ chọn tạo giống nhiều hạn chế Hiện nước ứng dụng thị phân tử phân nhóm đa dạng di truyền dưa