Các hướng dẫn ACR trong sàng lọc, điều trị và quản lư viêm thận do lupus được công bố gần đây khuyến cáo sử dụng xét nghiệm kháng thể kháng dsDNA để theo dơi viêm thận do lupus, định [r]
(1)QUY TRÌNH
N.520(TT21) ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG CHUỖI KÉP (ANA & DsDNA)
KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN (ANA) I NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm dựa phản ứng miễn dịch gắn enzyme gián bước sau: Các kháng thể có mặt mẫu dương tính gắn với kháng nguyên phủ bề mặt hai giếng phản ứng, hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể Sau ủ, bước rửa loại bỏ phân tử không gắn gắn không đặc hiệu Tiếp đó, chất cộng hợp enzyme bổ sung gắn với phức hợp kháng nguyên - kháng thể cố định Sau ủ, bước rửa thứ hai loại bỏ chất cộng hợp không gắn Cơ chất enzyme tiếp tục thêm vào giếng, trình thủy phân tạo màu diễn thời gian ủ Cường độ màu xanh dương tạo tỉ lệ thuận với nồng độ phức hợp kháng nguyên-kháng thể đo phương pháp quang học bước sóng 650 nm
II CHUẨN BỊ
1 Cán thực hiện: 01 Bác sĩ 01 cán đại học 01 kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa sinh
2. Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện xét nghiệm: máy xét nghiệm miễn dịch Alegria- hãng ORGENTEC/ Germany Hóa chất xét nghiệm gồm xét nghiệm phát ANA Bộ xét nghiệm phát ANA sau:
Thanh thử Alegria gồm giếng chứa thành phần sau:
Giếng 1+ Giếng trống (để pha loãng mẫu) Giếng 3+ Phủ kháng nguyên (giếng phản ứng) Giếng Mẫu chứng, màu vàng, chứa kháng thể
đặc hiệu, PBS, BSA (Albumin huyết bò), chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% ProClin 300 0,05%
(2)Giếng Dung dịch pha loãng mẫu, màu vàng, chứa PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% ProClin 300 0,05%
Giếng Cơ chất TMB, suốt, chứa 3,3’, 5,5’- Tetramethylbenzidin
Các kháng nguyên SS-A (52 60 kDa), SS-B, RNP-70, Sm, RNP/Sm, Scl-70, centromere B Jo-1 (đã tinh sạch) phủ sẵn vi giếng
Mã hóa sản phẩm: ANAScreen - Ngồi cịn dung dịch thống như:
+ Wash (1x20mL): Dung dịch rửa, chứa TRIS, detergent, chất bảo quản natri azide 0,09% (50x)
+ System fluid (1x2,5mL): Dung dịch hệ thống chứa acid (1000x)
- Bộ xét nghiệm cần bảo quản bóng tối điều kiện 2-8°C Khơng để hóa chất tiếp xúc với nhiệt, mặt trời ánh sáng mạnh suốt trình bảo quản sử dụng
Dụng cụ khác: + Máy Vortex; Pipet 10 μL; + Ống đong thể tích 1000 mL 2500 mL + Nước cất nước khử ion
3 Người bệnh: Người bệnh giải thích tư vấn trước thực XN, tốt nhịn ăn sáng lấy máu vào buổi sáng
4 Phiếu xét nghiệm: có đầy đủ thơng tin bệnh nhân bao gồm họ tên, tuổi, khoa phịng, chẩn đốn, tình trạng mẫu, tên BS định, ngày định, ngày lấy mẫu, loại thuốc sử dụng (nếu có)…
III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy mẫu bệnh phẩm xử lý mẫu:
Bệnh phẩm phải lấy kỹ thuật vào ống xét nghiệm tiêu chuẩn Sử dụng ống không chống đông (ống serum) sử dụng ống có chất chống đơng Li-Heparine, EDTA
(3)- Bảo quản bệnh phẩm Huyết huyết tương: Mẫu ổn định 2-8°C vòng ngày -20°C vòng tháng Chỉ đông lạnh lần
Bảo quản chất chuẩn, QC sau hoàn nguyên nhiệt độ -20°C, tiến hành chạy phải để nhiệt độ phịng (20- 25°C) rã đơng hồn toàn lắc trước tiến hành xét nghiệm
2 Tiến hành kỹ thuật
Máy xét nghiệm, hóa chất chuẩn trước thực phân tích Việc chuẩn xét nghiệm Anti-ANA ổn định vòng 28 ngày cần thực hiệu chuẩn thay đổi lơ hóa chất Kiểm tra chất lượng nằm giới hạn cho phép Thông thường chạy nội kiểm (QC) mức ngày: mức bình thường khơng bình thường Đối chiếu với luật kiểm tra chất lượng đạt tiến hành phân tích mẫu
Định kỳ: Chuẩn lại chạy mức QC sau thay lô thuốc thử sau bảo dưỡng, sửa chữa máy cố, thay trang thiết bị phân tích quan trọng Ghi lại kết vào bảng theo dõi kết chuẩn máy xét nghiệm
Đưa bệnh phẩm vào phân tích theo protocol máy Khi có kết phân tích đối chiếu với phiếu xét nghiệm, trả, lưu kết vào hệ thống mạng, in phiếu kết xét nghiệm trả kết cho người bệnh thời gian quy định
IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ 1. Giá trị tham chiếu:
Bình thường: Âm tính: Index < 1,0 Nghi ngờ: Index 1,0 – 1,2
Dương tính: Index > 1,2
Các phạm vi tham chiếu giới hạn bệnh lư giới hạn b́nh thường kháng thể có mẫu bệnh phẩm có giá trị khuyến cáo Mỗi pḥng xét nghiệm nên tự thiết lập phạm vi riêng dựa theo ISO 15189 hướng dẫn khác áp dụng pḥng thí nghiệm
3. Ý nghĩa lâm sàng
- Các bệnh mơ liên kết (CTD) nhóm bệnh tự miễn, đặc trưng xuất kháng thể kháng nhân (ANA) máu bệnh nhân ANA lớp tự kháng thể đặc hiệu, có khả gắn phá hủy cấu trúc định bên nhân tế bào Các kháng thể liên quan tới chế bệnh sinh, đồng thời đóng vai trị sở chẩn đoán điều trị CTD ANA phân thành nhóm chính:
- Tự kháng thể kháng DNA histone
(4)- Tự kháng thể kháng DNA histone bao gồm kháng thể kháng DNA sợi đơn DNA sợi đôi (ssDNA dsDNA) Sự gia tăng đáng kể nồng độ kháng thể kháng dsDNA có giá trị xác nhận chẩn đoán Lupus ban đỏ hệ thống (SLE) Kháng thể kháng histone điểm cho lupus thuốc Các kháng thể kháng dsDNA, histone, protein có trọng lượng phân tử 70kD phức hợp U1-snRNP (RNP70) Sm có liên quan mật thiết tới bệnh SLE
- Xét nghiệm dùng cho mục đích hỗ trợ chẩn đốn Chẩn đốn lâm sàng xác định khơng nên dựa vào kết xét nghiệm đơn lẻ, mà nên định bác sĩ sau có tất kết thăm khám lâm sàng xét nghiệm liên quan đến toàn t́nh trạng bệnh nhân Ngoài ra, phác đồ điều trị nên áp dụng riêng cho bệnh nhân cụ thể
V NHỮNG SAI SĨT VÀ XỬ TRÍ
(5)ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG CHUỖI KÉP (DsDNA) I NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm dựa phản ứng miễn dịch gắn enzyme gián bước sau: Các kháng thể có mặt mẫu dương tính gắn với kháng nguyên phủ bề mặt hai giếng phản ứng, hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể Sau ủ, bước rửa loại bỏ phân tử không gắn gắn không đặc hiệu Tiếp đó, chất cộng hợp enzyme bổ sung gắn với phức hợp kháng nguyên - kháng thể cố định Sau ủ, bước rửa thứ hai loại bỏ chất cộng hợp không gắn Cơ chất enzyme tiếp tục thêm vào giếng, trình thủy phân tạo màu diễn thời gian ủ Cường độ màu xanh dương tạo tỉ lệ thuận với nồng độ phức hợp kháng nguyên- kháng thể đo phương pháp quang học bước sóng 650 nm hệ thống xét nghiệm miễn dịch ELISA (Enzymelinked immunosorbant assay)
II CHUẨN BỊ
1. Cán thực hiện:
bác sĩ 01 cán đại học 01 kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa sinh 2 Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện xét nghiệm: máy xét nghiệm miễn dịch Alegria- hãng ORGENTEC/ Germany Thuốc thử sẵn sàng sử dụng:
Bộ xét nghiệm phát dsDNA sau:
Thanh thử Alegria gồm giếng chứa thành phần sau:
Giếng +
Giếng trống khơng phủ (để pha lỗng mẫu)
Giếng +
Được phủ kháng nguyên (giếng phản ứng)
(6)Giếng Chất cộng hợp enzyme, màu đỏ nhạt, chứa kháng thể kháng IgG người gắn HRP; PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản ProClin 300 0,05%
Giếng Dung dịch pha loãng mẫu, màu vàng, chứa PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% ProClin 300 0,05%
Giếng Cơ chất TMB, suốt, chứa 3,3’, 5,5’- Tetramethylbenzidin
DNA sợi kép tái tổ hợp (dsDNA, người) phủ sẵn vi giếng
Mã sản phẩm mã vạch: dsDNA Screen
- Ngồi cịn dung dịch thống như:
+ Wash (1x20mL): Dung dịch rửa, chứa TRIS, detergent, chất bảo quản natri azide 0,09% (50x)
+ System fluid (1x2,5mL): Dung dịch hệ thống chứa acid (1000x)
- Bộ xét nghiệm cần bảo quản bóng tối điều kiện 2-8°C Khơng để hóa chất tiếp xúc với nhiệt, mặt trời ánh sáng mạnh suốt trình bảo quản sử dụng Bảo quản thử Alegria (đậy kín khơ ráo) túi có khóa cung cấp Dung dịch Wash Buffer System Fluid sau pha loãng ổn định tối thiểu 30 ngày bảo quản 2-8°C
Dụng cụ khác: + Máy Vortex; Pipet 10 μL; + Ống đong thể tích 1000 mL 2500 mL + Nước cất nước khử ion
3 Người bệnh: Người bệnh giải thích tư vấn trước thực XN, tốt nhịn ăn sáng lấy máu vào buổi sáng
4 Phiếu xét nghiệm: có đầy đủ thơng tin bệnh nhân bao gồm họ tên, tuổi, khoa phòng, chẩn đốn, tình trạng mẫu, tên BS định, ngày định, ngày lấy mẫu, loại thuốc sử dụng (nếu có)…
(7)1 Lấy mẫu bệnh phẩm xử lý mẫu:
Bệnh phẩm phải lấy kỹ thuật vào ống xét nghiệm tiêu chuẩn Sử dụng ống không chống đông (ống serum) sử dụng ống có chất chống đơng Li-Heparine, EDTA
- Bệnh phẩm nhận từ khoa lâm sàng phận lấy mẫu phòng khám Nhân viên nhận mẫu lấy thông tin bệnh nhân từ phần mềm quản lý Bệnh viện, in dán barcode vào ống bệnh phẩm, sau cho ly tâm 4000 vòng phút trước tiến hành kỹ thuật
Bảo quản bệnh phẩm Huyết huyết tương: Mẫu ổn định 15‑25°C, ngày 2‑8°C, 28 ngày ‑20°C Chỉ đông lạnh lần
Bảo quản chất chuẩn, QC sau hoàn nguyên nhiệt độ -20°C, tiến hành chạy phải để nhiệt độ phòng (20- 25°C) rã đơng hồn tồn lắc trước tiến hành xét nghiệm
2 Tiến hành kỹ thuật
Máy xét nghiệm, hóa chất chuẩn trước thực phân tích Việc chuẩn xét nghiệm Anti- dsDNA ổn định vòng 28 ngày cần thực hiệu chuẩn thay đổi lơ hóa chất Kiểm tra chất lượng nằm giới hạn cho phép Thông thường chạy nội kiểm (QC) mức ngày: mức bình thường khơng bình thường Đối chiếu với luật kiểm tra chất lượng đạt tiến hành phân tích mẫu
Định kỳ: Chuẩn lại chạy mức QC sau thay lô thuốc thử sau bảo dưỡng, sửa chữa máy cố, thay trang thiết bị phân tích quan trọng Ghi lại kết vào bảng theo dõi kết chuẩn máy xét nghiệm
Đưa bệnh phẩm vào phân tích theo protocol máy Khi có kết phân tích đối chiếu với phiếu xét nghiệm, trả, lưu kết vào hệ thống mạng, in phiếu kết xét nghiệm trả kết cho người bệnh thời gian quy định
IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1 Giá trị tham chiếu: Bình thường Anti- dsDNA < 25 U/mL 2 Ý nghĩa lâm sàng:
(8)rất quan trọng thực hành lâm sàng nghiên cứu chuyên ngành dị ứng miễn dịch lâm sàng
Các tự kháng thể kháng dsDNA có tính đặc hiệu dùng chẩn đốn bệnh lupus ban đỏ hệ thống (SLE), nồng độ tự kháng thể tăng lên tŕnh tiến triển bệnh Các hướng dẫn ACR sàng lọc, điều trị quản lư viêm thận lupus công bố gần khuyến cáo sử dụng xét nghiệm kháng thể kháng dsDNA để theo dơi viêm thận lupus, định kỳ hàng tháng bệnh nhân mang thai bị viêm tiểu cầu thận điều trị, định kỳ tháng bệnh nhân viêm thận tiến triển điều trị bệnh nhân mang thai đă có tiền sử viêm thận, định kỳ sáu tháng bệnh nhân từng/chưa bị viêm thận tiến triển trước đó, viêm thận
Những bệnh nhân mắc bệnh SLE khơng có kháng thể kháng dsDNA thường sản sinh kháng thể kháng ssDNA Cũng tương tự, kháng thể kháng Sm đặc hiệu cao cho SLE xuất 10% - 30% trường hợp bệnh SLE
V NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ