Nghiên cứu sàng lọc một số bất thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi của phôi thụ tinh trong ống nghiệm

Áp dụng quy trình FISH và Array CGH để sàng lọc một sổ bất thường số lượng nhiễm sắc thể trên các tế bào phôi ngày 3 và ngày 5.. Đối tượng và phương phàp nghiên cứu: 50 mẫu phôi dư đượ[r]

Trong phân loại độ tương đồng 98% cao có đủ độ tin cậy để kết iuận chủnq tìm thuộc iồi cịn độ tương đong 98% đủ để khẳng định chủng thuộc chi

Kẹt so sanh cho thấy, trình tự đoạn gene mã hóa rRNA 16S chủng BK2.2 có độ tường đồng cao 99% so với nhiều chủng thuộc chi Streptomiyces Qua nhiều nghiên cứu cho thấy chi Strepíomiyces chi xạ khuẩn có nhiều đặc tính q, có khả sinh nhiều chất kháng sinh quý chiết xuấí ứng dụng

Như vậy, với chùng xạ khuẩn khác, chùng BK2.2 mà chủng phân lập thuộc chi Streptomiyces đâ góp phần làm phịng phị thêm số lượng chủng xạ khuẩn íhuộc chi Streptomiyces nói riêng hệ V! sinh vật có khả sinh chất khổng sinh nóỉ chung, phục vụ cho íên men sản xuất chất kháng sinh sau

KÉT LUẬN

1 Đã tuỹển chọn chủng xạ khuẩn BK2.2 có hoạt tính kháng cao kháng vi khuằn Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng bệnh viện

2 Trên sở kết qua nghiên cứu trình tự đoạn gene mã hóa rRNA 16S chủng BK2.2 nghiên cứu xốc định thuộc chi Streptomiyces

KHŨYÉN NGHỊ

1 Tiểp tục nghiên cứu tách triết chất kháng sinh từ chủng BK2.2

2 Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh cùa chủng BK2.2

3 Tim hiểu khả ứng dụng chất kháng sinh từ chủng BK2.2

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Vi Thị Đoan Chinh (2011), Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chùng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện Bao cáo tồng kểí đề tài khoa học công nghệ cẩp Bộ Mã số: B2009-TN07-02

2 Vi Thị Đoan Chính, Trịnh Ngọc Hồng, Trịnh Đinh Khá, VO Thị Lan (2007), Nghiên cưu phan bổ xạ Uhiiổn pmU r'KẲ+ l/hAnn r\V>Âr* IA**V TkAl KI/11 afAvt M iUứi i oiiiỉi u ỉứi isi lcỉỉ iy oil III fỳí icài i iợp ÍU Ucii I i iai NyUycỉK Báo cáo khoa học Hội nghị íoản quốc NCCB khoa học sống Tr.433 “ 437

3 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đinh Quyến, Phạm Văn Ty (2008), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr.39 - 41

4 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đinh Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vậí học, NXB Giáo dục

5 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ sính học"Hà Nội

6 Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuần sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đẩt Quảng Nam - Đà Nang, Luận án Phỏ tiến sĩ Sinh học, Hà Nội

7 Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011),Điềutra, nghiên cứu số hoạt chất có khả khang vi sinh vạt vả kháng dòng tế bào ung thư íừ xạ khuẩn, Báo cáo kết thực đề tài KHCN đặc biệt cấp Đại học Quốc gia, Mã số QG 09 48

8 Nguyễn Khang (2005), Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất Y học Hà Nội, tr.7-20

9 Trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn vi sinh vật (2003), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất Y học

10

http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanlo aixakhuan

NGHIÊN u SÀNG LỌC MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THẺ TRƯỚC CHUYẺN PHÔI CỦA PHÔI THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

TS Triệu Tiến Sancj, ThS Nguyễn Thị Việt Hà (BM Sinh học & Di truyen Y học, Học viện Quân y) ThS Trần Thu Huyền ( T r u n g t â m N g h i ê n c u Y D ợ c , H ọ c v i ệ n Q u â n ý )

HV Vũ Anh Dũng (DH48A, Học viền Quân ý) s v Đào Hải A nh (DY10A1, Học viện Quân y) Hướng dân: PGS.TS Trần Văn Khoa ( B M S i n h h ọ c & D i t r u y ề n Y h ọ c , H ọ c v i ệ n Q u â n y )

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Phàt bất thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi cốc phôi thụ tinh ống nghiệm góp phần nâng cào hiệu chuyển phôi phôi làm tổ cốc phôi chuyển Mục tiêu: Chuần hóa quy trình kỹ thuật FISH kỹ thuật Array CGH tế bào phôi dư Áp dụng quy trình FISH Array CGH để sàng lọc sổ bất thường số lượng nhiễm sắc thể tế bào phôi ngày ngày Đối tượng phương phàp nghiên cứu: 50 mẫu phôi dư sinh thiết Trung tâm Công nghệ Phôi - Học viện Quân y (HVQY) 79 phơi cua 12 gia đình đồng Ỷ tham gia nghiên cứu sàng lọc bất thường NST phôi Phương pháp nghiên cứu: s dụng kỹ thuật FISH xác định bất thường số lượng nhiễm sắc thể (NST) phơi Kết q: Kỹ thuật FISH sau hồn thiện chẩn đoản 50 phơi; 21 phơi có lệch bội Kỹ thuật Array CGH chẩn đốn 28 phơi bất thường Kết luận: Đã hồn thiện áp dụng quy trình phát bất thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi càc phơi thụ tinh ống nghiệm.

Từ khóa: Bất thương nhiễm sắc thể, phôi thụ tinh ống nghiệm.

SUMMARY

SCREENING STUDY DETECTED ANEUPLOIDY BEFORE EMBRYO TRANSFER OF EMBRYO IN VITRO FERTILIZATION

Tien Sang Trieu, PhD, MSc Viet Ha Nguyen Thi (Department o f Biology & Genetics Medicine, Vietnam Military Medical University)

MSc Thu Huyen Tran (The Biomedical and Pharmaceutical Applied Research Center, Vietnam Military Medical University) Anh Dung Vu (DH48A, Vietnam Military Medical University) H aiAnh Dao (DY10A1, Vietnam Military Medical University) Background: Detection o f aneuploidy before embryo transfer in IVF embryos contribute to improve embryo transfer and embryo implantation efficiency Objective: standardize technical procedures and Array CGH technique on residual embryonic cells Apply the FISH and Array CGH technique to screen aneuploidy in embryonic cells day and day Materials and methods: 50 surplus embryos obtained at embyonic technology center, Military Medical University 79 embryos o f 12 families agreed to participate in the screening aneuploidy Method: Using FISH and Array CGH technique for detection o f aneuploidy o f embryos Results: FISH technique was applied successfully in detection aneuploidy in 50 embryos, of which, 21 embryos were identified as aneuploidy Array CGH technique to detection aneuploidy in 50 embryos, o f which, 28 embryos were identified as aneuploidy Conclusion: FISH technique was applied successfully in detection aneuploidy in embryos before embryo transfer.

Keyw ords: Aneuploidy, IVF embryos. ĐẶT VẮN ĐẺ VÀ MỤC TIÊU

Phương pháp thụ tinh ống nghiệm (In-vitro Fertilization / IVF) đóng vai trò quan trọng lĩnh vực hỗ trợ sinh sản ngày phát triển rộng khắp giới Để đieu trị thụ tinh ống nghiệm đạt kết cao đảm bảo cho hệ khoe mạnh vế thể lực, sáng suốt tinh thẩn, khơng bị bệnh di truyền gia đỉnh, góp phần nâng cao chấí lượng dân số, giảm gánh nạng cho gia đình xã hội thỉ việc nghiên cứu phương pháp ưu việt để lựa chọn phơi tot có gen di truyền binh thường yêu cầu cấp thiết thực tiễn Có nhiều kĩ thuật sử'dụng PGD, kỹ thuật FISH PGD phương pháp giup phat bất thường số lượng NST cặp NST 13, 18, 21, X, Y phôi bào thời gian ngắn, không can qua bước tach chiết ADN khỏi tế bào không cần qua nuôi cấy tế bào, kỹ thuật Array CGH có thề !úc phái tồn cac bất thường NST phơi Kỹ íhuậỉ FISH Array CGH PGD ứng dụng giới tư năm 90, nhiên Việt Nam chưa có nhiều sở thực Vì vậy, chúng toi thực đề íài: “Nghiên cứu sàng lọc số bat thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi phôi thụ tinh ống nghiệm"với mục tiêu: Chuần hóa quy trình kỹ thuật FISH kỹ thuật Array CGH trên tế bào phơi dư Áp dụng quy trình FISH Array CGH để sàng lọc m ộ i số bat thường số lượng nhiễm sắc íhể tế bảo phôi ngày ngày 5.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN u

Đối tượng nghiên cứu: 50 tế bào phôi cung cáp Trung tâm công nghệ phôi, Học viện Quân y Các tế bào phôi sinh thiết từ phôi ngày năm dư (những phôi chất lượng xấu trữ lạnh bệnh nhân đồng ý cho nghiên cứu vỉ khơng cịn nhu cấu sử dụng) 79 phơi 12 gia đình đồng ý íham gia sàng lọc nhiêm sắc thể cùa phơi

Phương pháp nghiên u : Quy trinh sinh thiết tế bào phơi, quy trinh FISH, quy trình Array CGH

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Xây dựng quy trình sàng iọc lệch bộị NST số 13, 18,21 NST X, Y kỹ thuật FISH

Sử dụng kỹ thuật FISH đế xác định bất thường NST thực nhiều trung tâm nghiên cứu giới Ớ sử dụng kit Vysis MtiVysion í hương mại hóa trung tâm nghiên cứu the giới sử dụng Đối với q trình chn hóa quy trinh FISH, sinh thiết từ mẫu phôi dư tổng số 58 tế bào phơi (có tế bào phổi ngày tế bào phôi ngàỵ 5) Trước bước vào thực kỹ thuật F!SH đề chuẩn hóa quy trinh chúng tơi có tiến hành thử thao tác cố định tế bào lên lam kính đối vởi tế bào phơi Trong q trình thao tác tế bào phôi làm bong 3/5 ỉế bào nguyên nhân: lam kính sử dụng chưa đủ nên íế bào khó bám dính vào lam, trình nhỏ dung dịch cố định Carnoy nhanh nhiều Sau khỉ rút kinh nghiệm chúng tơi cố định 2/5 tế bào phơi cịn iại Trong q trình íhực kỹ thuật, nhận thấy công đoạn cổ định tế bào iến !am kính íà het sức quan trọng phải đặc biệt ý tới bước nhỏ dung dịch Carnoy cố định lến vị trí có tế bào phôi Nếu te bào phôi bị bong khỏi lam trình thao tác kỹ thuật thất bại Trong q trình tiến hành kỹ thuật FiSH ổể chuẩn hóa quy trinh 53/58 tế bào phôi sinh thiết từ phơi dứ, có 3/50 tế bào phơi khơng đưa kết luận có hay khơng có lệch bội nhiem sắc thể tín hiệu lai xấu; cịn lại 50/58 tế bào phơi có tín hiệu huỳnh quang phân tích được, kết quà FISH sau:

Kết đánh giá lệch bội NST thu 50 tế bào phôi _

Tê bào phôi Tỷ iệ %

Binh thường 29 58

Bất thường 21 42

Tống số 50 100

Đối với 50 mẫu tế bào phôi thu đư ợ ckét lai, 21/50 mẫu cho tín hiệu bấí thường cặp nhiễm

sắc thể 13, 18, 21, X, Y Như vậy, tỷ iệ iệch bội NST cao, chiếm tới 42% tổng số phơi Chari đốn Cịn lại 29/50 mẫu phổi cho kết chẩn đoán bỉnh thường với cặp nhiễm sắc đánh giá Kết tỷ lệ ỉệch bội nhiễm sắc thể cua Nguyễn Thị Hương cs khi nghiên cứu với 127 phôi ngày kỹ thuật FISH đầu dò 46,4% Như vậy, kết tỷ lệ lệch bội chúng tơi đưa có sai khác với số kết cua tác giả khác Lý giải cho điều sai khác việc chọn mẫu nghiên cứu sổ lượng mẫu đánh giá, khác so lượng cặp nhiễm sắc thề đánh giá nghiên cứu

Các dạng bất thường NST thu kỹ íhuật FISH

Hội

chứng lượngSố Tỷ lệ% Hội chứng Số

lượnq Tỷ lệ %

Patau 19,0 Turner 4,8

Edwards 2 9,5 Klinefelter 4,8

Down 33,3 Bàt thường khác 6 28,6

Tống số 21 100

Theo kết phân tích 50 tế bào phôi nhận thấy, tỷ lệ phôi cho kết hội chứng Down (trisomy 21) chiếm kết cao (33,3%), tiếp đến tỷ lệ phoi bị hội chứng Patau (trisomy 13) (chiếm 19%), gặp bất thường nhiễm sắc thể 18 nhiêm sắc thề giới tỉnh Kết tương đồng với nghiên cứu Munné, Sandalinas Cohen thực 1600 phôi cho thấy, hầu hết dị bội nhiễm sắc thể thường xuấí hỉện cặp nhiễm sắc thề 2 1, 22, 16,15; cặp nhiễm sắc thề giới tính 13, 18 gặp [2] Từ kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thề phôi bào cao cặp nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y Do vậy, việc sàng lọc bất thường trước chuyển phôi yếu tố cần thiết nhằm hạn chế trẻ sinh mang dị tật bẩm sinh, đặc biệt nhóm có nguy cao

Kết FISH phơỉ bào khơng có bất thường cặp NST 13,18, 21 cặp NST giới tính (a) Phơi có cặp NST glớỉ tính XX; (b) Phoi có cặp nhiễm

sắc thể giới tính XY

Kết FISH phôi bào mang NST 18

Quy trình sàng lọc lệch bội NST số 13, 18, 21 NST XY kỹ thuật FISH tóm tắt sau:

Giai đoạn 1: Gông đoạn cố án h tế bào lên íam kính Chuẩn bị đĩa petri có nhỏ sẵn giọt dung dịch Quan sát kính hiền vi soi nồi, hút tế bào phơi, sau đặt vào giọt thứ (giọt dung dịch PBS) để rửa dầu (lớp dầu bảo quằn tế bào phơiv Sau đó, hut chuyển tế bào sang giọt thư hai (dung dịch nhược trương), giọt thứ hai, sau khoảng phút, hút tế bào đặt lên lam kính Khi thấy vị trí có tế bào gần khơ hồn tồn, tiến hành nhỏ giọt dung dịch cố định lên vòng tròn khoanh, giọt khoảng 2|JÍ Giọt trước khơ tiếp tục nhỏ giọt tiep ỉheo Khi thấy hình ảnh nhân íế bào rổ ràng thi dừng Việc nho dung dịch cố định Để tiêu bồn khô nhiệt độ phịng

Giai đoạn 2: Cơng đoạn iaỉ đầu dò với tế bao phoi Ngâm tiêu vào methanol phút Sau lẩy để tiêu khơ nhiệt độ phịng Lấy mẫu dị ADN MultiVysion PGT từ tủ bảo quản -20°c để nhiệt độ phòng trứớc sử dụng từ tới 10 phút Nhỏ 3ịjÍ mâu dị lên vùng lai có chứa tế bào đánh dấu Đặt nhẹ nhàng lamen phủ lên vùng lai Gắn rubber cement quanh vị trí mép lamen để tránh bay dung dịch mẫu dò trinh lai Đặt lam mẫu vào buồng lai Đặt chương trình: 73°c trong 10 phút, 37°c

Giai đoạn 3: Công đoạn rửa tiêu sau lai Lấy tiêu khỏi buồng lai, nhẹ nhàng gỡ bỏ rubber cement iarnen Nhúng tiêu vào COC đựng dung dịch 0,4X SSC/0,3% NP40 phút Dung dịch náy phải đạt 73°c từ trước khỉ sử dụng Sau đó, iấỵ tiêu nhúng tiếp vào cốc đựng dung dịch 2X SSC/0,1% NP40 nhiệt độ phòng phút Lấy tiêu để khơ hồn tồn tù ấm 37°c (tránh ánh sáng)

Giai đoạn 4: Cơng đoạn phân tích tín hiệu sau lai Sau lam khơ nhỏ 3ụ\ Antifade I! iên vùng iai đậy Ịamen kính lên Quan sát phân tích tín hiệu lai kỉnh hiển vi huỳnh quang với phin lọc thích hợp đưa kết luận vớỉ mẫu phôi bào cụ thể

Xây dựng quy trình sàng iọc lệch bội NST kỹ thuật Array CGH

Với 50 mẫu phôi dư sử dụng để chẩn hóa kỹ thuật Các phơi sinh thiết dùng cho chuẩn hóa kỹ thuật FISH chuẩn hóa kỹ ỉhuật Array CGH Kết chuẩn hóa kỹ thuật Array CGH cho kết xác xác định nhiều nhiễm sắc thể kỹthuậí FISH

Các dạng bất thường NST thu kỹ thuật FISH kỹ thuật Array CGH _ _ '

Kỹ thuật FISH Kỹ thuật Array CGH Hội chứng Số lươnq Tỷ lệ % Số íượnq Tỷ lê %

Patau 19.0 14.3

Edwards 2 9.5 2 7.1

Down 33.3 25.0

Turner 4.8 3.6

Klinefelter 1 4.8 1 3.6

Bât thường khác 6 28.6 13 46.4

Tông số 21 100 28 100

Theo kết phân tích 50 tế bào phơi nhận thẩy, tỷ lệ phôi cho kết hội chứng Down

(trisomy 21) chiếm kết cao (33,3%), tiếp đến tỷ lệ phôi bị hội chứng Patau (trisomy 13) (chiếm 19%), gặp bất thường ổối với nhiễm sắc thể 18 nhiễm sắc thể giới tínhT Các bất thường khác mà kỹ thuật FISH phát chủ yếu NST số 13,18, 21 NST X, Y hội chứng bị NST Đối với kỹ thuật Array CGH số lượng íể bào phơi phát bất thường NST cao so với kỹ thuậỉ FISH Các bẩt thường khác NST khác mà kỹ thuật FISH không phát ngaoif NST số 13, 18, 21 X, Y kỹ thuật Array CGH phát NST thường khác Từ bảng kết nhận định kỹ thuật Array CGH sàng lọc bất thường NST tế bào phôi cao so với ky thuật FISH Do vậy, sàng lọc kỹ thuật FISH thỉ mộỉ số bất thường NST khác bị bỏ qua Từ !àm giảm hiệu ịàm tổ q trình chuyển phơi sau sàng lọc

*«

Ảnh Array CGH phơi có NST bình thường 46,XY ứng dụng quy trinh sàng lọc Ịệch bội NST số 13, 18, 21, X, Y kỹ thuật FISH phôi thụ tinh ống nghiệm

ứng dụng quy trinh kỹ thuật FISH sau chuẩn hóa, chúng tơi tiến hành thực kỹ thuật phôi 12 gia đỉnh thực IVF tham gia đề tài, gửỉ sang từ Trung tâm Công nghệ Phôi - Học viện Quân y

Kết qua sàng lọc bất thường NST phối kỹ thuật FISH

Kêtquả FiSH Số íượng phơi Tỷ lệ%

Binh thường 38 48,1

Bầt thường 41 51,9

Tông số 79 100

tính Cịn lại có 41/79 phơi cho kết bất thường chiếm tỷ lệ 51,9% Với phơi có kết FISH bình thườna ìiến hành chuyển phơi Cịn lạị phơi có kết bat thường NST cặp 13, 18, 21, XY không chuyển, điều giúp iăng tỷ iệ thành cơng iVF giúp gia đỉnh có hội sinh em bé khỏe mạnh Ngay nghiên cứu chúna 12 gia đinh muộn, qua q trình chuyễn phơi có kết FISH bình thường có gia đình sinh bé gái khỏe mạnh, khơng có bát thường số lượng NST

Hiệu chuyển phôi gia đỉnh sàng lọc lệch bội NST 13, 18,21, X, Y

ứng dụng quy trình kỹ thuật FISH sau chuẩn hóa, chúng toi tiến hành thực kỹ thuật phôi 12 gia đinh thực hiẹn IVF tham gia đề tài, gửi sang ỉừ Trung tâm Công nghệ Phôi - Học viện Quân y

Kết FISH Số lượng phơi

Tỷíệ %

Chuyến phoi

Đậu phơi

Đã sinh

Bình thường 38 48,1 38 12

Bât thường 41 51,9

Tống số 79 100

F!SH, có 38/79 phơi chiếm tỷ lệ 48,1% có kết bình ỉhường cặp NST 13, 18, 21, cặp NST giới

KÉT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

Đã xây dựng quy trinh sàng iọc iệch bội NST phôi kỹ thuật FISH kỹ thuật Array CGH Đâ ứng dụng quy trình sàng lọc bất thường số lượng NST cho 12 già đình iàm IVF trung tâm cơng nghệ phơi Kết chuyển phơi: có 12 phơi chuyển va có 6 phơi làm tồ, 03 có trường hợp sinh trẻ binh thường, cầ n triển khai kỹ thuật Array CGH để sàng lọc toàn NST tế bào phôi, làm tăng tỷ chuyển phôi thành công IVF Tiếp tục nghiên cứu triển khai với số lượng bệnh nhân lớn đế giảm giá thành, tiết kiệm chi phí cho gia đinh bệnh nhânT

TAI UỆƠ THAM KHẢO

1 Bùi Võ Minh Hoàng (2003), “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang íại chỗ (FISH) để phat nhanh số bất thường nhiễm sắc ỉhề chẩn đoán trước sinh”, Luận văn thạc sĩ y học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

2 Munne s, Chen s, Coíis p, Garrisi J, Zheng X (2007) “Maternal age, morphology, development and chromosome abnormalities in over 6000 cleavage-stage embryos” Reproductive Biomedicine Online, 14; 628- 634

XÂY DỰNG MƠ HÌNH TỐN HỌC Dự ĐỐN TÁC DỤNG ứ c CHÉ XANTHIN OXIDASE CỦA CÁC HỢP CHÁT FLAV0N01D

Cao Huy Bình, Nguyễn Văn Phương (Sinh viên K67, Trường Đ ại h ọ c D ược Hà Nội) Nguyễn Ngọc c ầ u (Dược sỉ, B ộ m ôn D ợ c liệu, T rường Đ ại h ọ c D ượ c Hà Nội) PGS.TS Nguyên Thu Hằng (Bộ m ôn D ược liệu, T rường Đ i h ọ c D ược Hà Nội) TS Pham Thế Hai (Bô m ôn D ươc lứ c, Trường Đ a i h o c Duxyc Hà Nọt) TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Cốc hợp chất flavonoid chứng minh nhóm hợp chất ức chế xanthin oxidase (XOI) tiềm năng để triển thành chất dẫn đường nghiên cứu phát triển thuốc điều trị bệnh g ú t Đanh giá tác dụng XOI 10.000 flavonoid bĩếí để sàng lọc hợp chất tiềm nhắt thốch thức lớn.

http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanlo