Nghiên cứu chẩn đoán nhanh Staphylococci và tính đề kháng Methicillin của chúng bằng kỹ thuật PCR đa mồi

Tại Việt Nam, các nghiên cửu liên quan đến chần đoán, phát hiện độc lực của các staphylococci và tính kháng Methỉciliin bằng các phương pháp truyền thống, tuy nhiên các ng[r]

NGHIÊN c ứ u CHẨN ĐOÁN NHANH STAPHYLOCOCCI VÀ TÍNH ĐÈ KHÁNG METHICILLIN CỦA CHÚNG BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI

Những người thực hiện: Trần Thanh Loan, Trương Đình An Sơn

Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Kỹ thuật Y Dược Đà Nắng

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Đình Bỉnh

Bộ mơn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Huế

ĐẶT VÁN ĐỀ

stảphyỉococci ỉà tác nhân gây nhiều nhiễm khuẩn thường gặp, chúng gây nên nhiều bệnh lý khác nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn da, nhiễm khuẳn đường tiết niệu, nhiêm khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn huyểt, viêm tủy xương.,.[2], [3], [4], [5] Các nhiễm khuần staphyiococci thương điều irị khó khăn vi khuển kháng íhuốc, nhiều cac staphylococci kháng thuốc, đa kháng thuốc phân lập từ bệnh nhân Các vi khuẩn kháng Methiciliỉn íhường kháng với nhiều thuốc khác, nên xem “siêu vi khuẩn”[2], [3], [6] Việc chẩn đoản sớm nhiễm khuẩn staphylococci tính kháng thuốc chúng có vai trị quan trọnp điều trị Nhiều nghiên cứu ứng dụng yểu to tạo nên độc lực mạnh cua Staphylococci yếu tố xâm nhiêm, sinh độc íố, sinh men phân huy protein, chất diệt bạch cầu Trong đó, FemA, Coagulase thị thường dùng để phát staphylococci có độc

lực phịng thí nghiệm.

Tại Việt Nam, nghiên cửu liên quan đến chần đoán, phát độc lực staphylococci tính kháng Methỉciliin phương pháp truyền thống, nhiên nghiên cứu ve kỹ thuạt sinh học phân tư đe phát gen mã hóa FemA, yếu tố độc iực Staphylococci Coagulase gen mecA đề kháng Methicillin staphylococci chưa có nhiều t2] ~

Đê tài: “Nghiên cứu chân đốn nhanh Staphylococci tính đề kháng Methiciliin chúng kỹ thuật PCR đa mồi” nham mục tiêu xây dựng quy trỉnh chẩn đoán nhanh staphylococci, xác định gen mã hóa FemA, yếu íố độc !ực Coagulase tinh đề kháng kháng sinh Methicillin chúng kỹ thuật PCR so sánh với phương pháp chẩn đốn Staphylococci phịng thí nghiệm truyền thống, phát Coagulase tính đe kháng kháng sinh Methicilỉin chúng

ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

1 Đối tượng nghiên cứu

- 80 chủng VI khuẩn staphylococci gồm 45

chủng S.aureus 35 chủng staphyococci coaguỉase âm tính phân iập phương pháp ntioi cấy thường quy

- Cac chủng vi khuẩn làm chứng gồm 01 chủng s

aureus có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+), 01 chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm Coagulase (-), mecA (-), FemA (-)

2 V ậỉ liệu nghiên cứu

2.1 Hóâ Chat, sinh phẩm

- Các loại môi trường nuôi cáy thực kháng sinh đồ: Mơi trường ni cấy: íhạch máu, thạch thưởng, Chapman, BHI, Muelíer HỈnton Agar, mơi ỉrường sinh vậí hóa học

- Các loại vật iíệu khác: Thuốc nhuộm Gram, Huyết tương thỏ, H202 3%, Nước muối sinh lý vô khuẩn, loại đĩa kháng sinh Oxacillin Cefocitin

- Các loại hóa chất để thực PCR: Agarose, duncj dịch điện di, Ethidium Bromide, thang DNA chuan

2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Các loại thiết bị: Tu ấm 350C 370C, máy iắc rung (Vortex), tủ lạnh, loại máy ly tâm, tủ an íoàn sinh học, máy luân nhiệt, buồng điện di, bàn đèn đọc kết điện di

- Các loại dụng cụ: Đèn cồn, kẹp đĩa kháng sinh, thước đo đường kính vỏng ức chế, khun cấy, tăm bơng vô khuẩn, loại vật iỉệu đề thực PCR

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Kỹ thuật nuôĩ cắy định danh vi khuẩn Staphylococci

Các bệnh phẩm cấy môi trường đặc, lỏng tùy theo yêu cầu kỹ thuật loại mẫu ngNệm Khi có khuẩn lạc nghi ngờ (màu vàng Chapman, tan máu B thạch máu ), làm phiến phếí nhuộm Gram kiểm tra hình thải Tiến hành phân lập định danh theo quy trình truỵền thống chẩn đoán Staphylococci là: cầ u khuan Gram dương đứng đám, catalase dương tính, xác định Staphylococci có tiêu chuẩn sau: sắc íố vàng, lên men đường mannit, có coagulase dương tính Các Síaphyiococci coagulase âm tính có hay khơng lên men đường mannit, coaguỉase âm

[2J,[33-3.2 Kỹ thuật phát vi khuẩn staphylococci kháng Methicillin qua trung gian mecA kỹ thuật s dụng đĩa Cefoxitin (Theo CLSl 2011): Với

khoanh giấy cefoxitin 30ụg tren môi trường Mueiler Hinton Agar, Điều kiện nuôi cấy: 33-35 °c/16 - 18 Đọc kết quả: ắ 21 mm = mecA diPơng tính; ằ 22 mm = mecA âm tính [1]

3.3 S dụng kỹ thuật PCR tìm gen mã hóa FemA, Coagulase gen mecA

- Tách chiết DNA từ khuẩn lạc staphylococci: Tách chiết DNA phương pháp nhiệt DNA vi khuẩn chuẩn b ĩ cách lấy 1 khuẩn lạc cho vào ống eppendorf có chứa 250 MÍ nước cẩt Huyền dịch vi khuẩn chưng cách thủy nhiệt độ 990C 10 phút Sau đo quay ly íam 10.000 vổng/phút trorìg 10 phút Bỏ phần cặn lắng, lấy phần dịch noi đề sử dụng cho phản ứng PCR [2], ự ], [8]

- Cặp mồi (Primers): Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu

Tt Primers sân phấm Chức nănq Tham khảo từ

Coagulase 5'-ATAGAGATGCTGGTACAGG-3’

5'-GCTTCCGAĨTGTTCGATGC-3 603-872 Coaguíase Hookey eí (1998) [3] 2 mecA 5-CCTAGTAAATGCTCCGGAA-3’ 5’-CTAGTCCATTCGGTCCA-3 314 MRSA Nizami Duran (2012) [6] FemA 5'-AAAAAAGCACATAACAAGCG-3‘

5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3' 132 S.aureus Nizami Duran (2012) [6] * Thực phẫn ứng PCR

Một phản ứng PCR y=25|il gồm: 1.5mM MgC!2, 200ịjM loại dNTP, 0,625 unit Taq DNA polymerase, 0,5ụM mồi, Taq buffer, nưởc cất iần*

Các bước tiến hành: Đối với mẫu, thực như sau: 20|il mix PCR pha + 5ịi\ dịch DNA tách chiết, cho vao eppendorf 0,2mi Đặt chường trình cho máy iuân nhiệt hoạt động:

Bước 1: 95°c phút 1 chu kỳ Bước 2:

95°c 30 giây

40 chu kỳ

51°c 30 giâv

72°c 30 giây

Bước 3: 72°c 6 phút 1 chu kỳ

Điện di để phát sản phẩm PCR: sản phẩm tạo thành điện di điện 80V, thạch agarose 1% nhuộm với chất màu huỳnh quang tự nhiên đọc kết buồng đọc huỳnh quang Sự diện cua sản phẩm so sánh với thang mẫu ĐNA ladder 100bp

4 X lý số liệu: Xử lý số liệu thu thập đưực phương pháp thống kê y học Độ nhạy độ đạc hiệu thử nghiệm tính theo cơng thức bảng 2x2 ià: Độ nhạy = a/a+c; Độ đặc hiệu = d/b+d [9]

KẾT QUẢ NGHIỀN u

1 Tính chất sỉnh vật học staphylococci phân lập được

Bảng Tính chất sinh vật học staphylococci Tính chất

Vi khuẩn ' Câu khuấn Gram (+)n % Catalase (+)n % Mannit (+)n % Coagulase (+)n % Tan máu {+)n % sẳc íố vànqn % S aureus 45 100,0 45 100,0 45 100,0 45 100,0 39 86,7 45 100,0 Staphylococci coagulase

âm tính 35 100,0 35 100,0 14 40,0 0 0 28 80,0 29 82,9

Các Staphylococci định danh xác định độc lực phướng pháp truyền thống dựa vào tiêu bẩn nhuộm Gram, tính chất Caíalase dương tính, làm đơng huyết tương, lên men đường Mannit, tính chất tan máu khuẩn íạc có sắc tố màu vàng

2 Đặc điểm kiểu hình kĩểu gen độc iực kháng Methiciliin hai nhóm staphylococci khảo sát

Bảng Tính kháng thuốc Methiucillin

Các chùng vi khuẩn

Số chủng

thừ

Tính kháng Methiciilin test Cefoxitin qua trung gian mecA

Khánq Nhạy

N % n %

S.aureus 45 40 88,9 11,1

sta coa (-) 35 15 42,9 20 57,1 Tống cộng 80 55 68,8 25 31,2 trung gian mecA qua test Cefoxitin kết quà cho thấy chùng S.aureus kháng Cefoxitin đếrì 88,9%, chùng staphylococci coaguiase âm tính kháng Cefoxitin chi CO 42,9% Tỳ !ẹ đề kháng chung chủng Staphylococci 68,8%

Bảng Kiểu gen mã hóa chủng vi khuẩn, độc lực kháng Methiucillin cùa chủng staphylococci khảo sát

Các chủng

vi khuẩn Số chủng thử

FemA mecA Coagulase í+ì í-ì (+) {-) í+ì (-)

S.aureus 45 45 0 •40 45 0

sta coa (-) 35 32 15 10 32 Tổng cộng 80 48 32 55 25 48 32

100,0% chủng có S.aureus có Coagulase dương tính với thử nghiệm Coagulase phiến kính có gen mã hóa Coagulase, staphylococci Coaguiase âm tỉnh (thử nghiệm Coagulase trơn phiến kính ống nghiệm) có 8,6% (3 chủng) có gen mã hóa Coagulase

100,0% chủng có s.aureus có Coaguiase dương tính với thử nghiệm Coagulase phien kính có gen mã hóa FemA, staphylococci Coagulase âm tính (thử nghiệm Coagulase tren phiến kính ống nghiệm) có 8,6% (3 chùng) có gen mã hóa FemA

88,9% chủng có S.aureus có gen mã hóa mecA, Staphylococci Coagulase âm tính có 42,9% (15 chủng) có gen mã hóa mecA

1 11 12 1314 15

Lane 7: DNA ladder

Lane 14 chủng s.aureus kháng Methiciilin (chứng dương có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+)

Lane 15: Chung V! khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm có Coagulase (-), mecA (-), FemA (-),

Lanes 2, 3, 9: chủng vi khuẩn có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+)

Lanes 1,2, 3, 5, 6, 8, ,1 ,1 , 13: chùng vi khuẩn có FemA (+)

Lanes 4, 10: chủng vi khuẩn chứng Ps aeruginosa, E.coli CÓ FemA (-)

Bảng Đánh giá giá trị kỹ thuật xác định Coaguíase chủng S.aureus

"■\i$ếí PCR Test Coagầse^,

Có gen mã hóa Coagulase

Khơng có gen mã hóa Coagulase

Tổng cộng S.aureus

Coagulase (+) 45 0 45

Staphylococci

Coágúlase (-) 32 35

Tổng cộng 48 32 80

Độ nhạy kỹ thuật truyền thống xác định Coagulase cùa staphylococci 93,8%, kỹ thuật truyền thống bỏ sót chủng staphylococci có gen mã hóa Coagulase Độ đặc hiẹu cua kỹ thuật truyen thống xác định Coagulase chủng Staphylococci 100,0%

Bảng So sánh kỹ thuật xác định tính kháng Methiciliin S.aureus

Kỹ thuật PCR Tồng

MecA (+) MecA {-)

Cefoxitin (+) 40 0 40

Cefoxitin (-) 0 5

Tống 40 45

Độ nhạy kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát tính kháng Methicillín s.aureus !à 100,0%, độ đặc hiệu 100,0%

Bảng 6 So sánh kỹ thuật xác định íính kháng Methicillỉn staphylococci coagulase âm tính

Kỹ thuật PCR Tồng

MecA (+) MecA (-)

Cefoxitin (+) 15 0 15

Cefoxitin (-) 0 20 20

Tống 15 20 35

Độ nhạy kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát tính kháng Methiciilin staphylococci coagulase âm tính 100,0%, độ đặc hiệu 100,0%

BÀN LUẬN

Nghiên cứu 80 chùng staphylococci định danh xác định độc lực phương pháp truyền thống dựa vào tiêu nhuộm Gram, tính chất Catalase dương tính, làm đơng huyết tương, lên men đường Manrtit, tính chất tan máu khuẩn lạc có sắc tố màu vàng Dựa vào tính chất này, định danh xác S.aureus staphylococci coagulase âm tính Thời gian để định danh hết 40-48

Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi để xác định gen mã hóa FemA, ịoaguiase gen mecA đề kháng Mhicĩllin chủng vi khuẩn cùa hai nhóm Staphylococci, kết có 48 chủng vi khuẩn Staphylococci có gen mã hóa Coaguiase, chiếm 60,0%, 100,0% chủng s.aureus có Coagulase dương tính với thử nghiệm Coaguiase phiến kính có gen mã hóa FemA, Coaguiase, nhiên với chủng staphylococci Coagulase âm tính (cả với thử nghiệm òoagulase

trên phiến kính ống nghiệm) lại có đến 8,6% (3 chủng) có gen ma hóa ồoagúlase đồng thời chúng có gen mã hóa FemA Qua so sánh íhẩy độ nhạy kỹ thuật truyền thống xác định Coagulase cho thấy với nhóm staphylococci 93,8%, S.aureus độ nhạy đến 100,0% độ đặc hiệu với nhóm staphylococci coagulase âm tính 100,0%, nhiên, kỹ thuật không xác định gen coagulase nên dùng PCR thi có chùng có gen Coaguỉase

Sử dụng kỹ thuật kháng sinh đồ khuếch tán thạch theo phương phập Kirby-Bauer để xác định tính kháng Methicillin đĩa kháng sinh Cefoxitin 1qua ỉrung gian MecA, kết chủng s.aureus có 88,9% kháng Coxiỉin, cịn chủng Staphylococci coagase âm tính kháng Cefoxitin !ai đến 42,9%

Kết quà PCR xác định gen mecA, chúng tơi nhận thấy 88,9% chủng s.aureus có gen mecA 42,9% Staphylococci coaguiase âm tính có gen mecA Qua so sánh thấy độ nhạy cùa kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát tính kháng Methicillin S.aureus staphylococci coagulase âm tính 100,0%, độ đặc hiệu íà 100,0% Tác giả Venkatakrỉshna Rao (2011) đánh giá hiệu phương pháp khoanh giấy khuếch tán với đĩa Cefoxitin 30 jjg, kết ghi nhận độ nhạy độ đặc hiệu đĩa Cefoxitin phát tính kháng Methicillin qua trung gian mecA cỏ độ nhạy độ đặc hiệu íà 100% [7]

Chúng tơi xây dựng quy trình PCR đa mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coagulase gen mecA staphylococci kỹ thuật đa mồi Chúng lựa chọn thiết kế cặp mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coaguiase mecA có kích thước sản phẩm khác biệt, chúng tách xa trinh điện di, tạo băng cách biệt nên dễ dàng nhận xét kết quả, tăng cao độ tin cậy đánh giá kết Các tác giả khác có gợi ý tương tự [2],[3],[43,C5],[8] Quy trình tương đối đơn giản, dễ thực tất phịng thí nghiệm hay phịng xét nghiệm có phương tiện cho PCR Kết nhanh chóng xác, rát hữu ích cho lâm sàng để kịp thời điều trị nhiễm khuẩn Staphylococci Nếu so sánh với quy trình chẩn đốn Staphylococci xác định tính kháng Methiciiiin theo phương pháp truyền thống, chúng tơi nhận thấy:

- Phương pháp truyền thống: cho kết sớm 40-48 kể từ lấy mẫu nghiệm (nhuộm, nuôi cấy, xác định coagulase, kỹ thuật đĩa kháng sinh)

- Kỹ thuật PCR: cho kết sớm 20“24 (nhuộm, nuôi cấy, PCR)

Với kỹ thuật cặp mồi (triplex PCR) xác định gen mã hóa FemA, Coaguiase gen mecA cùa chúng

tơi, kết hồn tồn đáng tin cậy, kỹ thuật thực

không phức tạp, phịng thí nghiệm bệnh viện tuyến tỉnh tiến hành nhằm chẩn đốn sởm, xác nhiễm staphyiococci tính kháng thuốc chúng để có hướng điều trị kịp thời

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu 80 chủng staphylococci phương pháp xét nghiệm vi sinh truyền thống sử dụng kỹ thuật PCR, xây dựng quy trỉnh PCR cặp mồi (tripiex PCR) để xác định gen FemA, gen mã hóa độc lực Coagulase gen mecA Quy trình thực bệnh viện tuyến tỉnh để chần đoán sớm, xác cấc nhiễm khuẩn staphyiococci tính kháng thuốc chúng để điều trị hiệu

TA! LIỆU THAM KHẢO

1 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSi) (2011), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M 100-S21.JISSBN 1-56238-742-1)

2 Trần Thu Hoa, Đỗ Thị Lan Hương, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009), "Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm multiplex PCR phái Staphylococci đề kháng Methỉciilin”, Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ số 2, tr 176-180

3 Hookey J.v, Richardson J.F and Cookson B.D (1998), “Molecular typing of staphylococci Based on PCR Restriction Fragment Length Poiymorphis and DNA Sequence Analysis of the Coagulase gene” J of Clin Microbiol, Voi 36 (4), pp 1083-1089

4 Kalhor H, Shariati L, Validi M et al (2012), “Comparison of Agar screen and duplex PCR methods in determination of MRSA strains isolated from nasal carriage” African J of Microbiology Research, Vol 6(16), pp 3722-3726

5 Motiagh Mohammad Reza Safari, Maesumeh Anvari (2010), “Rapid detection of meỉhicillỉn-resistaní Staphylococci by multiplex PCR", African Journal of Biotechnology, Vol 9(45), pp 7629-7631

6 Nizami D, Burcin o , Gu!ay G.D et al (2012), Antibiotic resistance genes & susceptibility patterns in Staphylococci, Indian J Med Res, 135, pp 389-396

7 Rao Venkatakrishna, Bhat Kishore, Kugaji Manohar, Pai Vidya, Shantaram Manjula (2011), “Detection of Methiciliin Resistance in staphylococci: Comparison of Disc diffusion and MIC with mecA gene detection by PCR”, international Journal of Pharmacy and Biological Sciences, Voi 1, Issue 4, pp 518-521

8 Thean Y Tan (2002), “A Comparison of PCR detection of mecA with two standard methods of oxacillin disk susceptibility testing for coagulase- negative Staphylococci”, Journal of Medical Microbiology, Vol(51), pp 83-85

9 Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiêm vi sinh lâm sàng Nhà xuất Y học