Đang tải... (xem toàn văn)
Trong nghiên cứu này, chúng tồi khảo sát các điều kiện thích hợp nhất cho việc tăng sinh và tổng hợp chất thứ cắp ở mô sẹo sãm Ngọc Linh, đổng thời tìm ra được sự tương quân giữa hàm [r]
(1)Phân bổ theo giới íứa tuổi bệnh nhân sau: số bệnh nhân nam cao gấp 2,7 ỉần số bệnh nhân nữ; tuổi bệnh nhân tập ỉrung chủ yếu nhóm tuổi 40, số bệnh nhân 20 tuổi chiếm tỷ íệ tháp (1,61%) Bệnh nhân nhỏ tuổi 12 tuổi lớn tuổi 93 tuổi
Tỷ lệ phát M ỊB(+) 436 mẫu đờm 94/436 (21,56%) cao gấp hái lần ty lệ phát AFB(+) 47/436 (10,77%) Theo bác cáo nghiên cứu đại học ChengMai, Thái Lan, độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Xpert tương ứng 95,3% 86,4%; kỹ thuật nhuộm Ziehi Neeisen tương ứng ià 60,5% 98,5% [7] Để tính độ nhạy độ đặc hiệu, cần cố kỹ íhuật thứ ba ni cấy vi khuẩn, tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán vi khuẩn lao bệnh phầm bệnh nhân Tuy nhiên việc sử dụng kỹ thuật xét nghiệm lâm sàng có giới hạn thời gỉan lâu, yêu cầu chặt chẽ an toàn sinh học giá thành cao Trong nghiên cứu không tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lao
Về tính kháng rifampicin: Gene rpoB đoạn ADN có kích thước 3519 bp, nằm nhiễm sắc thể vi khuẩn lao chịu trách nhiệm mã hoá tiểu đơn vị p enzyme ARN-polymerase RIF gắn vào tiểu đơn vị p ức chế q trình phiên mã tạo ARN íhơng tin cùa vi khuần iao [5,6,9] Đột biến vùng lõi gen rpoB ức chế gắn RIF Đột biến thường xảy vị trí 526 531, vị trí 511, 516, 518, 522 j8] Có khoảng 96,1% chùng kháng RỈF có đột biển gen nàv [4J Những chủng vi khuẩn íao kháng rifampicin đống thời kháng nhiều kháng sinh chống lao khác kháng rifampicin thường xảy sau đột biển kháng thuốc khác ban đầu isoniazid Trong 94 mẫu đờm MTB(+) có 10 mẫu cho kết phát vi khuẩn lao có đột biến kháng rifampicin, điều đáng lưu ý 8/10 mẫu gửi từ Bệnh viện Lao bệnh phổi Hải phòng Việc phát đột biển vùng lõi gen rpoB có ý nghĩa cho lựa chọn kháng sinh điều trị cho bệnh nhân kháng đa thuốc
KẾT LUẬN
Với 436 mẫu bệnh phẩm đờm, kỹ thuật GeneXpert MTB/RIF phát MTB(+) íà 94/436 (21,56%), nhuộm
Ziehl Neelsen phát AFB(+) 47/436 (10,77%) v ề tính kháng RiF: có 10,64% số mẫu có MTB(+) phát kháng RIF; 85,11% số mẫu có MTB(+) bảo cáo nhạy cảm với RIF; 4,26% số mẫu có MTB(+) báo cáo khơng xác định tính kháng RIF.Trong 10 mẫu kháng rifampicin, vùng gen đột biến phốt probe E (6/10), probe B (3/10) probe D (1/10)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Hướng dẫn quy trinh thực hành chuẩn xét nghiệm vi khuẩn lao (2012) Bộ Y tế, Chương trinh chống lao quốc gia
2 Global Tuberculosis Report 2015, WHO, France, http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/191102/1/9789
241565059_eng.pdf _
3 GeneXperi DX system (2008), Operation Manual, Software version 2.1, Cepheid
4 GeneXpert MTB/RÍF(2009), Two hour detection of MTB and resistance to rifampicin, Cepheid
5 Boehme cc et al (2011), Feasibility, diagnosis accuracy and effectiveness of decentralized use of the Xpert MTB/RIF test for diagonis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicenter implementation study
Lancet, 377:1495-05 _
6 loannidis p,et al (2011), Cepheid GeneXpert MTB/RIF assay for Mycobacterium tuberculosis detection and rifampicin resistance identification in patients with substantia! clinical indications of tuberculosis and smear-negative microscopy results J Clin Microbiol, 49(8): 3068-70
7 Konokwan et al (2015), Comparison of Xpert MTB/RIF assay and the conventional sputum microscopy in detecting Mycobacterium tuberculosis in Northern Thailand, Tuberculosis Research and treatment, volume 2015
8 Mboowa et al (2014), Rifampicin resistance mutation on the 81 bp RRDR of rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis clinical isolated using Xpert MTB/RIF in Kampala, Uganda: a retrospective study, BMC infectious Diseases, 14:481
9 TelentiA, Imboden.p., p Marches, F.,Lowrie, D., Cole.S-, Colston, M.J.Matter, L.,Schopfer, K., Bodmer, T (1993), “Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, Lancet 341, pp.647'650
KHÀO SÁT Sự TƯƠNG QUAN GIỮA HÀM LƯỢNG SẮC TÓ CHLOROPHYLL VÀ HƠP CHÁT THỨ CÁP SAPONIN TỎNG SỐ
TRONG MÔ TỀ BÀO IN VITRO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv)
Mai Hương Trà (Bộ môn Sinh - Khoa Dược, Đại học Lạc Hồng) Đô Đăng Giáp (Viện Sinh học nhiệt đới, Tp HCM) TĨM TẤT
(2)sung vào mơi trường cho q trình tăng sinh mơ sẹo 50 g/l Ánh sáng đèn LED vàng giúp cho mô sẹo sâm Ngọc Linh tăng trường tốt tổng hợp saponin cao Mô sẹo giai đoạn phốt sinh hình thái cho thấy chlorophyll tăng kéo theo saponin tăng, ngược lại Mơ sẹo nuôi cấy điều kiện chiếu sang mang lại hàm lượng saponin cao so với toi.
Từkhố: Mơ sẹo; sucrose; saponin; chlorophyll; Panax vietnamensis Ha et Grush. SUMMARY
Ngoe Linh ginseng, panacea tree, has been exhausted and on the verge o f extinction due to hunting aggressively To preserve and develop this precious species must study to help improve the quality o f material sources In this study, we surveyed most suitable conditions for the proliferation and synthesis o f secondary metabolites in Ngoe Linh ginseng callus, as well as found the correlation between the concentration o f chlorophyll pigments and saponin (secondary metabolite) in morphogenesis stage The most suitable concentration of sucrose for callus proliferation is 50 g/l Yellow LED light helps Ngoc Linh ginseng callus grow best and highest saponin synthesis Besides, the callus morphology showed that the amount o f chlorophyll increases leading to the increase o f saponin and vice versa Callus in lighting conditions produces saponin higher than in the dark.
Keyw ords: Callus; sucrose; saponin; chlorophyll; Panax vietnamensis Ha et Grushv. GIỚI THIỆU
Việt Nam quốc gia có nguồn thuốc dồi ỉruyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc iừ iâu đời Trong so đó, sâm Ngọc Linh lồi dược liệu quan tâm nghiên cứu bời tính thần dược Sâm Ngọc Linh có nhiều cơng dụng: chống stress vật lý, chống stress tâm lý trầm càm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa, phịng chổng ung íhư
Ginsenosides (saponin) đánh giá thành phần quan trọng tronq rễ nhân sâm Ngồi ra, nhân sâm cịn chứa nhiều thành phần khác như: chất chống oxi hóa, peptide, polysaccharide, acid béo vitamin Những kếỉ nghiên cứu, phân lập thành phần hóa học cơng bố kéo dài danh sách saponin sâm Ngọc Linh íên tổng cộng 52 loại Như vậy, sâm Việt Nam loại sâm có hàm ỉượng saponin nhiều the giới [6Ị Vì dược liệu quý nên sâm Ngọc Linh bị khai thác q mức, dường khơng cịn thấy ỉự nhiên Trước thực tế nhân giống sâm Ngọc Linh gặp nhiều khó khăn, nhằm góp phan giải phần nhỏ nguồn nguyên liệu khan hiếm, làm để cao hàm lượng saponin tích tụ mơ sẹo sâm Ngọc Linh ni cấy in viíro; tiếp số nghiên cứu trước ứng dụng thành công hệ thống phát sáng LED điều kiện in vitro, nghiên cứu điều kiện mơi trường ánh sang thích hợp cho việc tăng sinh, tổng hợp hợp chất thứ cấp saponin
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu
1.1 Ngùồn mẫu in vitro
Mô sẹo in vitro sâm Ngọc Linh iấy từ phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật (Viện Sinh học Nhỉẹt đới TP Hồ Chí Minh)
1.2 Mơi trường nuôi cấy
Môi trường MS [3] bổ sung 30 g/l đường sucrose; 8 g/i agar; mg/l 2,4-D 0,2 mg/l TDZ Môi trường điều chỉnh pH từ 5,7-5,8; hầp khử trùng 121°c 1atm 20 phút
1.3 Điều kiện nuôi cấy
Các binh mắu ổược nuôi cấy điều kiện độ ẩm 70-80%, nhiệt độ 22±2°c, thời gian chiếu sáng 12giờ/ngày.
2 Phương pháp
2.1 Khào sát anh hưởng nồng độ đường khác lên s ự phát triển mô sẹo sâm Ngộc Linh nuôi cấy in vitro
Các mẫu mô sẹo sâm Ngọc Linh có trọng íượng 0,2 g ni cấy mơi trường MS có bỗ sung 1 mg/í 2.4-D; 0,2 mg/l TDZ; 8 g/i agar Sau đó, bổ sung thêm vào môi trường nồng độ đường khác nhau: 30 g/í; 40 g/l; 50 g/l va 60 g/l Cac bình nuoi cấy sau đặí điều kiện anh sáng huỳnh quang Các tiều trọng lượng tươi mo sẹo sâm Ngọc Linh thu nhậri sau tuần
2.2 Khảo sát ảnh hường ánh sáng iên phát triền tổng hợp saponin mô sẹo sầm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Các mẫu mô sẹo sâm Ngọc Linh có trọng lượng 0,2 g ni cấy mơi trường MS có bổ sũng mg/i 2.4-D; 0,2 mg/l TDZ, 50 g/l sucrose, 8 g/l agar Các binh nuoi cấy sau đặt đieu kiẹn chiếu sáng khác nhau: ánh sáng Huỳnh quang, ánh sáng LED Xanh, ánh sáng LED Vàng ánh sáng LED Grow Light Các tiêu trọng lượng tươi, hàm íượng saponin, hàm lượng chlorophyll thu nhận sau tuần
2.3 Bước đầu đánh giá khả tổng hợp saponin tổng số sâm Ngọc LĨnh nuôi cay in vitro điều kiện sốc ánh sang
Các mẫu mơ sẹo sâm Ngọc Linh có trọng lượng 0,2 g ni cấy mơi trường MS có bổ sungl mg/l 2.4-D; 0,2 mg/l TDZ, 50 g/l sucrose, 8 g/ỉ agar Các bình ni cáy sau đặt điều kiện ánh sáng tốt thí nghiêm 2 nuôi cấy 6 tuần Sau tuần nuôi cấy ta tiến hành đưa Ỷ2 số mẫu vào điều kiện nuôi cấy không ánh sáng Các tiêu trọng iượng tươi, hàm lượng saponin, hàm lượng chlorophyll thu nhận sau tuần
Định lượng saponin chlorophyll mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấ y.,
* Định lượng saponin
(3)đến cắn thu chế phẩm saponỉn Hịa cắn vào 2ml methanol, hút xác 100 ụ\ vào ống nghiệm, cho tiếp 0,25 ml vanillin 8% cồn tuyệt đối 2,5 ml H2S04 72%, thêm methanol cho đủ ml, ủ 10 phút 60°c, sau đặt ống nghiệm tủ iạnh ở 2-8 c trong đến phút đo phổ hấp phụ bước sóng 546 nm (lặp lại lần)
Lượng saponin tơng đứợc tính theo cơng thức:
I i
x: Độ hấp thụ cùa mẫu (OD)
* Phương pháp đo chlorophyll [1]
Sau tuan nuôi cấy, nghiệm thức lấy 10 mẫu Mỗi mẫu cân 0,2 g mô sẹo đữợc nuôi cấy vả cắt nhuyễn Cho mẫu vào ống nghiệm, sau cho vào ống nghiệm 10 ml acetone 80% Đậy kín ống nghiệm, bọc giấy bạc xung quanh ống nghiệm, đặt vào chỗ toi ngày
Sau ngày, tiến hành đo mật độ quang ống nghiệm nghiệm thức phổ hấp thu 645nm 663 nm máy đo quang phổ
Tổng chlorophyll = Chi a + Chỉ b (mg/g lá).
Hàm lượng chlorophyll a b tính theo cơng thức sau:
Chi a (ma / a lốì = ((12,7 X Abs663) - (2,6 X Abs 645)) X 10ml Acetone 80%
' 9 9 ' mg A (trọng lượng mâu)
Chl b (mq / a lá) - ((22,9 X Abs645H4,68 X Abs663)) x1 Qml Acetone 80%
' - mg A (trọng lượng mẫu)
Phân tích xử lý số liệu: s ố iiệu thí nghiệm đươc phân tích thơ Microsoft Office Excel SPSS theo phương pháp Duncan [2] với mức độ tin cậy pá0,05
KẾT LUẬN
1 Khảo sát ảnh hưởng nòng độ đường khác lên pháỉ triển mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Nồng độ đường ban đầu có ảnh hưởng rắt nhiều đến tăng sinh nuôi cầy mô tế bào thực vật Việc tim nồng độ đường thích hợp cho q trình tăng sinh rriơ sẹo sâm Ngọc Linh nhằm góp phần phát sinh mơ sẹo tốt cho dược íiệu
Dưới ảnh hưởng cùa nồng độ đường khác nhau, tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh ni cấy in vitro sau tuần có khác biệt mặt thống kê (Bang 1)
Bảng Ảnh hường cùa nồng độ đường khác lên phát triển mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Với a, b, c, thể khác biệt theo phương pháp Duncan (1955) với độ tin cậy p s 0,05
Trong thí nghiệm tăng sinh cua mô sẹo sâm Ngọc Linh in vitro tốt nuôi cấy môi trương MS có nồng độ đường sucrose 50 g/i với trọng lượng tươi mo sẹo thu cao nhẩt (0,312 gX cao nồng độ đường sucrose 40 g/l (0,254 g) 30 g/í (0,234 g) Riêng nghiệm thức có nồng độ đường sucrose 60g/l tăng trường cùa mô sẹo không nhiều, với trọng iượng tươi thấp (0,230 g) Như vậy, cho thấy nồng độ đừờng sucrose ban đầu có tác đụng kích thích tăng sinh cho mô sẹo, nhừ nồng độ đường cao sê có tăng sinh mơ sẹo lớn Tuy nhiên, nồng độ sucrose cao (60 g/l) dẫn đến áp suất thẩm thấu vượt giới hạn cho phép tế bào, dẫn đến nước, vi thể ảnh hưởng xấu iên sinh trưởng chủng Như vậy, nồng đọ đường sucrose bổ sung vào môĩtrường 50 g/l ià thích hợp cho q trình tằng sinh mơ sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cáy in vitro Kết tương đong với đề tài nghiên cứu Nguyễn Thị Liễu vả cộng (2011) tìm nồng độ đường sucrose 5Ỏ g/l ỉả thích hợp cho tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh
Nghiệm thức
Nòng độ đường sucrose m
Trọng lượng tươi ứ
Đổi chứng 30 0,234 ± 0,02d
Đ40 40 0,254 ± 0,02b
Đ50 50 0,312 ±0,04c
Đ60 60 0,230 ±0,01 a
mÊmmm
mÊẸẵẫềệÊiÊmÊÊẫỀ
*ềm • ■ ";J J ,
(4)2 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng iên phát triển mô sẹo tổng hợp chất thứ cấp saponin sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vỉtro
2.1 Ảnh hưởng ánh sáng s ự tăng trưởng cùa mô sẹo sâm Ngọc Linh
ở nhiều loài thực vật, tác động lên hình thành tầng trưởng mơ sẹo ni cấy in vitro, ánh sáng cịn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp hợp chất thử cấp tế bào Vì vậy, việc tìm loạị ánh sáng thích hợp cho sinh sinh trường tổng hợp hợp chất saponin mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro việc làm cần thiết nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu tốt cho mục đích nghiên cứu, sản xuat chế phẩm saponin sau
Sau tuần nuôi cấy điều kiện ánh sáng, kết cho thấy mô sâm Ngọc Linh nuôi cấy ánh sáng LED vàng với trọng lượng tươi mô sẹo thu cao (0,336 g), cao nghiệm thức đối chứng đèn huỳnh quang (0,292 g) đèn LED xanh (0,27 g) Riêng nghiệm thức đèn Grow Light không thúc đẩy tăng sinh mô sẹo, có !ượng tươi cùa mơ sẹo íhấp (0,243 g)
(Bảng 2)
Bàng 2: Ảnh hưởng ánh sáng lên tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro sau tuần ni cấy
Nghiệm íhức Điều kiện ánh sánq Trọng iượng tươi (q) Đối chứnq Huỳnh quang 0,292 ± 0.01c
L1 LED Xanh 0,269 ±0,01b
12 LED Vànq 0,336 ± 0,02d
L3 LED Grow Light 0,243 ±0,01a Với a, b, c, d thể khác biệt với độ tin cậy theo phương pháp Duncan (1955) với độ tin cậy p < 0,05
Từ kết thí nghiệm cho thấy tăng sinh cùa mơ sẹo sâm Ngọc Linh đạt hiệu tốt nuôi cấy đèn LED vàng Điều tương đồng với nghiên cứu Ngô Thành Tàỉ (2013), ánh sáng vàng thúc đẩy việc tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh Tuy nhiên, ánh sáng đèn huỳnh quang LED xanh tác động tích cực lên tăng sinh mẫu cấy
2.2 Ảnh hường ánh sáng s ự tồng hợp saponin mơ sẹo sâm Ngọc Linh
Ngồi tác động lên sinh trưởng phát triển mồ sẹo thi ánh sáng tác động lên tổng hợp hợp chất thứ cấp Trong thí nghiệm này, vai trị ánh sáng đến tổng hợp saponin hàm lượng sắc tố mô sẹo sâm Ngọc Linh điều kiện ánh sáng khác thể bảng
Bảng 3: Ảnh hưởng ánh sáng lên tổng hợp chlorophyll saponin mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cầy in vitro sau tuần nuôi cạy
Nghiệm thức
Điêu kiện ánh sáng
Chlorophyll (mg/g mồ seo)
Saponin tống số (mg) Đối
chứng Huỳnh quang 0,100 ± 0,02c 25,75 ± 0,52c L1 LED Xanh 0,082 ± 0,01b 24,35 ± 0,63b L2 LED Vàng 0,152 ±0,01d 33,21 ± 0,67d L3 LED Grow light 0,045 ±0,01 a 16,47 ± 0,52a pháp Duncan (1955) với độ tin cậy p <0,05
Kết nghiên cứu cho thấy ánh sáng LED vàng thích hợp cho q trình tăng sinh mơ sẹo tồng hợp hàm lượng chlorophyll saponin mô sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Kết tương tự với nghiên cứu Dương Tấn Nhựt cộng từ năm 1996 đến năm 2007 [5] ứng dụng thành công hệ thống phát sáng LED điều kiện in vitro Những nghiên cứu giải phẫu học, quang hợp cũna chứng minh ni cấy hệ thong LED tốt so sánh với hệ ỉhống chiếu sáng đèn huỳnh quang
2.3 Mối tương quan hàm lượng sắc tố chlorophyll saponin mô sẹo sâm Ngọc Linh
(5)Biểu đồ 1: Tương quan chlorophyll saponin tổng số mô sẹo sầm Ngọc Unh sau tuần nuôi cấy cac
điều kiện chiếu sáng khác nhau
Biểu đồ 2: Sự tiPơng quan tuyến tính hàm iirợng cholorophyll saponin
Từ biểu đồ cho thấy tương quan tuyến tính chlorophyll saponin qua đường tuyén tính có phương trình y = 151,3x + 10,67; trị số R2 = 0,973 ià dấu hiệu cho mối liên hệ chlorophyll saponỉn chặt chẽ với nhau: chlorophyll tăng kéo theo saponin tăng
3 Bước đầu đánh giá khả tổng hợp saponin tổng sổ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro điều kiẹn sốc ánh sáng
Sau tuần nuôi cấy, khác biệt tổng hợp chlorophyll saponin 2 nghiệm thức ỉà khác
Bảng 4: Sự tăng sinh, tổng hợp hàm lượng chlorophyll saponin đièu kiện sốc ánh sáng
Nghiệm thức
Trọng lượng tươi (g)
Chlorophyll (mg/mg mô sẹo)
Saponin (mg) Tối 0,34 ± 0,01b 0,11 ±0,01b 16,05 ± 0,6b Sáng 0,35 ± 0,01a 0,21 ±0,01a 22,43 ±0,8a
Với a, b thể khác biệt theo phupwng pháp T-Test với độ tin cậy p is 0,05
Hình 3: Mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy điều kiện sốc ánh sáng ngày, a) Mó seo đèn LED
vàng; b) Mô sẹo
Từ bảng cho thấy mơ sẹo bị sốc ánh sáng đột ngột làm giảm hàm lượng saponin tổng sổ (16,05) sắc tố chlorophyll (0,11) so với điều kiện chiếu sáng với hâm lượng chlorophyll saponin tổng số thu 0,21 22,43
Một lần nữa, thấy chiếu sáng, mơ sẹo sâm Ngọc Linh tăng cường khả tổng hợp hàm lượng sắc tố chlorophyll tăng cường sinh tổng hợp chất thứ cấp saponin Điều khẳng định mổỉ tương quan tuyến tính hàm lượng sắc tố chlorophyll hợp chẩt thứ cấp saponin tổng hợp
ờ mơ ni cấy, có ba yếu tố ánh sáng tác động đến sinh trưởng, phát sinh hình íhái la bước sóng, cường độ thời gian chiếu sống Nếu ta tiến hành sốc ánh sáng, đưa mô sẹo sang điều kiện tối đột ngột sinh trưởng mơ sẹo bị klm hãm C hĩsố tăng trường cùa mô sẹo lẫn tổng hợp hàm iượng hợp chất thử cẩp saponin sắc tố chlorophyll trorig điều kiện chiếu sáng đèn LED vàng cao so với điều kiện tối
KẾT LUẬN
Nồng độ đường sucrose thích hợp bổ sung vào mơi trường cho q trình tăng sinh mô sẹo 50 g/i Ánh sáng cùa đèn LED vàng giúp cho mô sẹo sâm Ngọc Linh tăng trưởng tốt nhát tồng hợp saponin cao Mô sẹo giai đoạn phát sinh hlnh thái cho thấy khỉ chlorophyll tăng kéo theo saponin tăng, ngứợc lại Mo sẹo nuôi cấy điều kiện chiếu sang mang lại hàm lượng saponin cao so với tối
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Amon D., "Plant Physiology", 24, pp 1-15,1949 Duncan D.B "Multiple range and multiple F tests" Biometrics 11: pp 1-42.1995
3 Murashige T and Skoog F, "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tisue cultures", Physiology Plant, 15, pp 473 - 497,1962
4 Ngô Thanh Tải, "Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên sinh trường, phát triền sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro bước đầu trồng thử nghiệm Lâm Đồng Quảng Nam", Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Đà Lạỉ, tr 9-20, 2013
5 Nguyễn Thị Liễu, "Nghiên cửu khả ỉạo rễ bất định cùa sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis, Ha et Grushv) nuôi cấy in vitro", Tạp chi Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 27, 2011
http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/191102/1/9789