Phân tích ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê dạng hít sevoflurane

Với sự đồng ý của bệnh nhân và gia đình, bệnh nhân đã được lấy mẫu máu để tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen theo phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) nhằm phát hiện các [r]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC

VŨ THỊ THU HẰNG

PHÂN TÍCH CA LÂM SÀNG

TĂNG THÂN NHIỆT ÁC TÍNH TRONG PHẪU THUẬT TIM KHI SỬ DỤNG THUỐC

GÂY MÊ DẠNG HÍT SEVOFLURANE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: Vũ Thị Thu Hằng

PHÂN TÍCH CA LÂM SÀNG

TĂNG THÂN NHIỆT ÁC TÍNH TRONG PHẪU THUẬT TIM KHI SỬ DỤNG THUỐC

GÂY MÊ DẠNG HÍT SEVOFLURANE

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.Y.2015 Người hướng dẫn:

1 TS Vũ Thị Thơm

2 ThS.BS Nguyễn Thị Thúy Mậu

LỜI CẢM ƠN

Trong trình học tập thực khóa luận, tơi học hỏi nhiều kiến thức bổ ích nhận quan tâm, giúp đỡ thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình bạn bè

Lời đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược – Đại học Quốc gia Hà Nội Bộ môn Y dược học sở tạo điều kiện cho thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa giảng dạy, giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập năm qua

Tơi xin bày tỏ lịng thành kính biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Thơm ThS.BS Nguyễn Thị Thúy Mậu – người thầy, người hướng dẫn khoa học tận tình bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hồn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Y dược học sở quan tâm, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến bác sĩ nhân viên Trung tâm Tim mạch, Bệnh viện E giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho thực đề tài cách thuận lợi

Tơi xin gửi lời cảm ơn tình yêu thương sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè, người quan tâm, cổ vũ, động viên giúp đỡ năm tháng học tập nghiên cứu mái trường đại học

Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu Sự đóng góp bệnh nhân giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020 Sinh viên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Giải nghĩa

AMPA Thụ thể -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid

APTT Thời gian thromboplastin phần hoạt hóa (Activated partial thromboplastin time)

ATP Adenosine triphosphate Ca2+ Ion canxi

CAv1.1 Tiểu đơn vị alpha – 1S

CCD Bệnh lõi trung tâm (Central core disease) cDNA DNA bổ sung (Complementary DNA)

CK Creatine kinase

CK – MB Xét nghiệm Creatine kinase - MB Cl- Ion clorua

CNS Hệ thần kinh trung ương (Central nervous system) CYP2E1 Cytochrome P – 450 2E1

ddNTP Dideoxy nucleoside triphosphate DHPR Thụ thể dihydropyridine

DNA Acid deoxyribonucleic

ĐPQH Đồng phân quang học

EC Cặp kích thích – co (excitation – contraction)

EMHG Hội tăng thân nhiệt ác tính châu Âu (European malignant hyperthermia group)

emPCR PCR nhũ tương

ETCO2 Áp lực (nồng độ) CO2 cuối kỳ thở

FRC Dung tích cặn chức (Functional residual capacity) F- Ion florua

GABAA Thụ thể g – aminobutyric acid loại A Glu Glucose

Hb Hemoglobin Hct Hematocrit

HGMD Hệ liệu đột biến gen người (Database of human gene mutation data)

INDEL Đột biến thêm bớt (Insertion – deletion)

INR Xét nghiệm đánh giá mức độ hình thành cục máu đông (International normalized ratio)

K+ Ion Kali Lac Lactose

Mg2+ Ion magie

MmCD Bệnh multi – minicore Na+ Ion natri

NAMHG Hội tăng thân nhiệt ác tính Bắc Mỹ (North American malignant hyperthermia group)

NGS Giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing) NMDA Thụ thể N – methyl – D – aspartate

N2O Nitơ oxit

NYHA Hội Tim mạch Hoa Kỳ (New York Heart Association Functional Classification)

PaCO2 (pCO2)

Áp lực riêng phần khí CO2 máu động mạch

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) PharmGKB The pharmacogenomics knowledge base

pO2 Áp lực riêng phần khí O2 máu động mạch PT Thời gian prothrombin (Prothrombin time)

Qphred Điểm chất lượng Phred (Phred quality score) RNA Acid ribonucleic

RyR1 Thụ thể ryanodine

SMRT Giải trình tự gen tức thời đơn phân tử (Single Molecule Real Time)

SNP Đa hình đơn nucleotide (Single – nucleotide polymorphism) SO2 Khí lưu huỳnh dioxit

SR Hệ võng nội bào (Sarcoplasmic reticulum) TKTW Thần kinh trung ương

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên Bảng Trang

Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý số thuốc gây mê đường hô hấp

4

Bảng 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ thuốc gây mê đường hô hấp phế nang khả hấp thu thuốc từ phế nang vào máu

6

Bảng 1.3 Ảnh hưởng thuốc gây mê đường hô hấp số quan hệ quan

10

Bảng 1.4 Một số đặc điểm dược lý đặc trưng thuốc gây mê đường hô hấp

11

Bảng 1.5 Độc tính cấp tính mạn tính thuốc gây mê đường hô hấp

12

Bảng 1.6 Các tiêu chí dùng thang điểm lâm sàng cho bệnh TTNAT

18

Bảng 1.7 Xét nghiệm di truyền phân tử dùng chẩn đoán TTNAT

20

Bảng 1.8 Điều trị nguyên nhân điều trị triệu chứng đợt TTNAT cấp

21

Bảng 1.9 Cấu trúc hóa học đặc tính dược động học dantrolene

22

Bảng 1.10 Một số kỹ thuật giải trình tự phương pháp tổng hợp (SBS)

27

Bảng 2.1 Mối liên hệ điểm chất lượng Phred với khả mắc lỗi đọc bazơ tính xác lần đọc

Bảng 3.1 Giá trị số số cận lâm sàng bất thường bệnh nhân ngày nhập viện

33

Bảng 3.2 Kết xét nghiệm khí máu động mạch điện giải bệnh nhân thời điểm bắt đầu xảy phản ứng TTNAT

35

Bảng 3.3 Các biến thể RYR1 xuất lần 770 gia đình nghiên cứu Anh

44

Bảng 3.4 Các miền cấu trúc thụ thể Ryanodine phân tích theo phương pháp đơng lạnh mẫu thử dùng kính hiển vi điện tử (Cryo – EM)

46

Bảng 3.5 Các biến thể CACNA1S có ý nghĩa lâm sàng bệnh TTNAT

48

Bảng 3.6 Các biến thể STAC3 có ý nghĩa lâm sàng bệnh TTNAT

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên Hình Trang

Hình 1.1 Q trình phóng thích bắt lại Ca2+ võng nội bào tương bào vân

16

Hình 1.2 Biểu lâm sàng đặc trưng bệnh TTNAT 17

Hình 1.3 Quy trình giải trình tự Sanger 26

Hình 3.1 Phẫu thuật thay van tim bệnh nhân 34 Hình 3.2 A: Điểm đột biến (c7048G >A, p.Ala2350Thr) gen

RYR1 bệnh nhân xác định trình tự Sanger B: So sánh cấu trúc bậc phân tử protein RyR1 lồi: người (XM011527205), bị (NM001206777), lợn (NM001001534), thỏ (NM001101718) chuột (AY268935)

38

Hình 3.3 Cấu trúc thụ thể Ryanodine 47

Hình 3.4 Biểu diễn tuyến tính chuỗi acid amin protein ryanodine với đột biến biết liên quan đến số bệnh xương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG TỔNG QUAN

1.1 Thuốc gây mê đường hô hấp dùng phẫu thuật

1.1.1 Lịch sử đời thuốc gây mê đường hô hấp

1.1.2 Định nghĩa, phân loại vai trò thuốc gây mê đường hô hấp

1.1.3 Đặc điểm thuốc gây mê đường hô hấp

1.2 Phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 13

1.2.1 Định nghĩa 13

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ học phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 14

1.2.3 Sinh lý bệnh tăng thân nhiệt ác tính 15

1.2.4 Biểu lâm sàng, chẩn đoán điều trị tăng thân nhiệt ác tính 17

1.3 Phương pháp giải trình tự gen hệ (NGS) 23

1.3.1 Lịch sử phát triển 23

1.3.2 Khái niệm ứng dụng cơng nghệ giải trình tự 24

1.3.3 NGS qua hệ 25

1.3.4 Hạn chế NGS 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Phương pháp thu thập liệu lâm sàng, cận lâm sàng 31

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 31

2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Kết lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân 33

3.2 Kết phân tích gen bệnh nhân 37

3.3 Bàn luận 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc gây mê đường hô hấp loại thuốc sử dụng gây mê cân đại, gây mê phẫu thuật giảm đau [32, 42] Các thuốc gây mê đường hô hấp halogen kể đến halothane, enflurane, isoflurane, sevoflurane desflurane Hầu hết thuốc có tác dụng mạnh với số điều trị dao động từ đến 4, vậy, việc sử dụng thuốc địi hỏi kiến thức tính chất hóa lý, dược động học tác dụng thuốc quan hệ quan khác nhằm ngăn ngừa tác dụng phụ Các tác dụng phụ xảy hệ thần kinh trung ương, hệ hô hấp, tim mạch, tác động cơ, gây nhiều hội chứng bệnh lý khác nhau, có Tăng thân nhiệt ác tính – tác dụng phụ gặp gây mê toàn thân [32]

Tăng thân nhiệt ác tính (TTNAT) rối loạn gen liên quan đến thuốc (pharmacogenetic) hệ xương liên quan đến tăng chuyển hóa kiểm sốt, xảy trình phẫu thuật sau phẫu thuật bệnh nhân nhạy cảm với thuốc gây mê đường hô hấp và/hoặc thuốc giãn [25, 26] Được mô tả lần vào năm 1960, TTNAT trở thành nguyên nhân gây tử vong gây mê kể từ năm đầu kỷ 20 Phản ứng TTNAT xảy với tỉ lệ dao động từ 1:15000 – 1:75000 dân tộc giới, nhiên, tỉ lệ mắc bất thường mặt di truyền 400 cá thể [23, 25] Các nghiên cứu phản ứng liên quan đến biến thể gây bệnh gen RYR1, CACNA1S STAC3, xác định xét nghiệm di truyền phân tử với cơng nghệ giải trình tự gen hệ Từ cho phép sàng lọc nhanh chóng hiệu nhóm bệnh nhân cho biến thể liên quan đến TTNAT đồng thời làm sở cho chẩn đoán [6, 23] Tại Việt Nam, ca lâm sàng nghiên cứu trường hợp TTNAT xảy vòng mười năm qua

2

nhiệt độ thể nhanh chóng Các tiến triển xấu TTNAT kể đến suy thận cấp, loạn nhịp tim, đông máu nội mạch lan tỏa, khơng kiểm sốt điều trị kịp thời gây tử vong bệnh nhân [67] Chính mức độ nguy hiểm phản ứng này, việc chẩn đoán điều trị TTNAT cần thiết gây mê phẫu thuật bệnh nhân có biểu TTNAT, đặc biệt có báo cáo tiền sử TTNAT gia đình Hiện nay, thuốc dantrolene thuốc đặc trị đưa vào phác đồ điều trị phản ứng TTNAT bên cạnh biện pháp hỗ trợ điều trị khác Tuy nhiên, tất bệnh nhân xuất phản ứng TTNAT điều trị kịp thời thuốc dantrolene Điều xảy vùng nơng thơn, vùng phát triển thiếu điều kiện chăm sóc y tế quốc gia khơng có sẵn thuốc dantrolene Chính vậy, kinh nghiệm điều trị phản ứng TTNAT không sử dụng dantrolene cần thiết Bên cạnh đó, việc tiến hành xét nghiệm di truyền phân tử phương pháp giải trình tự gen hệ đóng vai trị quan trọng việc chẩn đoán TTNAT nhằm phát biến thể di truyền có liên quan đến phản ứng

Với mục đích đưa cơng nghệ giải trình tự gen hệ ứng dụng phân tích gen bệnh nhân xuất phản ứng TTNAT, thực đề tài: “Phân tích ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính phẫu thuật tim sử dụng thuốc gây mê dạng hít sevoflurane” với hai mục tiêu sau:

1 Tổng quan nguyên nhân, chế bệnh lý tăng thân nhiệt ác tính phẫu thuật thay van hai sử dụng thuốc gây mê đường hơ hấp Ứng dụng giải trình tự gen hệ đánh giá kết

3

CHƯƠNG TỔNG QUAN

1.1 Thuốc gây mê đường hô hấp dùng phẫu thuật 1.1.1 Lịch sử đời thuốc gây mê đường hô hấp

Câu chuyện thuốc gây mê đường hô hấp bắt đầu ether tổng hợp lần vào năm 1540, sau nitơ oxit (N2O – khí cười) ghi nhận có khả gây mê [37, 40] Mặc dù vậy, N2O ether không sử dụng gây mê phẫu thuật kỷ 19, nhờ William Morton chứng minh tính chất gây mê diethyl ether vào năm 1846 [32, 37] Lần lượt thuốc gây mê bao gồm ether, N2O, chloroform, ethylene, cyclopropane, trichloroethylene divinyl ether đưa vào thực hành lâm sàng Tuy nhiên, số thuốc bị ngừng sử dụng có mùi khó chịu, dễ cháy nổ, biên độ an toàn hẹp gây nhiều tác dụng phụ [3, 40] Vào năm 1950, fluroxene – tác nhân flo hóa đưa vào thử nghiệm lâm sàng Fluroxene có khả gây mê tốt động vật thí nghiệm bị thu hồi vào năm 1974 nguy gây cháy nổ thuốc Theo sau đó, thuốc gây mê gồm halothane, methoxyflurane, enflurane, isoflurane, sevoflurane desflurane tổng hợp, mở cách mạng thuốc gây mê halogen hóa [32, 37]

Hiện nay, vai trò nitơ oxit gây mê cân đại gây tranh cãi [32] Các thuốc gây mê halogen sử dụng phổ biến isoflurane, sevoflurane, desflurane Ngoài ra, xenon – loại khí gây mê lý tưởng nghiên cứu thử nghiệm vào năm 1951 Tuy nhiên, chi phí sản xuất lớn nên việc sử dụng thuốc hạn chế [3, 43]

1.1.2 Định nghĩa, phân loại vai trị thuốc gây mê đường hơ hấp

4

duy trì chức sống (tuần hồn, hơ hấp, chuyển hóa, tiết…) Trước trình phẫu thuật, bác sĩ gây mê kiểm sốt liên tục chức hơ hấp đường thở bệnh nhân Điều cho phép bác sĩ thực phẫu thuật mà không gây đau đớn chấn thương tinh thần bệnh nhân Nhiều ca phẫu thuật thực bệnh nhân không gây mê phẫu thuật tim, ghép tạng thay khớp [68]

1.1.3 Đặc điểm thuốc gây mê đường hô hấp 1.1.3.1 Cấu trúc hóa học, đặc tính vật lý

Mỗi thuốc gây mê đường hơ hấp có đặc tính hóa học cấu trúc hóa học, trọng lượng phân tử số tính chất vật lý đặc trưng riêng cho loại như điểm sôi, tỷ trọng chất lỏng, áp suất Bảng 1.1 tổng hợp đặc tính hóa học vật lý số thuốc gây mê đường hô hấp halothane, enflurane, isoflurane, desflurane, sevoflurane nitơ oxit

Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý số thuốc gây mê đường hô hấp [1, 32]

Tên thuốc Cấu trúc hóa học

Trọng lượng phân

tử

Điểm sôi °C ( 760

mmHg)

Tỷ trọng chất lỏng (g/

mL) (25°C/

4°C)

Áp suất (mmHg) ở 24/ 25°C

ở 20°C

Halothane 197,5 49 – 51 1,86 288 243

5

Isoflurane 184,5 48,5 1,50 295 238

Desflurane 168,04 22,8 1,50 798 669

Sevoflurane 200,05 58,6 1,53 197 157

Nitơ oxit N2O 44,02 -88,5 44,8 39,8

Thuốc gây mê dễ bay (halothane, enflurane, isoflurane, desflurane, sevoflurane) có áp suất thấp, điểm sơi cao, dễ hóa lỏng nhiệt độ phịng (20°C) Thuốc gây mê dạng khí (N2O, xenon) có áp suất cao, nhiệt độ sơi thấp tồn dạng khí nhiệt độ phòng [68] Áp suất riêng phần isoflurane sevoflurane nhiệt độ môi trường đủ để đạt nồng độ thích hợp cho sử dụng lâm sàng với bình xịt thơng thường Áp suất riêng phần desflurane cao (Bảng 1.1), địi hỏi sử dụng máy hóa riêng mà máy hóa này, desflurane làm nóng để đạt áp suất 1400 mmHgvà áp suất điều chỉnh hai điện trở biến thiên N2O tồn thể khí áp suất nhiệt độ mơi trường, phân phối qua đồng hồ lưu lượng [32]

Bên cạnh áp suất nhiệt độ sơi, độ hịa tan yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến dược động học thuốc gây mê đường hơ hấp Desflurane có cấu trúc hóa học khác với isoflurane gốc carbon  - ethyl gắn với flo thay cho clo Tương tự sevoflurane halogen hóa với flo Chính thay làm độ hịa tan máu desflurane sevoflurane thấp isoflurane, gần độ hòa tan N2O [10]

6

điều trị mô CNS Nồng độ vị trí ảnh hưởng có liên quan đến áp suất riêng phần tác nhân gây mê CNS, biểu thị trạng thái cân nồng độ phế nang Ngồi cịn liên quan đến khả hấp thu thuốc từ phổi với độ hịa tan đặc tính quan trọng động học thuốc gây mê đường hô hấp [32, 66]

1.1.3.2 Đặc điểm dược động học

Yếu tố ảnh hưởng đến hấp thu giải phóng thuốc gây mê đường hơ hấp

Các thuốc gây mê đường hô hấp đưa vào thể qua trao đổi khí phế nang phổi Sự hấp thu thuốc từ phế nang vào máu phân phối vào vị trí cảm ứng CNS yếu tố quan trọng định dược động học thuốc Về chất, hấp thu giải phóng thuốc gây mê dạng hít phụ thuộc vào nồng độ thuốc phế nang khả hấp thu thuốc từ phế nang vào máu tuần hoàn phổi Hai yếu tố trình bày Bảng 1.2 [42, 43]

Bảng 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ thuốc gây mê đường hô hấp trong phế nang khả hấp thu thuốc từ phế nang vào máu [43] Nồng độ thuốc

phế nang

Khả hấp thu thuốc từ phế nang vào máu

(1) Nồng độ hít vào thuốc: Nồng độ thuốc gây mê phế nang (FA) thay đổi phụ thuộc vào nồng độ thuốc hít vào (FI) FI lớn, FA tăng nhanh

7 khởi mê

nhanh

(2) Thơng khí phế nang: Tăng thơng khí phế nang làm tăng áp suất riêng phần thuốc phế nang, dẫn đến gia tăng FA, tỉ lệ FA/ FI tăng nhanh (~ 1) tốc độ khởi mê nhanh

(3) Dung tích cặn chức (FRC): Một phần FRC làm lỗng nồng độ thuốc hít vào, áp suất riêng phần thuốc giảm, dẫn đến tốc độ khởi mê chậm

phụ thuộc vào nồng độ thành phần huyết như: albumin, globulin, triglyceride cholesterol Các phân tử liên kết với phân tử thuốc gây mê, làm tăng độ hòa tan thuốc máu

(2) Lưu lượng máu qua phổi (cung lượng tim): Nếu khơng có shunt, lưu lượng máu qua phổi cung lượng tim Cung lượng tim cao dẫn đến khả hấp thu thuốc gây mê từ phế nang vào máu lớn phân phối nhanh đến mô bao gồm hệ TKTW

(3) Chênh lệch áp suất riêng phần thuốc gây mê phế nang tĩnh mạch: Sự hấp thu thuốc gây mê mô gây khác biệt áp suất riêng phần thuốc phế nang tĩnh mạch Sự chênh lệch lớn, thời gian khởi mê chậm

(4) Hiệu ứng thuốc thứ hai: Khi phối hợp N2O thuốc gây mê đường hô hấp khác, khả hấp thu từ phế nang vào máu N2O cao, làm tăng áp suất riêng phần thuốc sử dụng đồng thời Tỉ lệ FA/ FI tăng làm tốc độ khởi mê tăng

Phân bố

8

Desflurane hịa tan máu mơ so với halothane, isoflurane, sevoflurane (hệ số phân bố mô/máu thấp) Chính vậy, nồng độ desflurane máu tăng nhanh trình gây mê giảm nhanh phế nang đào thải Ngoài ra, cân nồng độ desflurane mô máu diễn nhanh giúp kiểm soát nồng độ thuốc phế nang xác q trình trì gây mê [10]

Chuyển hóa

Thuốc gây mê đường hô hấp loại bỏ chủ yếu thông khí, chuyển hóa mức độ nhỏ Chính vậy, trao đổi chất thuốc khơng đóng vai trị quan trọng việc ngừng tác dụng thuốc mà liên quan tới độc tính thuốc gây Chuyển hóa gan nhờ hệ thống CYP2E1 góp phần loại bỏ số thuốc mê bay hơi, halothane thải trừ nhanh so với enflurane q trình hồi phục Về mức độ chuyển hóa gan, thứ tự xếp thuốc sau: halothane > enflurane > sevoflurane > isoflurane > desflurane > N2O (Bảng 1.4) [43]

Thải trừ

Ngược lại với trình hấp thu ban đầu, sau ngừng gây mê, áp lực riêng phần thuốc gây mê phế nang mô giảm Thuốc mê thải trừ chủ yếu qua đường hô hấp (thở ra) thể bước vào giai đoạn hồi phục sau gây mê Thời gian hồi phục sau gây mê phụ thuộc vào tốc độ loại bỏ thuốc khỏi não Tốc độ thải trừ halothane isoflurane chậm so với N2O, desflurane sevoflurane halothane hịa tan gấp đơi mơ não tan máu gấp năm lần so với N2O desflurane Sự tăng tích lũy halothane isoflurane cơ, da mỡ gây mê kéo dài (đặc biệt bệnh nhân béo phì) làm trình hồi phục sau gây mê chậm [43, 68]

9

Trong trình nghiên cứu cách thức hoạt động thuốc gây mê halogen hóa, nhà nghiên cứu đưa giả thuyết thụ thể tế bào thần kinh đóng vai trị quan trọng chế tác dụng thuốc [29] Trải qua vài thập kỉ, chế hoạt động thuốc gây mê dễ bay thụ thể g – aminobutyric loại A (GABAA) khí gây mê (N2O, xenon) ức chế thụ thể N – methyl – D – aspartate xác định Ngồi ra, số thuốc gây mê dạng hít khác gây tác dụng cách ức chế kênh ion kích thích, thụ thể nicotinic glutamate thần kinh [43, 66] Cụ thể, thuốc gây mê đường hô hấp ức chế hoạt động kích thích kênh trước synap, thông qua thụ thể nicotinic, serotonergics glutaminergic Đồng thời, phân tử thuốc làm tăng hoạt động ức chế kênh sau synap qua thụ thể GABAA, glycine, AMPD NMDA, gây ảnh hưởng đến việc giải phóng chất dẫn truyền thần kinh, gây giảm dẫn truyền thần kinh qua khớp thần kinh [66]

Kênh kali hai lỗ hệ TKTW đóng vai trị định chế gây mê thuốc gây mê đường hô hấp Các kênh phân phối rộng rãi CNS, tồn trước sau synap Halothane, isoflurane, sevoflurane desflurane xác định làm tăng cường hoạt động kênh này, dẫn đến siêu phân cực màng tế bào, gây ảnh hưởng đến khả tạo hoạt động thần kinh góp phần giải thích hiệu gây mê thuốc [43]

10

Bảng 1.3 Ảnh hưởng thuốc gây mê đường hô hấp số quan và hệ quan [43, 68]

Cơ quan hệ quan

Ảnh hưởng thuốc gây mê đường hô hấp

Hệ TKTW Với giá trị MAC thấp (0,2 – 0,4), thuốc gây ức chế thần kinh gây bất động, trí nhớ, ngăn chặn hình thành ý thức vỏ não, đồi thị hệ thống kích hoạt dạng lưới Ngồi ra, thuốc gây mê halogen làm giảm tốc độ trao đổi chất não (CMR) Lưu lượng máu não (CBF) tăng, giảm khơng đổi (phụ thuộc vào MAC) Ngoại trừ halothane, số thuốc gây mê halogen khác có tác dụng giảm đau

Hệ tim mạch Thuốc làmgiảm cung lượng tim khả co bóp tim bình thường; gây giảm áp lực trung bình máu động mạch phụ thuộc liều gây giãn mạch hệ thống Nhìn chung thuốc gây kích thích hệ thần kinh tự chủ gây tăng nhịp tim, halothane, enflurane, sevoflurane ảnh hưởng đến nhịp tim desflurane, isoflurane làm tăng nhịp tim đáng kể

Hệ hơ hấp Thuốc làm giảm thơng khí dẫn đến tăng áp lực CO2 máu động mạch (PaCO2), dẫn đến suy hô hấp Isoflurane desflurane gây kích thích đường thở (ho khó thở) nên khơng sử dụng bệnh nhân bị co thắt phế quản

Gan, thận

Ở thận, thuốc làm giảm tốc độ lọc cầu thận (GFR) lưu lượng nước tiểu không đáng kể, thường hồi phục sau gây mê

11

Thuốc gây mê đường hô hấp gây giảm trương lực phụ thuộc liều, thuốc gây mê halogen làm giãn tử cung mạnh

Bảng 1.4 trình bày đặc điểm dược lý đặc trưng số thuốc gây mê dạng hít Hầu hết thuốc có tác dụng mạnh với số điều trị dao động từ đến 4, vậy, việc sử dụng chúng địi hỏi kiến thức tính chất hóa lý, dược động học dược lực học chúng hệ thống khác để phát huy tác dụng ngăn ngừa tác dụng phụ [32]

Bảng 1.4 Một số đặc điểm dược lý đặc trưng thuốc gây mê đường hô hấp [3]

Tên thuốc Hệ số phân

bố máu/

khí

Hệ số phân

bố não/ máu

MAC (%)2

Chuyển hóa

Đặc điểm đặc trưng

N2O 0,47 1,1 > 100 Thường dùng phối hợp với thuốc gây mê đường hô hấp mạnh để đạt hiệu ứng khí thứ Khởi phát phục hồi nhanh chóng

Halothane 2,35 1,9 0,75 > 40% Tốc độ khởi phát phục hồi trung bình

Enflurane 1,91 1,3 1,7 8% Tốc độ khởi phát phục hồi trung bình

12

phát phục hồi tương đối chậm

Desflurane 0,42 1,3 – < 0,05% Khởi phát phục hồi nhanh Mùi hăng gây kích thích đường thở nên khơng thích hợp để gây mê

Sevoflurane 0,63 1,7 2,0 – 5% (fluoride)

Thuốc gây mê đường hô hấp sử dụng phổ biến Khởi phát phục hồi nhanh chóng Khơng có mùi hăng nên thích hợp để gây mê

Tác dụng phụ độc tính thuốc gây mê dạng hít

Tác dụng phụ độc tính thuốc gây mê đường hơ hấp bao gồm nhiễm độc thận, nhiễm độc gan, nhiễm độc thần kinh, tình trạng sốc gây mê, rối loạn nhịp tim, hạ huyết áp, buồn nôn nôn sau phẫu thuật (PONV), ức chế kích thích hơ hấp, tăng thân nhiệt ác tính, kích thích sau sinh, dị ứng sốc phản vệ [27] Các biến cố xảy thời gian phẫu thuật sau kết thúc phẫu thuật Độc tính cấp tính mạn tính thuốc gây mê đường hơ hấp trình bày Bảng 1.5

Bảng 1.5 Độc tính cấp tính mạn tính thuốc gây mê đường hơ hấp [68]

Độc tính cấp tính Độc tính mạn tính

(1) Nhiễm độc thận: Q trình chuyển hóa enflurane sevoflurane tạo hợp chất gây độc cho thận Khi tiếp xúc với enflurane kéo dài, ion florua giải phóng gây nhiễm độc thận Sevoflurane bị phân hủy bới chất hấp

13

phụ CO2 máy gây mê, tạo thành hợp chất vinyl ether (hợp chất A) Hợp chất gây hoại tử ống thận chuột, chưa có báo cáo người (2) Nhiễm độc máu: Tiếp xúc kéo dài với N2O làm

giảm tổng hợp methionine, gây thiếu máu megoloblastic Ngoài ra, tương tác thuốc gây mê dạng hít (desflurane) với chất hấp phụ CO2 khơ tạo khí CO CO liên kết với hemoglobin làm giảm cung cấp O2 tới mô thể (3) Nhiễm độc gan: Tỉ lệ nhiễm độc gan nặng sau

tiếp xúc với halothane ước tính nằm khoảng 1:20000 – 35000 với chế chưa rõ ràng (4) Tăng thân nhiệt ác tính

người Tuy nhiên, số trường hợp sử dụng thuốc gây mê phẫu thuật không liên quan đến thai nhi phụ nữ có thai làm tăng nguy phá thai

(2) Gây ung thư: Các nghiên cứu dịch tễ tỉ lệ mắc bệnh ung thư gia tăng nhân viên phẫu thuật, người tiếp xúc với thuốc gây mê Tuy nhiên, khơng có nghiên cứu giải thích gia tăng

Đa số thuốc gây mê đường hơ hấp tương đối lành tính bệnh nhân xảy phản ứng bất lợi cấp tính, ngoại trừ phản ứng TTNAT Trước đây, halothane tác nhân phổ biến gây phản ứng Tuy nhiên nay, báo cáo cho thấy tất thuốc gây mê lỏng dễ bay gây phản ứng TTNAT, trình bày cụ thể phần [6]

1.2 Phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 1.2.1 Định nghĩa

14

TTNAT Ngoài ra, số nghiên cứu bệnh nhược người Mỹ địa (Native American myopathy) liên quan đến tính nhạy cảm với TTNAT [25] 1.2.2 Đặc điểm dịch tễ học phản ứng tăng thân nhiệt ác tính

1.2.2.1 Tình hình phản ứng tăng thân nhiệt ác tính giới

Phản ứng TTNAT xảy với tỉ lệ dao động từ 1:15000 – 1:75000, xuất lần bệnh nhân tiếp xúc với tác nhân gây mê TTNAT xuất nam giới thường xuyên so với nữ giới với tỉ lệ xấp xỉ 2:1 Số liệu thu thập đơn vị TTNAT Leeds từ năm 1990 – 2014 kết xét nghiệm dương tính với TTNAT nam giới (42%) cao so với nữ (37%) Điều ngẫu nhiên nam giới cần can thiệp phẫu thuật nhiều nữ giới can thiệp lâm sàng nam nhạy cảm với TTNAT nữ [23, 25]

Tính nhạy cảm với TTNAT xuất cá nhân đến từ tất nhóm dân tộc giới (Châu Á, Châu Âu, Trung Đông Châu Phi) với lứa tuổi khác (từ sáu tháng tuổi đến 78 tuổi) Tỷ lệ mắc bệnh cao người trẻ tuổi với độ tuổi trung bình bệnh nhân trải qua phản ứng TTNAT 18,3 tuổi Trong đó, trẻ em 15 tuổi chiếm 52,1% trường hợp

Vào cuối năm 1970, sau giới thiệu thuốc đặc trị TTNAT (dantrolene), tỷ lệ tử vong TTNAT giảm từ 80% xuống 5% Tuy nhiên, thập kỷ kỷ 21, tỷ lệ tử vong tăng lên 14% [23, 25] Mặc dù tỉ lệ xuất TTNAT thấp tỉ lệ mắc bất thường mặt di truyền liên quan đến tính nhạy cảm với TTNAT khoảng 1:2000 – 1:3000 [23, 80], với ước tính gần 400 cá thể [11] Các báo cáo TTNAT không xảy người, mà cịn mơ tả số lồi động vật khác lợn, ngựa, chó [25]

15

Tại Việt Nam, vòng 10 năm qua ghi nhận ca lâm sàng phản ứng TTNAT phát điều trị Bệnh viện E, trình bày phân tích Chương II Chương III

1.2.3 Sinh lý bệnh tăng thân nhiệt ác tính

16

Hình 1.1 Q trình phóng thích bắt lại Ca2+ võng nội bào tương

bào vân [81]

17

thân nhiệt tiêu vân có xu hướng gây đông máu nội mạch lan tỏa (DIC) [25, 39, 81]

1.2.4 Biểu lâm sàng, chẩn đoán điều trị tăng thân nhiệt ác tính 1.2.4.1 Biểu lâm sàng

TTNAT xảy thời điểm trình gây mê vòng hay lâu sau chấm dứt trình gây mê Dấu hiệu sớm nhịp tim nhanh, tăng nồng độ CO2 cuối kỳ thở (ETCO2) kèm theo cứng Nếu succinylcholine sử dụng trình gây mê biểu lâm sàng diễn nhanh chóng hơn, tăng huyết áp, tăng nhiệt độ rõ rệt rối loạn nhịp tim diễn vòng đến 10 phút [25]

Trong hầu hết trường hợp, biểu TTNAT thường xảy phòng mổ Dấu hiệu ban đầu điển hình thường ETCO2 tăng, nhịp tim nhanh, sau huyết áp tăng thường liên quan đến rối loạn nhịp thất gây kích thích hệ thống thần kinh giao cảm từ việc tăng nồng độ CO2 máu, nhiễm toan chuyển hóa Sau đó, bệnh nhân có biểu cứng cơ, tăng trương lực nhiệt độ thể tăng 1-2o sau phút Nếu không điều trị kịp thời, thiếu máu tim tiêu vân dẫn đến tăng K+ máu, myoglobin niệu dẫn đến suy thận cấp biểu nước tiểu màu cola DIC [23, 25] Một số rối loạn lâm sàng phổ biến tổng kết Hình 1.2

Hình 1.2 Biểu lâm sàng đặc trưng bệnh TTNAT [26]

Tăng nồng độ Ca2+ nội bào vân

Tăng chuyển hóa

Tăng huyết áp

Giảm oxy máu

Nhịp tim nhanh Toan chuyển hóa

Cạn kiệt ATP Tăng thân nhiệt

Tiêu vân

Tăng nồng độ CK K+ huyết

Loạn nhịp tim Thiếu máu cục

18 1.2.4.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Việc chẩn đoán TTNAT dựa biểu lâm sàng thử nghiệm phịng thí nghiệm Những đặc trưng quan trọng chẩn đốn TTNAT gia tăng khơng giải thích nồng độ ETCO2, cứng cơ, nhịp tim nhanh, toan chuyển hóa, tăng thân nhiệt tăng K+ máu Sự thay đổi thứ tự thời điểm xuất biểu làm cho chẩn đốn lâm sàng khó khăn [25]

Thang điểm lâm sàng

Thang điểm lâm sàng xây dựng Larach cộng để hỗ trợ cho chẩn đoán lâm sàng Các yếu tố liệt kê Bảng 1.6 Mỗi yếu tố cho số điểm khác Tuy nhiên, thang điểm thiếu độ nhạy yếu tố kiểm tra ca bệnh [25] Tổng cộng 50 điểm chắn TTNAT, tổng cộng từ 35-49 TTNAT

Bảng 1.6 Các tiêu chí dùng thang điểm lâm sàng cho bệnh TTNAT [46]

Quá trình Biểu Điểm

1 Độ cứng

a Cứng tổng quát (khơng có rung hạ thân nhiệt, sau dùng thuốc gây mê dạng hít)

15

b Co thắt Masseter sau dùng succinylcholine 15 Suy

nhược bắp

a Tăng CK > 20000 IU sau dùng thuốc mê có succinylcholine

15

b Tăng CK > 10000 IU sau dùng thuốc mê khơng có succinylcholine

15

c Nước tiểu màu cola giai đoạn phẫu thuật 10 d Myoglobin nước tiểu > 60 μg/L

19

f K+ máu /huyết tương/huyết > mEq/L (khơng có suy thận)

3

3 Nhiễm toan hô hấp

a PETCO2 > 55 mmHg với lọc máu dưỡng khí kiểm sốt tốt

15

b PaCO2 động mạch > 60 mmHg với lọc máu dưỡng khí kiểm sốt tốt

15

c PETCO2 > 60 mmHg với lọc máu dưỡng khí tự phát 15 d PaCO2động mạch > 65 mmHg với lọc máu dưỡng khí tự phát

15

e Tăng CO2 máu bất thường 15

f Thở nhanh bất thường 10

4 Tăng thân nhiệt

a Tăng thân nhiệt nhanh bất thường 15

b Tăng thân nhiệt bất thường > 38,8°C (101,8°F) giai đoạn phẫu thuật

10

5 Liên quan tim

a Nhịp xoang nhanh bất thường

b Nhịp tim nhanh rung tâm thất

Phương pháp chẩn đốn phịng thí nghiệm Thí nghiệm co rút

20

khi kết thí nghiệm dương tính biểu thị MHS(h) MHS(c) Protocol NAMHG tương tự có khác biệt nồng độ sử dụng số thông số Protocol EMHG đạt độ nhạy 99% độ đặc hiệu 94%; NAMHG 97% 78% Độ đặc hiệu thí nghiệm bị ảnh hưởng rối loạn thần kinh không liên quan đến TTNAT [25]

IVCT đắt đỏ, thực trung tâm thử nghiệm chuyên biệt thu kết dương tính giả âm tính giả [25]

Xét nghiệm di truyền phân tử

Giải trình tự DNA mang đến phương án thay cho IVCT, yêu cầu mẫu máu Trong giải trình tự DNA truyền thống tốn nhiều thời gian công sức, xuất giải trình tự gen hệ (NGS) cung cấp cơng cụ nhanh, suất cao với chi phí hiệu cho chẩn đốn tìm kiếm biến thể Bảng 1.7 Xét nghiệm di truyền phân tử dùng chẩn đoán TTNAT [26]

Gen Tỷ lệ TTNAT được quy cho biến thể gây bệnh

trong gen

Tỷ lệ biến thể gây bệnh phát bằng phương pháp

Phân tích trình tự Phân tích xóa/sao chép gen đích

CACNA1S ~1% ~100% Chưa biết

RYR1 50%-60% ~100% họ

STAC3 <1% ~100% Chưa biết

Chưa biết Tới 40% Chưa có liệu

21

nhằm phát biến thể liên quan đến TTNAT, hỗ trợ chẩn đốn phịng ngừa đợt TTNAT [25]

1.2.4.3 Biện pháp điều trị thuốc dantrolene Biện pháp điều trị

Điều trị TTNAT thực cách sử dụng kịp thời dantrolene, làm mát thể bệnh nhân đến nhiệt độ khơng q 38,50C, giảm thơng khí biện pháp hỗ trợ khác (Bảng 1.8)

Bảng 1.8 Điều trị nguyên nhân điều trị triệu chứng đợt TTNAT cấp [23, 81]

Điều trị nguyên nhân Điều trị triệu chứng Dừng tác nhân gây TTNAT

(thuốc gây mê dễ bay succinylcholine), ngắt kết nối với máy hóa

Thơng báo cho bác sĩ phẫu thuật để kết thúc phẫu thuật sớm tốt Nếu phẫu thuật dừng lại, sử dụng gây mê đường tĩnh mạch

Tăng thể tích hơ hấp phút 2-4 lần với oxy 100% 10 L/phút luồng

khí cao

Ổn định huyết động học bắt đầu liệu pháp chống loạn nhịp tim cần thiết Rối loạn nhịp tim điều trị 10 – 30 mg/kg CaCl2 tiêm tĩnh mạch thuốc chống loạn nhịp tiêu chuẩn amiodadrone 150 – 300 mg cho người lớn

Bắt đầu sử dụng dantrolene

2,5 mg/kg Hạ nhiệt bên bên Làm mát bề mặt

thể quạt, ướt, túi nước đá đặt nách háng Tiếp tục gây mê với thuốc

khơng có tác nhân gây TTNAT

Mở rộng theo dõi huyết động, chèn động mạch tĩnh mạch chủ cần

Tiếp tục sử dụng dantrolene sau đến 10

22 phút trạng thái

lâm sàng ổn định

(10 đơn vị insulin 50 ml glucose 50% chuẩn độ tới mức nồng độ K+)

Ngăn ngừa suy thận cấp cách hydrat hóa và/ sử dụng mannitol, thuốc lợi tiểu (furosemide)

Khi bệnh nhân ổn định huyết động, chuyển đến phịng chăm sóc đặc biệt 24 Các số ổn định bao gồm: ETCO2 giảm bình thường; khơng có rối loạn nhịp tim, tăng thân nhiệt cứng [23, 81]

Dantrolene

Dantrolene chất ức chế giải phóng Ca2+ từ SR xương, thuốc có sử dụng lâm sàng để điều trị TTNAT hiệu [7, 52] Các nghiên cứu xác định thụ thể RyR1 SR vị trí gắn kết dantrolene, gây ức chế trực tiếp gián tiếp thụ thể này, dẫn đến giảm nồng độ Ca2+ nội bào xương Dantrolene không sử dụng để điều trị TTNAT, mà điều trị hội chứng ác tính thần kinh, co cứng nhiễm độc thuốc lắc Cấu trúc hóa học số đặc tính dược động học dantrolene trình bày trong Bảng 1.9 Nhược điểm dantrolene khả hòa tan nước kém, gây khó khăn việc chuẩn bị thuốc để tiêm tĩnh mạch tình khẩn cấp [7] Tác dụng bất lợi dantrolene điều trị ngắn hạn không đáng kể, bao gồm viêm tĩnh mạch khoảng 9% trường hợp, yếu tạm thời khoảng 21%, rối loạn tiêu hóa 4% tổn thương hơ hấp bệnh nhân rối loạn từ trước [16]

23 Đặc tính dược động học Hấp thu, phân bố

 Đường uống: 70% liều dantrolene hấp thu Nồng độ dantrolene huyết tương đạt cực đại khoảng

 Đường tiêm tĩnh mạch: Nồng độ dantrolene huyết tương 4,2 g/ml với liều 2,4 mg/kg

 T1/2= 12 Chuyển

hóa

Được chuyển hóa microsome gan tạo thành – hydroxydantrolene, hoạt động chất giãn xương chuyển hóa thành dẫn xuất acetyl hóa khử dantrolene

Thải trừ

Dantrolene chất chuyển hóa thuốc thải trừ chủ yếu qua nước tiểu mật

Hiện có hai chế phẩm dantrolene có sẵn Phiên thơng thường Dantrium®, có sẵn lọ 20 mg với độ hịa tan kém, lọ cần 60ml nước vơ trùng để pha lỗng Do đó, cần sử dụng – 10 ống để điều trị TTNAT người trưởng thành Ryanodex® chế phẩm thay FDA phê chuẩn với độ hòa tan cải thiện, có sẵn ống 250 mg cần ml dung dịch nước vơ trùng để pha lại Chính vậy, điều trị ban đầu đạt với ống [25] Một chất tương tự dantrolene – azumolene có tiềm việc giãn trường hợp TTNAT lợn Tuy nhiên, cân nhắc kinh tế nên không đưa vào thực hành lâm sàng [16]

1.3 Phương pháp giải trình tự gen hệ (NGS) 1.3.1 Lịch sử phát triển

24

trong 30 năm sau [8, 71] Đồng thời, đổi hóa chất thiết bị hỗ trợ cho khởi đầu Dự án gen người với thảo đưa vào năm 2001 hoàn thiện vào năm 2004 [15, 17, 33] Tuy nhiên, Dự án gen người địi hỏi khơng thời gian, nguồn lực, mà cần công nghệ nhanh hơn, lưu lượng xử lý cao giá thành rẻ thời điểm Chính vậy, năm 2004, Viện nghiên cứu gen người quốc gia (National Human Genome Research Institute – NHGRI) khởi xướng chương trình tài trợ với mục tiêu giảm chi phí giải trình tự gen người xuống 1000$ vòng 10 năm Điều kích thích phát triển thương mại hóa cơng nghệ giải trình tự (Next Generation Sequencing – NGS) [8] Kể từ đó, hàng chục cơng ty cơng nghệ giải trình tự hệ tạo vào năm 2000, với lĩnh vực tin sinh học, bùng nổ ngành khoa học đào tạo [2, 71] 1.3.2 Khái niệm ứng dụng công nghệ giải trình tự

1.3.2.1 Khái niệm

Giải trình tự hệ (NGS) phương pháp giải trình tự đồng thời hàng triệu đoạn DNA (hoặc DNA bổ sung), áp dụng phổ biến phịng thí nghiệm lâm sàng khả phân tích đồng thời số gen vùng gen với thử nghiệm đơn so với phương pháp truyền thống biết [85] Với NGS, toàn bộ gen người giải trình tự vịng ngày Ngược lại, sử dụng cơng nghệ giải trình tự Sanger trước phải cần thập kỷ để đưa kết cuối [71]

25 1.3.2.2 Ứng dụng

Với phát triển nhanh chóng ứng dụng rộng rãi phương pháp NGS, thơng tin giải trình tự gen cung cấp cho nghiên cứu quy mô lớn exomics, di truyền học sinh thái (metagenomics), di truyền học biểu sinh (epigenomics) nghiên cứu mức độ phiên mã gen (transcriptomics) Giải trình tự gen không cung cấp kiến thức cho nghiên cứu bản, mà hỗ trợ nhằm đạt mục tiêu giải mã bí ẩn sống, tạo trồng vật nuôi phát triển tốt hơn, suất cao hơn; cải thiện chẩn đoán, tiên lượng phương pháp điều trị ung thư bệnh phức tạp khác, nâng cao chất lượng sống người Các ứng dụng NGS kể đến như: giải trình tự de novo, mate – pair, giải trình tự RNA, giải mã hệ phiên mã, xác định đa hình trình tự hệ gen vùng gen đích, di truyền học biểu sinh di truyền học sinh thái [47]

1.3.3 NGS qua hệ

1.3.3.1 Giải trình tự hệ thứ

26

Hình 1.3 Quy trình giải trình tự Sanger

Được cơng bố vào năm 1977, phương pháp giải trình tự Sanger tương đối chậm so với tiêu chuẩn NGS nay, với cải tiến phương pháp chấm dứt chuỗi, tự động hóa thương mại hóa, phương pháp sử dụng thí nghiệm lâm sàng Những đổi quan trọng giải trình tự Sanger kể đến như: phát triển thuốc nhuộm huỳnh quang, sử dụng trình tự chu trình nhiệt để giảm số lượng DNA đầu vào ổn định polymerase để kết hợp kết thúc xác cách nhuộm huỳnh quang vào chuỗi DNA tổng hợp, phát triển phần mềm để phân tích trình tự [82] 1.3.3.2 Giải trình tự hệ thứ hai

Sau phương pháp Sanger, thuật ngữ giải trình tự hệ thứ hai, thứ ba,… sử dụng cho cơng nghệ giải trình tự DNA Các phương pháp giải trình tự hệ thứ hai chia thành hai nhóm chính: giải trình tự cách lai giải trình tự phương pháp tổng hợp (Sequencing by synthesis – SBS)

Giải trình tự cách lai

27

đích bị rửa trơi mẫu làm giàu để rửa giải giải trình tự Giải trình tự phương pháp lai phần lớn chuyển sang cơng nghệ phụ thuộc vào việc thăm dị cụ thể để thẩm vấn trình tự, ứng dụng chẩn đốn để xác định đa hình đơn nucleotide (SNPs) gen xác định bất thường NST (sắp xếp lại, xóa, nhân đơi, chép biến thể số) [38]

Giải trình tự phương pháp tổng hợp (SBS)

Các phương pháp SBS phát triển trình tự Sanger với đặc điểm khơng có đầu tận dideoxy, chu trình tổng hợp, hình ảnh phương pháp lặp lặp lại để kết hợp nucleotide bổ sung mạch tổng hợp Thoạt nhìn, phương pháp tốn chi phí, phản ứng thường chạy song song thể tích nanolit, picolit zeptolit buồng nhỏ Do đó, chi phí giải trình tự cho cặp bazơ khơng q tốn Các phương pháp SBS trình bày Bảng 1.10

Bảng 1.10 Một số kỹ thuật giải trình tự phương pháp tổng hợp (SBS) [2, 82]

Tên kỹ thuật

Khái niệm Tóm tắt quy trình

454 pyrose- quenci-ng

Là phương pháp giải trình tự hệ thứ hai lần đưa thị trường, dựa phát pyrophosphate (PPi) giải phóng dNTP thêm vào chuỗi DNA tổng hợp

Các đoạn DNA riêng lẻ (400 – 700bp) gắn vào adapter tạo thư viện sst – DNA mạch đơn Các adapter làm trình tự mồi cho emPCR phản ứng khuếch đại PCR nhũ tương Sau đó, tiến hành giải trình tự đoạn DNA phát hóa học phản ứng tổng hợp DNA với tham gia dNTP, PPi giải phóng đo máy ảnh nguồn sáng, xảy buồng kích thước picolit

Ion Torrent

Là kĩ thuật giải trình tự thơng qua việc

28

Sequen-cing

phát tín hiệu điện ion H+ giải phóng q trình tổng hợp DNA máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip bán dẫn

theo nguyên lý ion semiconductor Trong phản ứng tổng hợp DNA, dNTP bổ sung vào chuỗi DNA giải phóng PPi ion H+ Ion H+ làm thay đổi độ pH dung dịch tín hiệu điện hóa tạo ghi lại trực tiếp nhanh chóng phần mềm máy tính

Illumina (Solexa)

Là kỹ thuật giải trình tự đóng vai trị lĩnh vực giải trình tự thể hệ thứ hai, sử dụng công nghê phát triển Solexa Lynx

Therapeutics

Giải trình tự Illumina dựa kỹ thuật khuyếch đại cầu nối, phân tử DNA (~ 500bp) với adaptor thích hợp gắn đầu sử dụng làm chất cho phản ứng tổng hợp khuếch đại, lặp lại kính với giếng chứa trình tự oligonucleotide bổ sung với adaptor

Trong phản ứng tổng hợp, nucleotide biến đổi tương ứng với bazơ gắn huỳnh quang khác nhau, kết hợp sau phát Các nucleotide đóng vai trị chất kết thúc tổng hợp cho phản ứng

Trong ba kỹ thuật giải trình tự phương pháp SBS, Illumina Seq sử dụng phổ biến, có giá thành cao nhất, 454 pyrosequencing Ion Torrent có giá thành rẻ cao so với phương pháp Sanger Ngồi ra, thời gian giải trình tự phương pháp Ion Torrent nhanh (khoảng – giờ) thời gian giải trình tự Illumina lâu (khoảng 23 giờ) để phân tích hệ gen người [82]

1.3.3.3 Giải trình tự hệ thứ ba

29

Molecule Real Time – SMRT) nhằm mục đích giải trình tự phân tử DNA (và RNA) dài lên đến 30 – 50kb Phản ứng thực lỗ nhỏ kích thước nano (ZNW: Zero – mode waveguide): Tín hiệu hình ảnh thu (tính ms) ZNW – nơi DNA polymerase liên kết với DNA, kết hợp với bốn nucleotide (A, T, G, X) dán nhãn huỳnh quang chuỗi DNA tổng hợp Giải trình tự SMRT đem lại số lợi so với phương pháp giải trình tự trước đó: Cung cấp đọc dài cho gen, xác định nhanh vị trí methyl hóa cho nghiên cứu di truyền học biểu sinh Tuy nhiên, SMRT cho tỉ lệ lỗi cao, chủ yếu lỗi ngẫu nhiên thay lỗi hệ thống [82]

1.3.3.4 Giải trình tự hệ thứ tư

Phương pháp giải trình tự thứ tư phương pháp sử dụng dòng điện để vận chuyển phân tử DNA dài thơng qua lỗ có đường kính nhỏ (nanopore) đo độ lớn cường độ dòng điện nucleotide qua bề mặt nanopore [48] Hiện có hai hệ thống nanopore sử dụng để giải trình tự DNA hệ thống màng sinh học công nghệ cảm biến trạng thái rắn Giải trình nanopore từ hệ thống màng sinh học phụ thuộc vào việc sử dụng protein xuyên màng gắn lên màng lipid khơng dẫn điện để tạo lỗ nhỏ kích thước nano Hai protein nanopore nghiên cứu rộng rãi alpha hemolysin (HL) Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) Các DNA di chuyển qua lỗ nano với tốc độ không đổi, nucleotide tháo gỡ gắn kết cho hàng chục ngàn nucleotide Công nghệ cảm biến trạng thái rắn sử dụng chất kim loại hợp kim khác với lỗ kích thước nm cho phép DNA RNA qua [2, 82]

30

kỹ thuật xác định sửa đổi bazơ (tương tự PacBio) xác định kiện di truyền học biểu sinh, giám sát môi trường kiểu gen [82]

1.3.4 Hạn chế NGS

31

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu ca lâm sàng bệnh nhân tài trợ Bệnh viện E, Việt Nam (Dự án KH05 – 2018)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập liệu lâm sàng, cận lâm sàng

Dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân thu thập Trung tâm Tim mạch – Bệnh viện E

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA

Mẫu máu bệnh nhân xử lý để giải trình tự tồn vùng mã hóa protein – exon phương pháp giải trình tự gen hệ mới, nhằm mục đích phát biến thể gen liên quan đến phản ứng TTNAT phục vụ chẩn đoán DNA tổng số tách chiết từ máu toàn phần bệnh nhân theo bước sau: Đầu tiên, phá màng tế bào màng nhân cách ủ mẫu bệnh phẩm dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như sarcosyl) enzyme phân hủy protein Tiếp theo, sử dụng dung dịch phenol/chloroform để biến tính protein, làm tủa protein để dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn dịch Cuối cùng, sử dụng cồn làm kết tủa DNA điều kiện lạnh thu nhận lại DNA ly tâm DNA hòa lại nước để khử enzyme nucleaza

2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen

32

ngân hàng gen người loại bỏ vị trí phân tử trùng lặp Dữ liệu sau tiếp tục phân tích nhằm tìm tất vị trí có thay đổi alen với tần số thống kê cao, biến thể đa hình đơn nucleotide (SNPs), đột biến thêm bớt (INDEL) Tiếp theo, liệu chọn lọc để tìm biến thể tiềm có khả gây bệnh công cụ SIFT Polyphen2 Với SIFT, nhà nghiên cứu dự đốn chức protein bị ảnh hưởng thay amino acid hay không, dựa số tỉ lệ amino acid thay dự đốn tính dung nạp gây hại chúng (chỉ số < 0,05 coi gây hại ngược lại dung nạp) Polyphen2 cơng cụ dự đốn tác động có thay acid amin lên cấu trúc chức protein người dựa thang điểm đánh giá Các tác động chia làm ba mức theo điểm đánh giá: an tồn (B: – 0,452), gây hại (P: 0,453 – 0,956) có hại (D: 0,957 – 1) Sau xác định biến thể tiềm có liên quan đến bệnh, xác định điểm đột biến phương pháp giải trình tự Sanger tiến hành phân tích kết thu

Bảng 2.1 Mối liên hệ điểm chất lượng Phred với khả mắc lỗi đọc bazơ tính xác lần đọc

Điểm chất lượng Phred Khả mắc lỗi đọc bazơ Độ xác lần đọc

10 1:10 90%

20 1:100 99%

30 1:1000 99,9%

40 1:10000 99,99%

50 1:100000 99,999%

60 1: 1000000 99,9999%

2.2.4 Đạo đức nghiên cứu

33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân

3.1.1 Thông tin chung kết cận lâm sàng bệnh nhân

Bệnh nhân A, giới tính nam, 59 tuổi, nặng 52 kg, có tiền sử phẫu thuật mổ tách van hai 22 năm trước Bệnh nhân nhập viện đau ngực trái âm ỉ, thở cấp II NYHA (2016) phân loại với triệu chứng khó thở nhẹ vịng tháng Vào ngày nhập viện, bệnh nhân tỉnh, huyết động ổn định, nhịp tim bình thường, mạch đập 83 lần/phút, huyết áp 160/100, nhịp thở 18 lần/phút, nhiệt độ 36oC Giá trị số số cận lâm sàng (sinh hóa máu, huyết học, đông máu) bất thường của bệnh nhân thể Bảng 3.1, số khác nằm giới hạn bình thường

Bảng 3.1 Giá trị số số cận lâm sàng bất thường bệnh nhân trong ngày nhập viện

Tên xét nghiệm (đơn vị) Kết Giá trị bình thường

Sinh hóa máu Ure (mmol/L) 8,3 2,8 – 7,2

Protein TP (g/L) 61,6 66 – 83

Albumine (g/L) 33,0 35 – 52

Đông máu PT% (%) 27,4 70 - 140

PTs (giây) 29,4 8,5 – 15

INR 2,63 0,75 – 1,19

APTTs (giây) 48,4 21,3 – 40

APTT ( R) (Bệnh/chứng) 1,44 0,85 – 1,2 Huyết học Số lượng HC (x 1012/L) 4,32 4,5 – 5,9

34

Đoạn ưa acid (%) 7,8 –

Máu lắng h máy tự động (mm/1h)

9,4 -

Kết siêu âm Doppler tim bệnh nhân cho thấy huyết khối buồng nhĩ trái van hai hẹp khít cần tiến hành phẫu thuật (Hình 3.1), chức tâm thu thất trái giới hạn bình thường

Hình 3.1 Phẫu thuật thay van tim bệnh nhân A: Vị trí phẫu thuật tim B: Cắt van hai

3.1.2 Kết lâm sàng bệnh nhân

Bệnh nhân gây mê toàn thân thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch Esmeron 50 mg nhằm hỗ trợ gây mê để đặt nội khí quản thuốc gây mê đường hô hấp bao gồm Isoflurane 250 mg, Sevoflurane 250 mg; trì gây mê Diprivan (propofol) 100 mg – 50 mg – 30 mg, Fentanyl 0,25 mg – 0,2 mg – 0,1 mg Sau gây mê, tiến hành đặt sonde dày, lấy máu động mạch bệnh nhân làm xét nghiệm khí máu đặt đầu dị đo nhiệt độ thực quản Trong suốt trình phẫu thuật, bệnh nhân theo dõi thán đồ, nhiệt độ, khí máu, đo huyết áp khơng xâm lấn Cuộc phẫu thuật kéo dài với tổng liều thuốc mê dùng sau: Propofol (180 mg); Fentanyl (0,95 mg); Esmeron (150 mg); Sevoflurane (250 mg (35 ml)); Isoflurane (250 mg (40 ml))

35

nhiều, đồng tử giãn mm hai bên, phản xạ ánh sáng dương tính, số khí máu điện giải bất thường (Bảng 3.2) Kiểm tra thơng khí bệnh nhân không thấy dấu hiệu co thắt chảy máu Kết xét nghiệm khí máu động mạch thời điểm cho thấy áp lực riêng phần CO2 máu động mạch (pCO2) tăng lên đến 68,3 mmHg (Bảng 3.2) Các bác sĩ phẫu thuật cho phản ứng tăng thân nhiệt ác tính Do bệnh nhân xử lý theo hướng điều trị phản ứng

Bảng 3.2 Kết xét nghiệm khí máu động mạch điện giải bệnh nhân thời điểm bắt đầu xảy phản ứng TTNAT

Chú thích: ↓ giảm; ↑ tăng

Tên XN Đơn vị Kết Giá trị BT Nhận xét

pH 7,062 7,35 – 7,45 ↓

pCO2 mmHg 68,3 35 – 45 ↑

pO2 mmHg 121,6 80 – 100 ↑

SO2 % 95,8 75,0 – 99,0

Hct % 41 35 – 50

Hb g/dL 13,8 11,5 – 17,4

Na+ mmol/L 141,6 136 – 146

K+ mmol/L 5,96 3,5 – 4,5 ↑

Ca2+ mmol/L 1,51 2,2 – 2,6 ↓

Glu mmol/L 13,5 4,0 – 5,9 ↑

36

Tiến hành điều trị theo hướng tăng thân nhiệt ác tính cách thở máy có kiểm sốt với FiO2 60 – 100%, sử dụng Cefuroxim 250 mg, Dobutamine 250 mg, Ephedrine, Fentanyl trì 100 g/giờ; làm mát tích cực nước đá rửa nước muối lạnh thông thường qua sonde dày nhiệt độ thể bệnh nhân giảm xuống; thuốc lợi tiểu Furosemide 20 mg (1 ống) sử dụng nhằm trì lượng nước tiểu lớn ml/kg/giờ, ngăn ngừa suy thận cấp; sử dụng Natri bicarbonate 4,2% (2 chai), Insuline, Glucose 5% để điểu trị nhiễm toan chuyển hóa tăng K+ máu; CaCl2 0,5 g chống rối loạn nhịp tim; dung dịch tiêm tĩnh mạch natri clorua (NaCl) 0,9%, thiết lập đường tĩnh mạch trung tâm, đo huyết áp động mạch không xâm lấn; hai đơn vị máu truyền để tăng thể tích máu nội mạch cải thiện khả oxy kết hợp hemoglobin bệnh nhân; tiến hành làm xét nghiệm khí máu, xét nghiệm đơng máu sau Dantrolene khơng có sẵn thời điểm bệnh nhân không điều trị thuốc đặc trị TTNAT

Sau vài điều trị tích cực, bệnh nhân có dấu hiệu hồi phục, thân nhiệt đạt đỉnh 42oC giảm xuống 40,6oC Vào thời điểm ngày, nhiệt độ bệnh nhân giảm dần trở lại bình thường (37oC) Kết xét nghiệm khí máu động mạch cho thấy pCO2, nồng độ K+ Ca2+ máu giảm dần Hai ngày sau ngày phẫu thuật đầu tiên, tiến hành ca phẫu thuật cho bệnh nhân chảy máu sau phẫu thuật thay van hai Một tháng sau, ca phẫu thuật thứ ba bệnh nhân tiến hành máu cục màng tim sau mổ thay van hai Cả hai ca phẫu thuật không thực gây mê thuốc gây mê đường hô hấp sevoflurane mà sử dụng thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch (propofol fentanyl) Bệnh nhân không biểu triệu chứng phản ứng tăng thân nhiệt ác tính

37

thường; số CK – MB đạt đỉnh 110 U/L sau giảm dần vào ngày Nồng độ K+ máu cao vào sau ngày phẫu thuật lần thứ hai (5,9 mmol/L) trở lại bình thường ngày Sau hai tháng kể từ thời điểm nhập viện, phẫu thuật điều trị, kết siêu âm Doppler tim bệnh nhân cho kết quả: Van hai sinh học vị trí, hoạt động bình thường; nhiên van động mạch chủ hở nhẹ, chức tâm thu thất trái giảm nhẹ

Bằng cách tiến hành biện pháp điều trị tích cực, phản ứng TTANT xảy bệnh nhân đẩy lùi Bệnh nhân tiếp tục theo dõi trải qua hai ca phẫu thuật tim bệnh viện E Cả hai ca phẫu thuật diễn thuận lợi không xảy phản ứng TTNAT không sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp Sau hai tháng theo dõi điều trị kể từ thời điểm nhập viện, kết siêu âm Doppler tim cho thấy van hai sinh học vị trí, hoạt động bình thường Với đồng ý bệnh nhân gia đình, bệnh nhân lấy mẫu máu để tiến hành giải trình tự tồn hệ gen theo phương pháp giải trình tự gen hệ (NGS) nhằm phát điểm thay đổi gen có liên quan đến phản ứng tăng thân nhiệt ác tính

3.2 Kết phân tích gen bệnh nhân

38

hiện gen mã hóa bệnh nhân với tỉ lệ kiểu gen biến đổi dị hợp tử với kiểu gen biến đổi đồng hợp tử (Het/Hom) 1,3

Kết phân tích bệnh nhân nhắm tới mục tiêu gen liên quan đến phản ứng TTNAT, cho thấy phát 18 điểm thay đổi gen RYR1, có 07 điểm synonymous, 10 điểm intron, 01 đột biến điểm công bố gây bệnh (codon 2350, c7048G >A, p.Ala2350Thr, polyphen đánh giá thang điểm gây bệnh 0,999, SIFT 0,001) dạng dị hợp tử; ngồi cịn phát 15 điểm thay đổi gen CACNA1S có 07 điểm intron, 04 điểm synonymous, 03 điểm splice, 01 điểm upstream; 02 điểm thay đổi gen STAC3 có 01 intron, 01 vùng prime UTR Đột biến sai nghĩa c7048G >A, p.Ala2350Thr xác nhận trình tự Sanger, trình bày Hình 3.2 Đây đột biến công bố nghiên cứu trước (https://www.emhg.org/) Hình 3.2 cho thấy đột biến p.Ala2350Thr nằm vùng chứa trình tự bảo tồn (conservative region) qua loài gen RYR1 nên thay gây ảnh hưởng đến chức protein RyR1

Hình 3.2 A: Điểm đột biến (c7048G >A, p.Ala2350Thr) gen RYR1 bệnh nhân xác định trình tự Sanger B: So sánh cấu trúc

bậc phân tử protein RyR1 loài: người (XM011527205), bò (NM001206777), lợn (NM001001534), thỏ

39 3.3 Bàn luận

Tăng thân nhiệt ác tính rối loạn dược lý mang tính tự phát đột biến gen RYR1, CACNA1S STAC3 chứng minh có liên quan đến phản ứng [80] Hiện nay, biến thể gen RYR1, CACNA1S STAC3 công bố liên quan đến TTNAT, ứng dụng tư vấn chẩn đốn điều trị Trong đó, khoảng 37-86% trường hợp báo cáo mang đột biến gen RYR1 [74], khoảng 1% mang đột biến gen CACNA1S [36] Đột biến trong gen STAC3 xác định có liên quan đến bệnh nhược bẩm sinh người Mỹ địa, có xu hướng xuất phản ứng TTNAT [34] Hiện tại, các gen đáp ứng liên quan đến thuốc báo cáo, 200 biến thể RYR1 tìm thấy với phản ứng TTNAT, có 35 biến thể RYR1 biến thể CACNA1S công nhận đủ đặc điểm chức (www.emhg.org) để sử dụng xét nghiệm di truyền chẩn đoán cho TTNAT [80].Phân tích gen nhà nghiên cứu khuyến cáo nên đưa vào cơng việc chẩn đốn bệnh nhân thuộc dân tộc có biểu TTNAT, đặc biệt có báo cáo tiền sử TTNAT gia đình [34] Trong nghiên cứu chúng tơi, bệnh nhân A giải trình tự tồn exome phương pháp giải trình tự gen hệ mới, thu kết trình bày Từ kết chúng tơi có bàn luận đây:

3.3.1 Đặc điểm ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính bệnh nhân

40

rối loạn nhịp tim, suy thận cấp, DIC Việc kiểm soát sớm nhiệt độ nồng độ K+ máu quan trọng, nhiên sau nhiệt độ thể trở lại bình thường cần tiếp tục làm mát bề mặt thể bệnh nhân, tránh để kiểm soát nhiệt độ dẫn đến tình trạng hạ thân nhiệt đột ngột Để bù đắp cho lượng lớn O2 bị tiêu thụ tăng chuyển hóa lượng CO2 tăng q trình giảm thơng khí, bệnh nhân thiết lập thở máy có kiểm sốt với FiO2 60 – 100% suốt q trình điều trị Dantrolene tiêm tĩnh mạch khơng có sẵn thời điểm diễn phản ứng nên bệnh nhân không điều trị thuốc đặc trị TTNAT Chính vậy, trường hợp TTNAT nhấn mạnh tầm quan trọng việc phán đoán sớm TTNAT dựa dấu hiệu lâm sàng, điều trị triệu chứng tích cực liên tục, ngừng sử dụng thuốc gây mê đường hơ hấp theo dõi nghiêm ngặt tình trạng bệnh nhân xét nghiệm chẩn đoán thuốc đặc trị dantrolene khơng thể có mặt kịp thời Trường hợp xảy vùng nơng thơn, vùng phát triển thiếu điều kiện chăm sóc y tế Một trường hợp TTNAT tương tự Trung Quốc báo cáo Liu cộng sự: Bệnh nhân nam 14 tuổi điều trị thành công mà không sử dụng thuốc đặc trị dantrolene khơng có sẵn [72] Điều khẳng định kinh nghiệm điều trị TTNAT không sử dụng dantrolene cần thiết, đặc biệt quốc gia khơng có sẵn loại thuốc

3.3.2 Đặc điểm thuốc gây mê sử dụng phẫu thuật thay van hai bệnh nhân

41

thể gây độc thận, isoflurane chuyển hóa (0,2%) khơng gây độc [86] Propofol chuyển hóa nhanh chóng gan cách kết hợp với glucuronide sulphate, tạo hợp chất hòa tan nước đào thải qua thận [87] Rocuronium fentanyl chuyển hóa thành chất chuyển hóa hoạt tính khơng hoạt tính Sau đó, rocuronium đào thải chủ yếu gan, fentanyl tiết qua nước tiểu phân [88, 89]

42

nước phát triển, đồng thời gây mê tĩnh mạch có nguy ảnh hưởng đến nhận thức cao – 10 lần so với gây mê đường hơ hấp Chính vậy, gây mê đường hơ hấp ưu tiên sử dụng trường hợp bệnh nhân không nhạy cảm với TTNAT tốc độ gây mê nhanh, không đau không cần tiêm tĩnh mạch [25]

Nguyên nhân gây kích thích phản ứng TTNAT thuốc gây mê đường hơ hấp có liên quan đến biến thể đột biến số gen Vì cần lựa chọn thuốc gây mê phù hợp với tình trạng, tiền sử bệnh nhân gia đình nhằm phịng tránh phản ứng cấp tính lâm sàng Nghiên cứu sâu dược động học dược lực học thuốc gây mê đường hơ hấp giúp đưa loại thuốc phù hợp với bệnh nhân Đây chặng đường dài chế hoạt động thuốc gây mê đường hô hấp phức tạp

43

so với R – isoflurane Tuy nhiên, số nghiên cứu bất lợi việc sử dụng S – isoflurane số thuốc gây mê chứa dược chất đối quang khác lâm sàng [76] Vì vậy, ĐPQH isoflurane mối quan tâm nhà nghiên cứu [61]

3.3.3 Đặc điểm gen liên quan đến phản ứng TTNAT 3.3.3.1 Gen RYR1

44

2019, nhóm nhà khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội vai trị đa hình c.7048G > A (p.Ala2350Thr) gen RYR1 ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính sau phẫu thuật thay van tim [51]

Bảng 3.3 Các biến thể RYR1 xuất lần 770 gia đình nghiên cứu Anh [74]

Thay đổi nucleotide Thay đổi amino acid Số gia đình Giá trị P

c.479A>G p.Glu160Gly < 10-7

c.529C>T p.Arg177Cys 10 < 10-7

c.641C>T p.Thr214Met < 10-7

c.1202G>T p.Arg401His < 10-7

c.1598G>A p.Arg533His < 10-7

c.1615T>G p.Phe539Val < 10-7

c.3166G>C p.Asp1056His 0,0012

c.4763C>T p.Pro1588Leu 0,0061

c.5024T>C p.Leu1675Pro < 10-7

c.5183C>T p.Ser1728Phe < 10-7

c.6612C>G p.His2204Gln < 10-7

c.6961A>G p.Ile2321Val 0,031

c.7084G>A p.Glu2362Lys < 10-7

c.7089C>G p.Cys2363Trp < 10-7

c.7090T>G p.Phe2364Val < 10-7

c.7291G>T p Asp2431Tyr < 10-7

45

c.8026C>T p.Arg2676Trp < 10-7

c.9152G>A p.Arg3051His 0,048

c.10252A>G p.Asn3418Asp < 10-7

c.11708G>A p.Arg3903Gln < 10-7

c.11315G>A p.Arg3772Gln (2 đồng hợp tử) < 10-7

c.11958C>G p.Asp3986Glu < 10-7

c.12149C>A p.Ser4050Tyr < 10-7

c.12700G>T p.Val4234Leu < 10-7

c.14210G>A p.Arg4737Gln < 10-7

c.14471T>C p.Leu4824Pro < 10-7

c.14678G>A p.Arg4893Gln < 10-7

c.14918C>T p.Pro4973Leu < 10-7

46

mã hóa monomer protein cDNA gen RYR1 mô tả liên quan đến TTNAT và/hoặc bệnh CCD trước [30] Với liệu thu thập từ HGMD năm 2006, UniProt 2007 – 2009, Vukcevic cộng trình bày chuỗi acid amin protein ryanodine với đột biến biết liên quan đến số bệnh về xương (Hình 3.4) [45] Ngồi ra, nghiên cứu Vladutiu cộng ra biến thể gen RYR1 cịn góp phần vào nguy di truyền tiềm ẩn bệnh không thuốc gây mê, chẳng hạn bệnh nhóm thuốc statin gây [83]

Bảng 3.4 Các miền cấu trúc thụ thể Ryanodine phân tích theo phương pháp đơng lạnh mẫu thử dùng kính hiển vi điện tử

(Cryo – EM) [50]

Tên miền Tên thay Trình tự a

Miền đầu N NTD 1– 627

SPRY1 628 – 849

RY1 P1 850 – 1,054

SPRY2 1,055 – 1,656

Jsol Handle 1,657 – 2,144

Bsol HD1&2 2,145 – 3,613

RY3 P2 2,735 – 2,938

Csol Miền trung tâm 3,667 – 4,174

TaF 4,175 – 4,253

Miền xuyên màng 4,541 – 4,956

Miền đầu C CTD 4,957 – 5,037

47

Hình 3.3 Cấu trúc thụ thể Ryanodine [50]

Hình 3.4 Biểu diễn tuyến tính chuỗi acid amin protein ryanodine với các đột biến biết liên quan đến số bệnh xương [45] Chú thích: Các đột biến thụ thể RyR1 liên quan đến TTNAT (151 đột biến),

CCD (63 đột biến) MmD (6 đột biến) bệnh khác (MP (Myopathy), đột biến)

48

CACNA1S gen thứ hai có đa hình gây bệnh liên quan đến nhạy cảm TTNAT Đây gen nằm nhiễm sắc thể 1q [67], mã hóa tiểu đơn vị alpha – 1S (CAv1.1) thụ thể DHPR nằm hệ thống ống T Tiểu đơn vị CAv1.1 tạo thành kênh ion, chứa vị trí liên kết với phối tử miền phân tử tương tác với tiểu đơn vị khác, đóng vai trị quan trọng cảm biến điện dẫn đến giải phóng Ca2+ [79, 80] Khoảng 1% trường hợp TTNAT báo cáo mang đột biến gen CACNA1S Hiện tại, sáu đột biến CACNA1S có ý nghĩa lâm sàng liên quan với TTNAT xác định (Bảng 3.5) Ngoài ra, biến thể CACNA1S khác đơn độc kết hợp với gen khác gây ảnh hưởng đến cân nội môi, liên quan đến TTNAT [36]

Bảng 3.5 Các biến thể CACNA1S có ý nghĩa lâm sàng bệnh TTNAT [36]

Biến thể protein

Biến thể trên cDNA

mã

CACNA1S

Vị trí Đa hình đơn nucleotite (tần số alen

đột biến)

Tác động alen đột biến

p.Arg174Trp c.520C>T (CGG>TGG)

Phân đoạn cảm biến điện IS4

rs772226819 (chưa biết)

Alen T trội hoàn hoàn gây bệnh so với Alen C

p.Arg1086Cys c.3256C>T (CGT>TGT CGC>TGC)

Vùng nội bào liên kết vùng III IV

rs80338782 (0,0002)

Alen T sợi mã hóa tác nhân gây bệnh so với Alen C

p.Arg1086Ser c.3256C>A (CGT>AGT CGC>AGC)

Vùng nội bào liên kết vùng III IV

rs80338782 (0,0002)

49 p.Arg1086His c.3257G>A

(CGC>CAC CGU>CAU)

Vùng nội bào liên kết vùng III IV

rs1800559 (chưa biết)

Alen A sợi mã hóa trội hồn hồn gây bệnh so với Alen G

p.Arg1086Leu c.3257G>T (CGt > CTT CGC>CTC CGA>CTA CGG>CTG)

Vùng nội bào liên kết vùng III IV

rs1800559 (chưa biết)

Alen T sợi mã hóa trội hồn hồn gây bệnh so với Alen G

p.Thr1354Ser c.4060A>T (ACA>AGT)

Vùng ngoại bào IV

S5- vùng lõi S6

rs145910245 (0,00080)

Alen T sợi mã hóa tác nhân gây bệnh so với Alen A; biến thể Alen T lành tính cân liên kết với biến thể gây bệnh không bị phát

50

trên 50 bệnh nhân TTNAT Sự biến đổi p.Arg174Trp gây thay đổi điện tích acid amin thành dạng không phân cực Acid amin nằm miền phân đoạn S4 dihydropyridine, thay đổi điện tích làm thay đổi chế cảm biến điện thế, dẫn đến phá vỡ cân canxi nội bào [67] Mặc dù khơng thích PharmGKB, p.Arg1086Cys p.Arg1086Ser đột biến (rs80338782) liên quan đến TTNAT Toppin cộng báo cáo trường hợp bệnh nhân TTNAT có kiểu gen đồng hợp tử đột biến p.Arg1086Ser [31] Nhiều nghiên cứu cung cấp chứng mối liên quan biến thể gen CACNA1S với TTNAT sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp thuốc succinylcholine Dựa thông tin này, việc sử dụng thuốc gây mê halogen và/hoặc succinylcholine chống định bệnh nhân mẫn cảm với TTNAT mang đột biến sáu đột biến CACNA1S gây bệnh (Bảng 3.5) [36]

3.3.3.3 Gen STAC3

Horstick cộng đột biến gen STAC3 (p.Trp284Ser) sở di truyền bệnh nhược người Mỹ địa liên quan với tính nhạy cảm TTNAT [69, 80] Bệnh nhược rối loạn tự phát đặc trưng yếu bẩm sinh, chậm phát triển vận động, mẫn cảm với TTNAT, co rút nhiều khớp đặc điểm bất thường khn mặt vịm miệng, khn mặt dài hẹp [58] Hoạt động bình thường protein chứa SH3 miền giàu cysteine 3 mã hóa gen STAC3 cần thiết cho phối hợp hiệu thụ thể DHPR thụ thể RyR1 [34, 80] Gần đây, nhà nghiên cứu chứng minh STAC3 tương tác với vùng Cav1.1 II-III thụ thể DHPR [31, 54, 62, 84], có vai trò quan trọng liên kết với RYR1 ECC [12, 22]

Bảng 3.6 Các biến thể STAC3 có ý nghĩa lâm sàng bệnh TTNAT

Biến thể protein

Biến thể cDNA mã CACNA1S

Đa hình đơn

51

p.Trp284Ser c.851G>C rs140291094 Đột biến nhầm nghĩa, tác động tới kênh canxi liên quan tới bệnh lý TTNAT bệnh tim bẩm sinh p.Lys288Ter c.862A>T rs371720347 Đột biến vô nghĩa làm biến

đổi vùng SH3 thứ protein STAC3 bệnh nhân tim bẩm sinh

- c.432+4A>T rs751033943 Xảy vùng cắt nối intron gen tạo sản phẩm mARN bất thường, qua tạo protein bất thường liên quan tới bệnh tim bẩm sinh

p.Leu255fs c.761_762delCTCT rs773050511 Đột biến xóa vài nucleotide dẫn tới ảnh hưởng cấu trúc STAC3 bệnh TTNAT bệnh tim

Ile333-Val334-Val335-Gln336

c.997-1G>T - Xảy exon 12 gen ảnh hưởng vùng SH3 thứ hai protein STAC3 tới hoạt động kênh canxi liên quan tới bệnh lý TTNAT bệnh tim bẩm sinh

52

Nam Mỹ báo cáo phản ứng TTNAT với thuốc gây mê 10 bệnh nhân sau gây mê toàn thân Giải trình tự tồn exon cho thấy xuất phức hợp đột biến c.851G > C c.997-1G > T [34] Đa hình c.851G > C dẫn đến thay acid amin Tryptophan (Trp) vị trí 284 Serine (Ser) Trp284 nằm miền SH3 protein STAC3, nơi chứa vị trí liên kết đóng vai trị trung gian cho hình thành phức hợp protein [21, 34] Vùng liên kết nằm vùng kỵ nước chứa acid amin có vịng thơm Các acid amin đóng vai trị quan trọng liên kết với acid SH3 [63] Nghiên cứu Zaharieva cộng Trp284Ser không làm phá vỡ cấu trúc protein STAC3 làm suy yếu hoạt tính protein Tương tự, c.997-1G > T dẫn đến bốn acid amin Ile333- Val334-Val335-Gln336 miền SH3 thứ protein STAC3, làm ảnh hưởng đến cấu trúc miền SH3 thứ cấu trúc protein STAC3 Các nghiên cứu bệnh nhân người Mỹ địa quốc gia khác chứng minh bệnh nhược bẩm sinh liên quan đến gen STAC3 Chính vậy, phân tích gen STAC3 nên đưa vào cơng việc chẩn đốn bệnh nhân thuộc dân tộc có biểu bệnh bẩm sinh, đặc biệt có báo cáo tiền sử TTNAT [34] Các đột biến chủ yếu gen STAC3 liên quan tới chế bệnh sinh TTNAT bệnh tim bẩm sinh tổng hợp Bảng 3.6

53

khác [44] Ngoài ra, thuốc gây mê dạng hít làm giảm tác dụng ức chế Mg2+ thụ thể RyR1, gây kích hoạt co phản ứng TTNAT Ở trạng thái nghỉ, Mg2+ ức chế mở kênh Ca2+ tương tác thụ thể DHPR với thụ thể RyR1 làm bất hoạt tác dụng Mg2+, gây co điều kiện sinh lý Tác dụng halothane sevoflurane xác nhận mô người Tuy nhiên, việc tăng nồng độ Mg2+ nội bào nhằm ức chế tác dụng thuốc gây mê đường hô hấp biện pháp điều trị khả thi [41]

54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Từ kết nghiên cứu ca lâm sàng, rút số kết luận theo hai mục tiêu đề sau:

4.1 Xác định nguyên nhân vai trò quan trọng yếu tố di truyền mã hóa cho thụ thể RyR1 chế bệnh sinh bệnh lý tăng thân nhiệt ác tính phẫu thuật thay van hai sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp

4.2 Ứng dụng giải trình tự gen hệ đánh giá kết phân tích tồn exon bệnh nhân tăng thân nhiệt ác tính

o Kết cho thấy có 18 điểm thay đổi gen RYR1, 15 điểm thay đổi trên gen CACNA1S 02 điểm thay đổi gen STAC3

o Trong trường hợp TTNAT bệnh nhân A, kết thu đột biến sai nghĩa gen RYR1 (codon 2350, c7048G >A, p.Ala2350Thr, polyphen đánh giá thang điểm gây bệnh 0.999, SIFT 0.001 ) nằm vùng Bsol thụ thể RyR1 (Hình 3.2 B) Đột biến ảnh hưởng đến vị trí tương tác phosphoryl hóa với protein kinase II phụ thuộc Ca2+/CaM (CaMKII), gây ảnh hưởng đến chức protein RyR1 Đây lý để giải thích cho phản ứng TTNAT xảy bệnh nhân kích hoạt thuốc gây mê đường tĩnh mạch thuốc gây mê đường hô hấp

KIẾN NGHỊ

55

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1 Bùi Ích Kim (2006) Dược lý học lâm sàng thuốc mê hô hấp Bài giảng gây mê hồi sức Tập Việt Nam

2 (2018) Cơng Nghệ Giải Trình Tự Gen Thế Hệ Mới - Next Generation Sequencing Sinh Học Online, <https://tapchisinhhoc.com/giai-trinh-tu-gen-the-he-moi.html/>, accessed: 24/02/2020

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

3 Deile M., Damm M., Heller A.R (2013) [Inhaled anesthetics] Anaesthesist, 62(6), 493–504

4 Schraag S (2015) The Current Role of Total Intravenous Anesthesia in Cardiac Surgery: Total Intravenous Anesthesia and Cardiopulmonary Bypass Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia, 29, S27–S30 Bennett S.R Griffin S.C (2001) Sevoflurane versus isoflurane in patients undergoing valvular cardiac surgery J Cardiothorac Vasc Anesth, 15(2), 175–178

6 Clar D.T Richards J.R (2020) Anesthetic Gases StatPearls StatPearls Publishing, Treasure Island (FL)

7 Cully T.R., Choi R.H., Bjorksten A.R cộng (2018) Junctional membrane Ca2+ dynamics in human muscle fibers are altered by malignant hyperthermia causative RyR mutation Proc Natl Acad Sci USA, 115(32), 8215–8220

8 van Dijk E.L., Auger H., Jaszczyszyn Y cộng (2014) Ten years of next-generation sequencing technology Trends Genet, 30(9), 418–426 Dulhunty A.F (1992) The voltage-activation of contraction in skeletal

muscle Prog Biophys Mol Biol, 57(3), 181–223

11 Gonsalves S.G., Ng D., Johnston J.J cộng (2013) Using exome data to identify malignant hyperthermia susceptibility mutations Anesthesiology, 119(5), 1043–1053

12 Grabner M., Dirksen R.T., Suda N cộng (1999) The II-III loop of the skeletal muscle dihydropyridine receptor is responsible for the Bi-directional coupling with the ryanodine receptor J Biol Chem, 274(31), 21913–21919

13 Greninger A.L., Naccache S.N., Federman S cộng (2015) Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis Genome Med, 7, 99

14 Hopkins P.M., Rüffert H., Snoeck M.M cộng (2015) European Malignant Hyperthermia Group guidelines for investigation of malignant hyperthermia susceptibility Br J Anaesth, 115(4), 531–539

15 International Human Genome Sequencing Consortium (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome Nature, 431(7011), 931– 945

16 Krause T., Gerbershagen M.U., Fiege M cộng (2004) Dantrolene a review of its phDantrolene armDantrolene acology, therDantrolene apeutic use Dantrolene and new developments Anaesthesia, 59(4), 364–373

17 Lander E.S., Linton L.M., Birren B cộng (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome Nature, 409(6822), 860–921

18 MacLennan D.H., Abu-Abed M., Kang C (2002) Structure-function relationships in Ca(2+) cycling proteins J Mol Cell Cardiol, 34(8), 897– 918

20 Migita T., Mukaida K., Kobayashi M cộng (2012) The severity of sevoflurane-induced malignant hyperthermia Acta Anaesthesiol Scand, 56(3), 351–356

21 Morton C.J Campbell I.D (1994) SH3 domains Molecular “Velcro” Curr Biol, 4(7), 615–617

22 Nakai J., Tanabe T., Konno T cộng (1998) Localization in the II-III loop of the dihydropyridine receptor of a sequence critical for excitation-contraction coupling J Biol Chem, 273(39), 24983–24986

23 Riazi S., Kraeva N., Hopkins P.M (2018) Updated guide for the management of malignant hyperthermia Can J Anaesth, 65(6), 709–721 24 Rosenberg H., Davis M., James D cộng (2007) Malignant

hyperthermia Orphanet J Rare Dis, 2, 21

25 Rosenberg H., Pollock N., Schiemann A cộng (2015) Malignant hyperthermia: a review Orphanet J Rare Dis, 10, 93

26 Rosenberg H., Sambuughin N., Riazi S cộng (1993) Malignant Hyperthermia Susceptibility GeneReviews® University of Washington, Seattle, Seattle (WA)

27 Stachnik J (2006) Inhaled anesthetic agents Am J Health Syst Pharm, 63(7), 623–634

28 Stewart S.L., Hogan K., Rosenberg H cộng (2001) Identification of the Arg1086His mutation in the alpha subunit of the voltage-dependent calcium channel (CACNA1S) in a North American family with malignant hyperthermia Clin Genet, 59(3), 178–184

29 Suckling C.W (1957) Some chemical and physical factors in the development of fluothane Br J Anaesth, 29(10), 466–472

detection of three novel malignant hyperthermia alleles Clin Chem, 49(5), 761–768

31 Toppin P.J., Chandy T.T., Ghanekar A cộng (2010) A report of fulminant malignant hyperthermia in a patient with a novel mutation of the CACNA1S gene Can J Anaesth, 57(7), 689–693

32 Torri G (2010) Inhalation anesthetics: a review Minerva Anestesiol, 76(3), 215–228

33 Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W cộng (2001) The sequence of the human genome Science, 291(5507), 1304–1351

34 Zaharieva I.T., Sarkozy A., Munot P cộng (2018) STAC3 variants cause a congenital myopathy with distinctive dysmorphic features and malignant hyperthermia susceptibility Hum Mutat, 39(12), 1980–1994 35 Alvarellos M.L., Krauss R.M., Wilke R.A cộng (2016) PharmGKB

summary: very important pharmacogene information for RYR1 Pharmacogenetics and Genomics, 26(3), 138–144

36 Beam T.A., Loudermilk E.F., Kisor D.F (2017) Pharmacogenetics and pathophysiology of CACNA1S mutations in malignant hyperthermia Physiological Genomics, 49(2), 81–87

37 Chaturvedi R., Gogna R.L., (Retd) (2011) Ether day: an intriguing history Medical Journal, Armed Forces India, 67(4), 306

38 Gasc C., Peyretaillade E., Peyret P (2016) Sequence capture by hybridization to explore modern and ancient genomic diversity in model and nonmodel organisms Nucleic Acids Res, 44(10), 4504–4518

40 Halpern D.F (1994) Fluorinated Inhalation Anesthetics Organofluorine Chemistry: Principles and Commercial Applications Springer US, Boston, MA, 543–554

41 Hopkins P.M (2011) Malignant hyperthermia: pharmacology of triggering British Journal of Anaesthesia, 107(1), 48–56

42 Kassiri N., Ardehali S., Rashidi F cộng (2018) Inhalational anesthetics agents: The pharmacokinetic, pharmacodynamics, and their effects on human body Biomed Biotechnol Res J, 2(3), 173

43 Khan K.S., Hayes I., Buggy D.J (2014) Pharmacology of anaesthetic agents II: inhalation anaesthetic agents Contin Educ Anaesth Crit Care Pain, 14(3), 106–111

44 Kunst G., Graf B.M., Schreiner R cộng (1999) Differential Effects of Sevoflurane, Isoflurane, and Halothane on Ca (2+) Release from the Sarcoplasmic Reticulum of Skeletal Muscle Anesthesiology, 91(1), 179– 186

45 Lanner J.T., Georgiou D.K., Joshi A.D cộng (2010) Ryanodine Receptors: Structure, Expression, Molecular Details, and Function in Calcium Release Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(11), a003996

46 Larach M.G., Localio A.R., Allen G.C cộng (1994) A Clinical Grading Scale to Predict Malignant Hyperthermia Susceptibility: Anesthesiology, 80(4), 771–779

47 Liu L., Li Y., Li S cộng (2012) Comparison of Next-Generation Sequencing Systems Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, e251364, <https://www.hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/>, accessed: 08/03/2020

49 Maxam A.M Gilbert W (1977) A new method for sequencing DNA Proc Natl Acad Sci USA, 74(2), 560–564

50 Meissner G (2017) The structural basis of ryanodine receptor ion channel function The Journal of General Physiology, 149(12), 1065

51 Nguyen T.-T., Le N.-T., Nguyen T.-M.T cộng (2019) Whole exome sequencing revealed a pathogenic variant in a gene related to malignant hyperthermia in a Vietnamese cardiac surgical patient: A case report Annals of Medicine and Surgery, 48, 88–90

52 Oo Y.W., Gomez-Hurtado N., Walweel K cộng (2015) Essential Role of Calmodulin in RyR Inhibition by Dantrolene Mol Pharmacol, 88(1), 57–63

53 Park C.S., Park H.J., Kim K.N cộng (2008) The influence of GABA A γ2 genetic polymorphism on the emergence agitation induced by sevoflurane Korean J Anesthesiol, 55(2), 139

54 Polster A., Nelson B.R., Papadopoulos S cộng (2018) Stac proteins associate with the critical domain for excitation–contraction coupling in the II–III loop of CaV1.1 The Journal of General Physiology, 150(4), 613– 624

55 Robinson R., Carpenter D., Shaw M.-A cộng (2006) Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease Human Mutation, 27(10), 977–989

56 Sanger F Coulson A.R (1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase J Mol Biol, 94(3), 441–448

58 Stamm D.S., Aylsworth A.S., Stajich J.M cộng (2008) Native American myopathy: Congenital myopathy with cleft palate, skeletal anomalies, and susceptibility to malignant hyperthermia Am J Med Genet, 146A(14), 1832–1841

59 Sumitani M., Uchida K., Yasunaga H cộng (2011) Prevalence of Malignant Hyperthermia and Relationship with Anesthetics in JapanData from the Diagnosis Procedure Combination Database Anesthesiology, 114(1), 84–90

60 Watson J.D Crick F.H.C (1953) The Structure of Dna Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 18, 123–131

61 Weiskopf R.B., Nau C., Strichartz G.R (2002) Drug Chirality in Anesthesia Anesthesiology, 97(2), 497–502

62 Wong King Yuen S.M., Campiglio M., Tung C.-C cộng (2017) Structural insights into binding of STAC proteins to voltage-gated calcium channels Proc Natl Acad Sci USA, 114(45), E9520–E9528

63 Zafra-Ruano A Luque I (2012) Interfacial water molecules in SH3 interactions: Getting the full picture on polyproline recognition by protein-protein interaction domains FEBS Letters, 586(17), 2619–2630

64 Behjati S Tarpey P.S (2013) What is next generation sequencing? Arch Dis Child Educ Pract Ed, 98(6), 236–238

65 Brioni J.D., Varughese S., Ahmed R cộng (2017) A clinical review of inhalation anesthesia with sevoflurane: from early research to emerging topics J Anesth, 31(5), 764–778

67 Carpenter D., Ringrose C., Leo V cộng (2009) The role of CACNA1S in predisposition to malignant hyperthermia BMC Med Genet, 10, 104

68 Eilers H Yost S (2015) General Anesthetics Basic & Clinical Pharmacology 13, McGraw-Hill Medical, New York, NY

69 Horstick E.J., Linsley J.W., Dowling J.J cộng (2013) Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy Nat Commun, 4, 1952

70 Jones P.M., Bainbridge D., Chu M.W.A cộng (2016) Comparison of isoflurane and sevoflurane in cardiac surgery: a randomized non-inferiority comparative effectiveness trial Can J Anaesth, 63(10), 1128– 1139

71 Levy S.E Myers R.M (2016) Advancements in Next-Generation Sequencing Annual Review of Genomics and Human Genetics, 17(1), 95– 115

72 Liu S.-T., Liu L.-F., Wang S.-Y (2017) Treatment of Malignant Hyperthermia without Dantrolene in a 14-year-old Boy Chin Med J (Engl), 130(6), 755–756

73 Merritt A., Booms P., Shaw M.-A cộng (2017) Assessing the pathogenicity of RYR1 variants in malignant hyperthermia Br J Anaesth, 118(4), 533–543

74 Miller D.M., Daly C., Aboelsaod E.M cộng (2018) Genetic epidemiology of malignant hyperthermia in the UK Br J Anaesth, 121(4), 944–952

75 Mitra S Chopra P (2011) Chirality and anaesthetic drugs: A review and an update Indian J Anaesth, 55(6), 556–562

77 Monnier N., Procaccio V., Stieglitz P cộng (1997) Malignant-hyperthermia susceptibility is associated with a mutation of the alpha 1-subunit of the human dihydropyridine-sensitive L-type voltage-dependent calcium-channel receptor in skeletal muscle Am J Hum Genet, 60(6), 1316– 1325

78 Nair A.S (2019) Pharmacogenomics of inhalational anesthetic agents Med Gas Res, 9(1), 52–53

79 Neuhuber B., Gerster U., Döring F cộng (1998) Association of calcium channel α1S and β1a subunits is required for the targeting of β1a but not of α1S into skeletal muscle triads Proc Natl Acad Sci U S A, 95(9), 5015–5020

80 Riazi S., Kraeva N., Hopkins P.M (2018) Malignant Hyperthermia in the Post-Genomics Era: New Perspectives on an Old Concept Anesthesiology, 128(1), 168–180

81 Schneiderbanger D., Johannsen S., Roewer N cộng (2014) Management of malignant hyperthermia: diagnosis and treatment Ther Clin Risk Manag, 10, 355–362

82 Slatko B.E., Gardner A.F., Ausubel F.M (2018) Overview of Next Generation Sequencing Technologies Curr Protoc Mol Biol, 122(1), e59 83 Vladutiu G.D., Isackson P.J., Kaufman K cộng (2011) Genetic Risk

for Malignant Hyperthermia in Non-Anesthesia-Induced Myopathies Mol Genet Metab, 104(1–2), 167–173

84 Whirl-Carrillo M., McDonagh E.M., Hebert J.M cộng (2012) Pharmacogenomics Knowledge for Personalized Medicine Clin Pharmacol Ther, 92(4), 414–417

86 Inhalational Anaesthetic Agents · Part One

<http://www.partone.lifeinthefastlane.com/inhalational-anaesthetics.html>, accessed: 17/05/2020

87 Propofol <https://www.drugbank.ca/drugs/DB00818>, accessed: 17/05/2020

88 Rocuronium <https://www.drugbank.ca/drugs/DB00728>, accessed: 17/05/2020

(https://www.emhg.org/) (www.emhg.org) rs371720347