Khảo sát khả năng trao đổi chất của nấm men kluyveromyces marxianus được cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước trong điều kiện stress 5 hmf

Nhiệm vụ và nội dung Nhiệm vụ ƒ So sánh khả năng chịu stress 5 - HMF của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước và nấm men tự do thông qua khả năng sinh trưởng, sử dụng cơ chất và sinh tổng

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CN THỰC PHẨM -

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TRAO ĐỔI CHẤT CỦA NẤM MEN

KLUYVEROMYCES MARXIANUS ĐƯỢCCỐ ĐỊNH TRÊN

CHẤT MANG BẸ LÁ DỪA NƯỚC TRONG ĐIỀU KIỆN

STRESS 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

LÊ NGỌC HUYỀN TRANG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TRAO ĐỔI CHẤT CỦA NẤM MEN

KLUYVEROMYCES MARXIANUS ĐƯỢCCỐ ĐỊNH TRÊN

CHẤT MANG BẸ LÁ DỪA NƯỚC TRONG ĐIỀU KIỆN STRESS 5-HYDROXYLMETHYLFURFURAL

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Ngọc Huyền Trang MSHV: 11110222

Ngày sinh: 02/12/1988 Nơi sinh: Tiền Giang

Chuyên ngành: CN Thực Phẩm & Đồ Uống Mã số: 605402

I Tên đề tài

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TRAO ĐỔI CHẤT CỦA NẤM MEN

KLUYVEROMYCES MARXIANUS ĐƯỢCCỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG BẸ

LÁ DỪA NƯỚC TRONG ĐIỀU KIỆN STRESS 5-HMF

II Nhiệm vụ và nội dung

Nhiệm vụ

ƒ So sánh khả năng chịu stress 5 - HMF của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước

và nấm men tự do thông qua khả năng sinh trưởng, sử dụng cơ chất và sinh tổng hợp

sản phẩm

ƒ Khảo sát ảnh hưởng của 5 - HMF đến sự thay đổi thành phần acid béo trong màng tế bào chất của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước và nấm men tự do

- -

ƒ Xác định khả năng lên men của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước khi tái sử dụng nấm men trong môi trường có chứa 5 – HMF

III Ngày giao nhiệm vụ

19/06/2012

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ

01/12/2013

V Cán bộ hướng dẫn

PGS TS Lê Văn Việt Mẫn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 12 năm 2013 Cán bộ hướng dẫn Chủ nhiệm bộ môn

Công trình được hoàn thành tại: Trường ĐH Bách Khoa – ĐHQG – Tp HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh ngày 30 tháng 12 năm 2013 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1

2

3

4

5

LỜI CÁM ƠN

Thực hiện và hoàn thành luận án trong một khoảng thời gian khá dài với những khó khăn chung và riêng, tôi nghĩ rằng mình sẽ không bao giờ làm được nếu như bên cạnh tôi không có những quan tâm và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè Không thể nào kể ra được hết những gì mà tôi đã nhận được khi thực hiện luận văn

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Kế đến, con xin cảm ơn gia đình đã hỗ trợ và động viên trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả các quý thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa và đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, những người hỗ trợ cho em những kiến thức nền tảng vững vàng giúp em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin ơn bạn bè đã quan tâm, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

TP Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 12 năm 2013

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Với mục đích so sánh khả năng chịu stress 5 - HMF của nấm men cố định trên

bẹ lá dừa nước và nấm men tự do trong quá trình lên men sản xuất ethanol, nội dung nghiên cứu của luận văn gồm có ba phần chính

Phần 1: So sánh khả năng chịu stress 5 - HMF của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước và nấm men tự do thông qua khả năng sinh trưởng, sử dụng cơ chất và sinh tổng hợp sản phẩm

Phần 2: Khảo sát ảnh hưởng của 5 - HMF đến sự thay đổi thành phần acid béo trong màng tế bào chất của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước và nấm men tự do Chúng tôi theo dõi sự thay đổi tỉ lệ khối lượng acid béo bão hòa và không bão hòa

trong màng tế bào chất của cả nấm men cố định và nấm men tự do theo thời gian lên men

Phần 3: Nghiên cứu quá trình tái sử dụng nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước

để lên men ethanol trong điều kiện stress 5 - HMF Thí nghiệm được thực hiện trong 5 chu kỳ lên men liên tiếp Chúng tôi so sánh khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước và nấm men tự do dựa trên thời gian lên men, hàm lượng đường sót

và hàm lượng ethanol thu được qua các chu kỳ tái sử dụng

Kết quả nghiên cứu đã khẳng định ưu thế của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước so với nấm men tự do trong điều kiện stress5 - HMF.Nấm men cố định có khả

ABSTRACT

The objective of this research was to compare the 5 - HMF stress tolerance of the immobilized yeast on Nypa fruticansinsleaf sheath pieces and the free yeast during the ethanol fermentation The experimentation consisted of three sections

Section 1 – Comparison of5 - HMF stress resistance of the immobilized yeast on

Nypa fruticansleaf sheath pieces and the free yeast was based on yeast growth, substrate uptake and metabolite production

Section 2 – Investigation of the change in fatty acid level in cellular membrane

of the immobilized yeast on Nypa fruticansleaf sheath pieces and the free yeast under 5

The experimental results showed that the fixed yeast on Nypa fruticansleaf sheath pieces always exhibited higher fermentation performance than the free yeast under 5 - HMF stress conditions The fixed yeast could be reused for 5 cycles in the

acids in membrane of fixed yeast was always lower than that of the free yeast during

the fermentation

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu

đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

Lê Ngọc Huyền Trang

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Nấm men 3

2.1.1. Đặc điểm Kluyveromyces marxianus 3

2.1.2 Khái niệm về stress 4

2.1.3 Tiềm năng của Kluyveromyces marxianus để lên men sản xuất ethanol 7

2.2 5 - HMF 9

2.2.1 Giới thiệu về 5 - HMF 9

2.2.2 Cơ chế chuyển hóa 5 - HMF trong tế bào nấm men 10

2.2.3 Ảnh hưởng của 5 - HMF lên hoạt động trao đổi chất của nấm men 17

2.2.4 Những điểm mới của đề tài 22

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Nguyên liệu 23

3.1.1 Nấm men 23

3.1.2 5 - HMF 22

3.1.3 Chất mang dừa nước 23

3.1.4 Môi trường 24

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF đến quá trình lên men ethanol sử dụng

nấm men cố định trên bẹ dừa nước 30

4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF đến quá trình sinh trưởng của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 30

4.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF đến quá trình sử dụng cơ chất của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 35

4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF đến động học quá trình sinh tổng hợp sản phẩm của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 38

4.2 Tác động 5 - HMF lên thành phần lipid trong membrane tế bào 43

4.3 Khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trên bẹ dừa nước trong điều kiện chịu stress 5 - HMF 48

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1: Hình dạng khuẩn lạc và tế bào Kluyveromyces marxianus 3 Hình 2.2: Công thức cấu tạo của 5 - HMF 9 Hình 2.3: Quá trình chuyển đổi 5 - HMF xảy ra trong tế bào nấm men 13 Hình 2.4: Mô hình về quá trình chuyển hóa glucose và 5 - HMF ở nấm men

Saccharomyces cerevisiaeNRRL Y-50049 15 Hình 2.5: Sự biến đổi trong chu trình TCA khi có mặt 5 - HMF 16 Hình 2.6: Sinh trưởngSaccharomyces cerevisiaeNRRL Y – 12632 trong canh trường có chứa 5 - HMF 20 Hình 2.7: Ảnh hưởng của 5 - HMF lên sự sinh trưởng và sinh ethanol của Issatchenkia orientalis IPE 100 20 Hình 2.8: Sự sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632 (♦),

Saccharomyces cerevisiae 307-12H60(●) và Saccharomyces cerevisiae 12H120(▲) trong môi trường bổ sung 5 – HMF với nồng độ 30 mM 21 Hình 3.1: Bẹ lá dừa nước ((a): bẹ lá dừa nước vừa được cắt khỏi cây dừa nước; (b): bẹ

307-lá dừa nước đã qua quá trình bóc vỏ ngoài và tạo hình để ứng dụng làm chất mang cố định nấm men) 24 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu 24

Hình 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF ban đầu đến động học quá trình sinh tổng hợp ethanol sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định 39 Hình 4.4: Sự thay đổi tỉ lệ khối lượng của acid palmitic (C16:0) trong màng tế bào chất của nấm men tự do và nấm men cố định 44 Hình 4.5: Sự thay đổi tỉ lệ khối lượng của acid stearic (C18:0) trong màng tế bào chất của nấm men tự do và nấm men cố định 45 Hình 4.6: Sự thay đổi tỉ lệ khối lượng của acid palmitoleic (C16:1) trong màng tế bào chất của nấm men tự do và nấm men cố định 46 Hình 4.7: Sự thay đổi tỉ lệ khối lượng của acid oleic (C18:1) trong màng tế bào chất của nấm men tự do và nấm men cố định 46 Hình 4.8: Sự thay đổi tỉ lệ khối lượng của acid linoleic (C18:2) trong màng tế bào ch ất của nấm men tự do và nấm men cố định 47 Hình 4.9: Sự thay đổi độ bất bão hòa của acid trong màng tế bào chất nấm men trong môi trường bổ sung 5 - HMF 47

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 2.1: So sánh khả năng lên men của Kluyveromyces marxianus tự do và cố định trong gel alginate 8 Bảng 2.2: Các gen liên quan đến quá trình khử 5 - HMF 11 Bảng 2.3: Ảnh hưởng nồng độ 5 - HMF lên quá trình lên men ethanol của chủng

Saccharomyces cerevisiae K35 với thời gian lên men 48 giờ 17 Bảng 2.4: Ảnh hưởng nồng độ 5 - HMF lên quá trình lên men ethanol của chủng nấm men Rhodotorula mucilaginosa PTD3 II 18 Bảng 2.5: Ảnh hưởng 5 - HMF lên canh trường bổ sung 5 - HMF 19 Bảng 3.1: Thành phần môi trường cố định, nhân giống và lên men 24 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF ban đầu lên mật độ tế bào cực đại của nấm men Kluyveromyces marxianus tự do và cố định trên bẹ dừa nước trong quá trình lên men ethanol .31 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF ban đầu đến tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men tự do và cố định trên bẹ dừa nước 33 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF ban đầu đến đường sót của nấm men tự do

và cố định trên bẹ dừa nước 36 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ 5 - HMF ban dầu đến tốc độ sử dụng cơ chất của nấm men tự do và cố định trên bẹ dừa nước 37

Bảng 4.7: Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol ở những nồng độ 5 - HMF khác nhau của mẫu nấm men cố định và tự do 42 Bảng 4.8: Thời gian lên men của nấm men cố định trên bẹ dừa nước trong quá trình tái

sử dụng trong môi trường bổ sung 5 – HMF với nồng độ 3g/L 49 Bảng 4.9: Hàm lượng đường sót qua các chu kỳ lên men của nấm men tự do và cố định trong môi trường bổ sung 5 – HMF với nồng độ 3 g/L 50 Bảng 4.10: Hàm lượng ethanol qua các chu kỳ lên men của nấm men tự do và cố định trong môi trường bổ sung 5 – HMF với nồng độ 3 g/L 51

DANH MỤC MỘT SỐ THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ATP : Adenosin triphosphate

CD : Cố định

DNS : 3, 5 - dinitrosalicylic acid

FDM : Furan – 2, 5 – dimethanol

NAD+ : Nicotinamide adenine dinucleotide dạng oxi hóa

NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide dạng khử

NADP+ : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dạng oxi hóa

NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dạng khử

NMR : Nuclear magnetic resonance

TCA : Tricarboxylic acid cycle

TD : Tự do

5 – HMF : 5 – Hydroxymethylfurfural

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

Hiện nay, các nguồn năng lượng hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt dần nên nhu cầu tìm ra nguồn năng lượng thay thế trở thành mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới Ethanol sinh học được xem là nguồn năng lượng sạch và

có tiềm năng để thay thế năng lượng hóa thạch Do đó, việc nâng cao hiệu quả kỹ thuật

và giảm chi phí cho quy trình sản xuất ethanol sinh học đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong thời gian gần đây (Outlaw và cộng sự, 2005; Sanchez và Cardona, 2008; Wall và cộng sự, 2008; Vertes và cộng sự, 2010)

Với mục đích nâng cao hiệu quả kỹ thuật quá trình lên men ethanol, nấm men

cố định được xem là có nhiều ưu điểm so với nấm men tự do như làm tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men, dễ dàng tách nấm men cố định ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần trong phương pháp lên men chu kỳ và thích hợp cho phương pháp lên men liên tục (Kourkoutas và cộng

sự, 2004)

Lên men ethanol là một quá trình tỏa nhiệt Sự gia tăng nhiệt độ trong quá trình lên men sẽ gây ức chế nấm men, từ đó kéo dài thời gian lên men và làm tăng lượng đường sót trong canh trường Hiện nay, các nhà sản xuất phải sử dụng tác nhân lạnh để

ổn định nhiệt độ trong suốt quá trình lên men ethanol Với mục đích làm giảm chi phí cho quy trình sản xuất, việc sử dụng nấm men chịu nhiệt để lên men ethanol là một giải

cerevisiae truyền thống Bên cạnh đó, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu giàu cellulose từ các phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm sẽ làm giảm chi phí cho quy trình sản xuất ethanol và không ảnh hưởng tới nhu cầu lương thực thế giới

(Liu và cộng sự,2007) Thông thường, nguyên liệu giàu cellulose sẽ được tiền xử lý với

acid để phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose nhằm tạo điều kiệ n cho quá trình thủy phân và lên men tiếp theo diễn ra nhanh (Chandel và cộng sự, 2010a; Chandel và Singh, 2011) Tuy nhiên, quá trình tiền xử lý nguyên liệu cũng sinh ra nhiều chất hóa học ức chế quá trình lên men của nấm men 5 - HMF là một trong những chất ức chế làm giảm mạnh hiệu quả lên men ethanol (Liu và cộng sự,2009)

Dựa trên cơ sở những lập luận ở trên, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát khả

năng trao đổi chất của nấm men Kluyveromyces marxianus được cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước (Nypa fruticans) trong điều kiện stress 5 - HMF” Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá sự sinh trưởng, khả năng sử dụng cơ chất và sinh tổng hợp ethanol, sự thay đổi thành phần acid béo trong màng tế bào chất, khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong môi trường có chứa 5 - HMF với những hàm lượng khác nhau Chúng tôi cũng thực hiện những mẫu đối chứng với nấm men tự do trong cùng các điều kiện thí nghiệm để so sánh Hy vọng rằng, những nghiên cứu về nấm men cố định trên chất mang giàu cellulose sẽ tạo tiền đề phát triển cho việc ứng dụng nấm men

cố định để sản xuất ethanol sinh học tại Việt Nam

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1.1 Đặc điểm Kluyveromyces marxianus

Từ những thập niên 80 thế kỷ 20, lên men ethanol ở nhiệt độ cao đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Nhiều loài nấm men chịu nhiệt được phát hiện như

Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis…

(Bollók và cộng sự, 2000) Trong số các loài nấm men chịu nhiệt, Kluyveromyces marxianus được đánh giá là chủng nấm men sinh trưởng tốt và lên men hiệu quả ở nhiệt độ cao Nấm men này có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 45°C đến 52°C và lên men hiệu quả trong khoảng nhiệt độ từ 38°C đến 45°C (Nonklang và cộng

sự, 2008; Suryawati và cộng sự, 2008) Khi được so sánh với loài nấm men

Sacchromyces cerevisiae truyền thống, Kluyveromyces marxianus thể hiện khả năng sinh tổng hợp ethanol nhiều hơn khi lên men ở nhiệt độ cao (Rocha và cộng sự, 2011) Ngoài ra, Kluyveromyces marxianus còn có khả năng sử dụng được nhiều nguồn cơ

chất Nhiều loại cơ chất như xylose, sucrose, lactose, cellobiose, dịch whey đã được

nghiên cứu để ứng dụng lên men ethanol bởi nấm men Kluyveromyces marxianus

2.1.2 Khái niệm về stress

Trong quá trình trao đổi chất, nấm men gặp nhiều biến đổi diễn ra trong môi

trường Những biến đổi này có thể diễn ra trong thời gian ngắn hay thời gian dài Những thay đổi cực đoan về điều kiện vật lý, hóa học và sinh học trong môi trường

sống sẽ tác động lên tế bào nấm men và để tồn tại tế bào nấm men cần phải để thích

nghi với điều kiện mới Những điều kiện như vậy được gọi là điều kiện stress và những biến đổi của nấm men để thích nghi với điều kiện thay đổi đó được gọi là đáp ứng stress (Hohman và Manger, 2003)

Có 3 nhóm tác nhân chính gây stress lên nấm men là tác nhân vật lý, tác nhân

hóa học và tác nhân sinh học Chúng bao gồm những thay đổi về nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, bức xạ, pH, sự có mặt của mộ t số chất hóa học, nồng độ oxy, nồng độ cơ chất, sự

có mặt các loài vi sinh vật khác…Trong quá trình trao đổi chất, nấm men có thể chịu

tác động một loại stress hay nhiều loại stress khác nhau Ngoài ra, một tác nhân có thể gây ra nhiều tác động stress cùng một lúc lên tế bào nấm men Ví dụ muối NaCl tạo ra hai loại stress là stress ion và stress áp suất thẩm thấu lên tế bào vi sinh vật Nấm men

có thể tiếp xúc với nhiều loại stress cùng lúc hay tuần tự từ loại stress này qua loại stress khác Ví dụ, khi lên men ethanol với nồng độ đường lớn hơn 250g/L, nấm men

Saccharomyces cerevisiaechịu tác động của nhiều loại stress Vào thời điểm đầu quá

trình lên men, nấm men phải đối mặt với stress áp lực thẩm thấu Sau đó, khi đường

được nấm men sinh tổng hợp thành ethanol thì stress áp lực thẩm thấu giảm nhưng lượng ethanol tạo thành lại tiếp tục gây stress lên tế bào nấm men Để thích nghi với

gây ra một số đáp ứng giống nhau trong tế bào, chẳng hạn như sự hiệu chỉnh về cơ chế trao đổi chất và năng lượng, sự sinh tổng hợp các protein bảo vệ (như protein chống sốc nhiệt), hoặc sự sinh tổng hợp các hợp chất có chức năng bảo vệ tế bào (như trehalose, glycerol) (Hohmann, 2003)

Cùng một loại stress, tùy theo thời gian tác động của stress lên tế bào nấm men

mà nấm men có cơ chế thích nghi khác nhau Ví dụ, trong điều kiện ưu trương (hyperosmotic condition), nấm men Saccharomyces cerevisiae nhanh chóng mất nước

và co tế bào chất (plasmolysis) để thích nghi với điều kiện stress Sau đó, tế bào nấm men chuyển sang giai đoạn phục hồi (recovery phase) bằng cách sản xuất các chất tan tương thích và tích lũy trong tế bào đến khi có sự cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào Khi điều kiện stress giảm tế bào nấm men phân giả i những chất tích lũy nói trên để đảm bảo sự cân bằng áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào Do đó, để

hiểu rõ sự thay đổi tế bào nấm men trong điều kiện stress, chúng ta phải tiến hành theo dõi trong thời gian dài Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và vật chất nên nhiều thí nghiệm về stress chỉ được theo dõi trong thời gian ngắn Ngoài ra, tác nhân gây stress càng mạnh thì thời gian pha phục hồi càng dài Hai đặc điểm cơ bả n của đáp ứng stress là:

Thứ nhất, các đáp ứng stress sẽ giúp tế bào dần dần đạt được khả năng chịu stress mạnh hơn Khi tế bào sinh trưởng trong điều kiện có các yếu tố stress nhẹ thì

chúng sẽ quen dần với các điều kiện đó và trở nên kháng chịu tốt hơn đối với các yếu

Thứ hai, các cơ chế diễn ra ở cấp độ phân tử Điều này có nghĩa là, khi nấm men

đã có sự thay đổi để tồn tại trong điều kiện stress, nấm men sẽ có những sự biến đổi ở cấp độ phân tử để sinh trưởng và phát triển trong điều kiện mới Ví dụ, trong điều kiện stress nhiệt, các protein trong tế bào có nguy cơ duỗi mạch và biến tính, khi đó tế bào cần phải sản xuất ra nhiều hơn các protein (chaperone proteins) có chức năng sửa lỗi cho các protein khác trong tế bào (Hohmann, 2003)

Nhiều cơ chế đáp ứng với tress của nấm men được ghi nhận như tích lũy trehalose, tổng hợp các phân tử chaperone, các protein chống oxy hóa (antioxidant proteins), tích lũy các chất hòa tan (compatible solute), tổng hợp hydrophylin và một số thành phần của màng tế bào chất (plasma membrane) Trehalose giúp nấm men thích nghi với nhiều loại stress như nhiệt, thiếu nước (dehydration), sự có mặt của ethanol,

áp suất thẩm thấu và oxy hóa (Fillinger và cộng sự, 2001; Alvarez-Peral và cộng sự, 2002) Các chaperone giúp giảm tối thiểu sự biến tính protein và sửa chữa những protein bị hư hỏng (François và Parrou, 2001) Để thích nghi với stress áp suất thẩm thấu, nấm men sản xuất các chất tan tương thích (compatible solutes) Trong điều kiện

áp suất thẩm thấu cao, nấm men tổng hợp những hợp chất nói trên để giúp tế bào thích nghi Ngược lại khi cần tr ở về điều kiện áp suất thẩm thấu thấp hơn, nấm men phân hủy những hợp chất nói trên Sự tích lũy này giúp nấm men thích nghi với stress nhiệt, stress thiếu nước và stress lạnh (Welsh và cộng sự, 2000) Các hợp chất tích lũy có thể

là acid amin (như proline, glycine), glycerol, fructan, các polyol (như arabitol, mannitol) (Hohmann và Nielsen, 2000)

gây tác động bên trong tế bào Pha cuối cùng là giai đoạn tế bào đạt được sự thích nghi

với điều kiện mới, lấy lại cân bằng và tiếp tục phát triển nếu stress chưa phá hủy quá

mức hay gây chết tế bào Tuy nhiên, tùy thuộc vào mỗi loại stress mà ba pha này có thể

phân biệt rõ ràng hay không (Hohmann, 2003)

Trong ngành công nghiệp sản xuất ethanol, Saccharomyces cerevisiae là giống

vi sinh vật truyền thống Chuy ển hóa đường thành ethanol với hiệu suất khá cao (lên

đến 90%) là ưu điểm nổi bật nhất của Saccharomyces cerevisiae so với các loài vi sinh

vật lên men ethanol khác (Liang và cộng sự, 2008) Tuy nhiên, nấm men

Saccharomyces cerevisiae chỉ sinh trưởng và sinh tổng hợp ethanol trong khoảng nhiệt

độ từ 30 – 35oC Khi nhiệt độ môi trường lên men cao hơn 35oC, nấm men

Saccharomyces cerevisiaesinh trưởng chậm (Torija và cộng sự, 2002) Do đó, quá trình

lên men ethanol sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cần hệ thống để ổn định

nhiệt độ, từ đó làm gia tăng giá thành sản phẩm Trên cơ sở đó, việc sử dụng nấm men

chịu nhiệt để lên men ethanol là một giải pháp triển vọng (Kourkoutas và cộng sự,

2004) Nấm men Kluyveromyces marxianuslà loài chịu nhiệt, sinh trưởng và lên men

ethanol trong điều kiện nhiệt độ cao hơn nấm men Saccharomyces cerevisiae Lane

(2011) đã đánh giá sự sinh trưởng của nấm men Kluyveromyces marxianustrong

khoảng nhiệt độ từ 24oC đến 48oC Thí nghiệm được tiến hành trên 13 chủng

Kluyveromyces marxianus khác nhau Khi tăng nhiệt độ nuôi cấy lên 42 oC, 13 chủng

Kluyveromyces marxianus đều sinh trưởng và phát triển tốt Trong môi trường mật rỉ ,

Các nhà khoa học còn thử nghiệm sử dụng Kluyveromyces marxianus trong quá

trình lên men ethanol theo nhiều phương pháp khác nhau,từ lên men tĩnh với nồng độ

cơ chất cao (Barron và cộng sự, 1996) đến lên men tĩnh có bổ sung cơ chất (Pimpakan

và cộng sự, 2012), lên men liên tục (Love và cộng sự, 1996), lên men hai giai đoạn

(Banat và cộng sự, 1996) Kết quả đều cho thấy Kluyveromyces marxianusđều có khả

năng lên men ethanol tốt trong khoảng nhiệt độ 40 – 45oC

Khả năng chịu nhiệt của Kluyveromyces marxianuscố định cũng đã được nghiên

cứu Nấm men cố định trên bẹ lá chuối phát triển và sinh ethanol trong khoảng nhiệt độ

từ 30oC đến 45oC Nấm men cố định sử dụng đường nhanh hơn và sinh ethanol

nhiềuhơn nấm men tự do trong cùng điều kiện nhiệt độ (Le và cộng sự, 2013) Bên

cạnh đó, nghiên cứu của Xuewu và cộng sự (2010) đã so sánh khả năng lên men

ethanol của Kluyveromyces marxianus tự do và cố định trong gel alginate Nấm men cố

định trong gel alginate có khả năng lên men tốt hơn, lượng ethanol thu được nhiều hơn

và lượng đường sót thấp hơn so với nấm men tự do (bảng 2.1) Nhìn chung ,

Kluyveromyces marxianus cố định trên các chất mang khác nhau như gel alginate

(Xuewu và cộng sự, 2010), khoáng kissris (Nigam và cộng sự, 1997), bẹ lá chuối (Le

và cộng sự, 2013) đều đem lại hiệu quả lên men ethanol cao hơn so với nấm men tự do

Những kết quả nghiên cứu nói trên cho thấy Kluyveromyces marxianus là loài nấm

men có nhiều tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol đặc biệt là lên

men ethanol ở nhiệt độ cao

Bảng 2.1:So sánh khả năng lên men của Kluyveromyces marxianus tự do và cố định

Trong quá trình xử lý nguyên liệu giàu cellulose, nhiều hợp chất ức chế nấm

men được sinh ra, trong đó có 5 - HMF (Chen và cộng sự, 2008) 5 - HMF là dẫn xuất của furan, được hình thành từ phản ứng phân hủy đường hexose (Lewkowski và cộng

sự, 2001) Trong cấu tạo phân tử, 5 - HMFcó một vòng furan và một nhóm aldehyde Hợp chất này có độ hấp thutốt nhất ở bước sóng 282 nm.5 - HMF được xem là chất có khả năng ức chế mạnh mẽ quá trình sinh trưởng và lên men ethanol của nấm men (Chung và Lee, 1985; Olsson và Hägerbal, 1996; Taherzadeh và cộng sự, 2000a) Sự tồn tại 5 - HMF trong canh trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng như quá trìnhsinh tổng hợp ethanol của nấm men

2.2.2 Cơ chế chuyển hóa 5 - HMF trong tế bào nấm men

Boophy và cộng sự (1993) đã tìm thấy một hợp chất lạ xuất hiện trong canh trường có bổ sung 5 - HMF Hợp chất này có độ hấp thu mạnh ở bước sóng 222nm

Ôngcho rằng, hợp chất này là sản phẩm chuyển hóa từ5 - HMF bởi nấm men Hợp chất này được gọi là5 - HMF alcohol Nhờ vào phương pháp phân tích quang phổ NMR,

Liu và cộng sự (2004) đã xác định chính xác cấu trúc phân tử của hợp chất này Hợp

chất chuyển hóa này có cấu trúc phân tử chứa 1 vòng furan, công thức phân tử C6H8O3, tên gọi 2,5 – bis hydroxymethyl furan (furan – 2,5 – dimethanol, viết tắt FDM) Ông

cũng nhận định FDM là sản phẩm chuyển hóa từ 5 - HMF Sự có mặt FDM trong canh trường không ảnh hưởng đến sinh trưởng và quá trình sinh tổng hợp ethanol của nấm men Rõ ràng, nhóm chức aldehyde có tác dụng “gây độc” lên tế bào nấm men, vòng furan và nhóm chức rượu thì không “gây độc” Tác dụng “gây độc” của nhóm chức

aldehyde đối với tế bào nấm men đã được Leonard và Hajny (1945) công bố từ lâu

Khi có mặt 5 - HMF trong môi trường, tế bào nấm men có khả năng khử nhóm chức

aldehyde của 5 - HMF, và 5 - HMF được chuyển hóa thành FDM Quá trình khử nhóm chức aldehyde của 5 - HMF cần có sự tham gia của cofactor NADH (Petersson và cộng

sự, 2006; Liu và cộng sự, 2008b) Còn theo nhận định của Wahlbom và Hahn-Hagerdal (2002), quá trình khử nhóm chức aldehyde của 5 - HMF cần có sự tham gia của cofactor NADPH Tuy nhiên, một số nghiên cứu sau này cho rằng cả hai cofactor NADH và NADPH đều cần cho quá trình khử nhóm aldehyde của 5 - HMF (Nilsson và cộng sự, 2005)

cộng sự (2008b) còn cho rằng, các enzyme được mã hóa từ những gen khác nhau cần các cofactor riêng để thực hiện quá trình khử trên cùng một cơ chất Chẳng hạn như,

enzyme được mã hóa bởi đoạn gen GRE3 và ALD4 sẽ hoạt động tốt khi có cofactor

NADH, còn enzyme được mã hóa bởi gen ADH6 và ADH7 sẽ xúc tác phản ứng khử

hiệu quả khi có cofactor NADPH Như vậy, quá trình khử nhóm aldehyde của 5 - HMF

ở tế bào nấm men là kết quả của sự kết hợp hoạt động c ủa một phức hệ enzyme trong

tế bào và cần cả hai cofactor NADH và NADPH (Liu và cộng sự, 2008b)

Bảng 2.2: Các gen liên quan đến quá trình khử 5 - HMF

ADH7 1.1.1.2 NADH 5 - HMF Liu và cộng sự, 2008b

ALD4 1.2.1.5 NADH 5 - HMF Liu và cộng sự, 2008b

GRE3 1.1.1.21 NADH 5 - HMF Liu và cộng sự, 2008b

ADH1 1.1.1.190 NADH 5 - HMF Almeida và cộng sự, 2008

Khi tồn tại 5 - HMF trong môi trường, 5 - HMF gây ra tác dụng ức chế một số

enzyme quan trọng trong quá trình trao đổi chất như alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase (Modig và cộng sự, 2002) Điều này dẫn đến quá trình trao đổi chất bị gián đoạn Theo Liu và cộng sự (2004), chu trình đường phân

và chu trình pentose phosphate là hai con đường trao đổi glucose chính nhằm cung cấp năng lượng và những chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm cho quá

trình đồng hóa và sinh tổng hợp ethanol Ngoài ra, như đã trình bày ở trên, khi 5 - HMFtồn tại trong canh trường thì sẽ xảy ra sự cạnh tranh sử dụng NADH và NADPH NADH cần cho quá trình lên men để sinh ra CO 2 và ethanol Khi nguồn NADH trong

tế bào bị cạnh tranh thì quá trình khử acetaldehyde thành ethanol bị gián đoạn NADPH cần cho quá trình sinh tổng hợp acid amin và các nucleotide của tế bào nấm

men.Do đó, khi có mặt 5 - HMF trong canh trường nuôi cấy, nấm men không sử dụng

glucose (Liu và cộng sự, 2004), điều này thể hiện bằng sự kéo dài pha lag (Wahlbom

và Hägerdal, 2002; Liu và cộng sự, 2004) Khi đó, quá trình tăng sinh khối nấm men

cũng bị hạn chế và quá trình sinh tổng hợp ethanol bị ngừng lại khi có mặt 5 - HMF

trong môi trường (Liu và cộng sự, 2012)

Hình 2.3: Quá trình chuyển đổi 5 - HMF xảy ra trong tế bào nấm men

Saccharomyes cerevisiae (Liu và cộng sự, 2008a)

Theo hình 2.4, khi 5 - HMF tồn tại trong canh trường, nấm men không sinh

trưởng và các gen sinh tổng hợp enzyme tham gia trong chu trình đường phân và

pentose phosphate bị kìm hãm Khi nấm men thích nghi với 5 - HMF, lượng enzyme

hexokinase được mã hóa bởi các gen HXK1, HXK2, GLK1 cần thiết cho giai đoạn đầu

nguyên nhân chính làm glucose được chuyển hóa theo chu trình pentose phosphate nhiều hơn so với chu trình đường phân Sự tăng cường quá trình chuyển hóa từ glucose – 6 – phosphate thành 6 – phosphogluconolacton, từ 6 - phosphogluconate thành ribulose – 5 – phosphate được xúc tác bởi enzyme glucose – 6 phosphate dehydrogenase sẽ làm tăng lượng NADPH trong tế bào nấm men Ngoài ra, lượng enzyme glyceraldehyde phosphate dehydrogenase được mã hóa bởi các gen TDH1, TDH2, TDH3 cũng tăng lên Điều này làm tăng quá trình chuyển hóa glyceraldehyde –

3 – phosphate thành glycerate – 1,3 - diphosphate, làm tăng lượng NADH trong tế bào nấm men Lượng NAD+ và NADP+ sinh ra trong quá trình khử 5 - HMF và acetaldehyde lại tiếp tục cung cấp cho các quá trình được trình bày ở trên để tái tạo

NADPH và NADH cần cho quá trình khử 5 - HMF và acetaldehyde Sự chuyển hóa NADH/NAD+ và NADPH/NADP+ tạo ra sự cân bằng oxy hóa khử trong tế bào Sự điều chỉnh này của tế bào nấm men sẽ tạo ra lượng NADH cần cho quá trình lên men

để chuyển pyruvate thành CO2 và ethanol và NADPH cần cho quá trình sinh tổng hợp amino acid và nucleotide, từ đó giúp tế bào nấm men thích nghi với môi trường chứa 5

- HMF Sự gia tăng hàm lượng của các enzyme được mã hóa bởi các gen ZWF1, SOL3, GND1, GND2 và TDH1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái tạo NADH

và NADPH trong tế bào

Mũi tên và kí tự đen biểu thị phản ứng diễn ra bình thường

Mũi tên và kí tự màu xanh lá cây biểu hiện phản ứng được tăng cường

Mũi tên và kí tự đỏ biểu hiện phản ứng bị ức chế

Vòng tròn xanh da trời biểu hiện vị trí có lượng NADH và NADPH tăng lên

Vòng tròn màu cam thể hiện quá trình khử aldehyde

Đường đứt khúc biểu hiện đường cân bằng cofactor

Ngoài ra, nấm men thích nghi với 5 - HMF còn có khả năng tái tạo lượng NADH và NADPH thông qua chu trình TCA (tricarboxylic acid cycle) Nhưng để có

cơ chất cho chu trình TCA hoạt động, nấm men phải dị hóa proline, serine và alanine Các gen CHA1, ALT1, PUT1, PUT2, CAR1, ARG1, ARG3, ARG4, ARG5, ARG6, ARG7, ARG8, LYS4, LYS14, và LYS20 liên quan đến quá trình này (Ma và Liu 2010) Ngoài ra, Liu đã nhận định, đây là con đường tạo ra nguồn ATP duy trì hoạt

động sống của nấm men trong điều kiện stress 5 - HMF Hình 2.5 thể hiện những con đường liên quan đến sự biến đổi serine, alanine, proline, lysine và arginine đối với chu trình TCA để cung cấp ATP và cofactor NADH và NADPH cho nấm men trong điều kiện stress 5 - HMF

2.2.3 Ảnh hưởng của 5 - HMF lên hoạt động trao đổi chất của nấm men

Ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp ethanol

Khi 5 - HMF có mặt trong môi trường, quá trình lên men sinh ethanol sẽ bị ảnh

hưởng Cụ thể, lượng ethanol được sinh ra và hiệu suất sinh tổng hợp ethanol bị giảm

Nồng độ 5 - HMF càng tăng thì lượng ethanol và hiệu suất sinh tổng hợp ethanol càng

giảm Lee và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 5 - HMF lên quá

trình sinh t ổng hợp ethanol của chủng Saccharomyces cerevisiae K35 với môi trường

lên men chứa 5 - HMF với nồng độ 1, 3, 5 g/L và so sánh với môi trường đối chứng

không bổ sung 5 - HMF Sau 48h nuôi cấy, ở nồng độ 5 - HMF là 1 và 3 g/L, hiệu suất

sinh tổng hợp ethanol chênh lệch với môi trường đối chứng không đáng kể Tuy nhiên,

khi nồng độ 5 - HMF ban đầu trong môi trường tăng lên đến 5g/L thì hiệu suất sinh

tổng hợp ethanol giảm 40% khi được so với mẫu đối chứng (bảng 2.3)

Bảng 2.3: Ảnh hưởng nồng độ 5 - HMF lên quá trình lên men ethanol của chủng Saccharomyces cerevisiae K35 với thời gian lên men 48 giờ (Lee và cộng sự, 2011)

Nồng độ 5 - HMF

(g/L)

Lượng glucose được nấm men

chuyển hóa (% so với lượng ban đầu)

Hiệu suất sinh tổng hợp

ethanol (g/g)

lượng ethanol tạo thành giảm từ 55 - 80% so với giá trị lý thuyết Tốc độ sử dụng

glucose và sinh tổng hợp ethanol của nấm men bị giảm dần khi nồng độ 5 - HMF tăng

Tốc độ sinh ethanol (g/L.h)

Lượng ethanol (%) so với giá trị lý thuyết

Nồng độ 5 - HMF khi kết thúc lên men

sinh tổng hợp ethanol ở nấm men được tăng cường là để đáp ứng nhu cầu về ATP của

Canh trường bổ sung 5 – HMF với nồng độ 4g/L

Hiệu suất sinh

Ảnh hưởng lên sự sinh trưởng nấm men

5 - HMFcũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men Thời gian pha lag thể

hiện sự thích nghi của nấm men trong môi trường có chứa 5 - HMF Thời gian pha lag

có thể bị kéo dài vài giờ đến vài ngày tùy theo nồng độ 5 - HMF ban đầu trong môi

trường lên men Sau thời gian pha lag, nấm men có khả năng sử dụng đường và sinh

ethanol Nghiên cứu Liu và cộng sự (2004) sử dụng Saccharomyces cerevisiaeATCC

Hình 2.6:Sinh trưởngSaccharomyces cerevisiae NRRL Y – 12632 trong môi trường

có chứa 5 - HMF (Liu và cộng sự, 2004)

Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Kwon (2011) với

chủng nấm men chịu nhiệt Issatchenkia orientalis IPE 100 Thí nghiệm được thực hiện

với môi trường bổ sung 5 - HMF với nồng độ là 1, 2, 3, 5, 7 g/L Thời gian pha lag

tăng và lượng sinh khối tế bào giảm khi tăng nồng độ 5 - HMFtrong môi trường ban

đầu (hình 2.7)

Hình 2.7:Ảnh hưởng của 5 - HMF lên sự sinh trưởng và sinh ethanol của

Issatchenkia orientalis IPE 100 (Kwon và cộng sự, 2012)

Thời gian lên men (giờ)

(■) – 0 g/L (●) – 1 g/L (▲) – 2 g/L (▼) – 3 g/L (◄) – 5 g/L (►) – 7 g/L

chủng còn lại Tuy nhiên lượng sinh khối cực đại thu được ở 3 chủng nấm men sử dụng

là tương đương nhau (hình 2.8)

Hình 2.8: Sự sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632 (♦), Saccharomyces cerevisiae 307-12H60(●) và Saccharomyces cerevisiae 307- 12H120(▲) trong môi trường chứa 30 mM 5 - HMF (Liu và cộng sự, 2005)

Thời gian pha lag được dùng để đánh giá độ bền của chủng vi sinh vật khảo sát

trong môi trường có chất ức chế Một số chủng nấm men thích nghi nhanh với stress5 -

HMF, ngược lại một số chủng khác thích nghi rất chậm Như đã trình bày ở phần trên,

khi 5 - HMF có mặt trong môi trường, nhiều enzyme quan trọng như alcohol

dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase bị ức chế

(Modig và cộng sự, 2002) Một số enzyme này cần thiết cho quá trình lên men ethanol

của nấm men Do đó, quá trình trao đổi chất của nấm men bị gián đoạn Trong giai

đoạn pha lag, nấm men biến đổi để thích nghi với điều kiện stress 5 - HMF Khi đó,

một lượng lớn các enzyme alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase and

pyruvate dehydrogenase sẽ được nấm men sinh tổng hợp (Liu 2008a,b), hay nấm men

Thời gian lên men (giờ)

2.2.4 Những điểm mới của đề tài

Đối với những vấn đề liên quan đến luận văn, sau khi thực hiện xong phần tổng quan tài liệu, chúng tôi có một số nhận định như sau:

Lignocellulose là nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học được quan tâm

hiện nay, tuy nhiên những chất ức chế sinh ra khi xử lý nguyên liệu bằng acid loãng sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men và hiệu suất sinh tổng hợp ethanol đặc biệt

là 5 - HMF Tại Việt Nam, đến nay, chúng tôi chưa tìm thấy công bố của các nhà khoa học trong nước về sự ảnh hưởng 5 - HMF đến nấm men sinh ethanol Ngoài nước, đã

có một số công trình nghiên cứu về tác động 5 - HMF đến nấm men trong quá trình lên men ethanol như nghiên cứu của Taherzadeh và cộng sự (2000), Klinke và cộng sự (2004), Pienkos và cộng sự (2009), Yang và cộng sự (2010), Ma và Liu (2010), Lee và cộng sự (2011), Fonseca và cộng sự (2011), Kwon và cộng sự (2011), Liu và cộng sự (2004, 2005, 2006, 2008, 2009, 2011), Azra Vajzovic và cộng sự (2012), Landaeta và cộng sự (2012)

Tuy nhiên, có một số vấn đề mà những công bố trên thế giới chưa đề cập đến:

i Ảnh hưởng của 5 - HMF lên nấm men cố định và khả năng tái sử dụng nấm men

cố định trong điều kiện stress 5 - HMF: Những nghiên cứu trước đây chỉ được thực

hiện trên nấm men tự do Chúng tôi chưa tìm thấy công bố nào về sự ảnh hưởng của 5 - HMF đến khả năng lên men ethanol của nấm men cố định

ii Ảnh hưởng của 5 - HMF đối với nấm men Kluyveromyces marxianus:

Kluyveromyces marxianus là loài nấm men có nhiều tiềm năng lên men ethanol sinh

chưa có công bố khoa học nào đề cập đến vấn đề này Những thông tin về sự biến đổi

của thành phần acid béo trong màng tế bào sẽ cho thấy sự thích nghi của tế bào với môi

Chúng tôi sử dụng nấm men Kluyveromyces marxianusdo phòng thí nghiệm Vi

sinh, bộ môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa TPHCM cung cấp

5 - HMF dạng bột với độ tinh khiết 99% do công ty Xi'an Purem Biological Technology (Trung Quốc) sản xuất

Chất mang được sử dụng trong đề tài này là bẹ lá dừa nước Phần bẹ lá từ cây

dừa nước (Nypa fruticans)được thu nhận ở khu vực quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh

Quy trình tạo chất mang bẹ lá dừa nước như sau: bẹ lá dừa nước sau khi thu nhận được

loại bỏ phần lá, rửa sạch bằng nước, sau đó để ráo, tách bỏ lớp vỏ ngoài và cắt thành

hình khối chữ nhật với kích thước 3cm x 3cm x 0.5cm, sau đó được hấp tiệt trùng trước

khi cố định nấm men Bẹ lá dừa nước và chất mang bẹ lá dừa nước được thể hiện ở

hình 3.1

(a) (b)

Hình 3.1: Bẹ lá dừa nước ((a): bẹ lá dừa nước vừa được cắt khỏi cây dừa nước; (b):

bẹ lá dừa nước đã qua quá trình bóc vỏ ngoài và tạo hình để ứng dụng làm chất

mang cố định nấm men)

Môi trường nhân giống, môi trường cố định và môi trường lên men về cơ bản có

thành phần giống nhau, nhưng hàm lượng glucose khác nhau trong mỗi loại môi trường