Nghiên cứu điều kiện biểu hiện và bước đầu tinh chế bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư từ hệ vi sinh vật đường ruột người bằng các hệ thống biểu hiện khác nhau ở e coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HUỲNH THỊ BÍCH MAI NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN VÀ BƯỚC ĐẦU TINH CHẾ BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT NGƯỜI BẰNG CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN KHÁC NHAU Ở E coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HUỲNH THỊ BÍCH MAI NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN VÀ BƯỚC ĐẦU TINH CHẾ BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT NGƯỜI BẰNG CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN KHÁC NHAU Ở E coli LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Mã số: Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY ThS NGUYỄN THỊ KIM CÚC Chủ tịch Hội đồng: TS ĐẶNG THÚY BÌNH Phịng ĐT Sau Đại học Cơng nghệ sinh học 8420201 1399/QĐ-ĐHNT ngày 27/11/2018 1140/QĐ-ĐHNT ngày 10/9/2019 26/9/2019 KHÁNH HỊA – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu điều kiện biểu hiện và bước đầu tinh chế bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ hệ vi sinh vật đường ruột người bằng hệ thống biểu hiện khác ở E coli” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, ngày 15 tháng năm 2019 Tác giả luận văn Huỳnh Thị Bích Mai i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận giúp đỡ tạo điều kiện tốt quý phòng ban Trường Đại học Nha Trang, Trung tâm Thí nghiệm thực hành Trường Đại học Nha Trang Đặc biệt hướng dẫn tận tình PGS.TS Nguyễn Văn Duy, ThS Nguyễn Thị Kim Cúc TS Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang giúp tơi hồn thành tốt đề tài Qua đây, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến CN Trần Thị Châu Loan, CN Trần Thanh Hồng em nhóm nghiên cứu giúp đỡ tơi thời gian hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Viện Công nghệ sinh học Môi trường thầy cô Trường Đại học Nha Trang giảng dạy, định hướng truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian ngồi ghế nhà trường, giúp tơi có tảng kiến thức để làm hành trang cho bước vào đời Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ủng hộ, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 15 tháng năm 2019 Tác giả luận văn Huỳnh Thị Bích Mai ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi LỜI MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh ung thư bacteriocin kháng ung thư 1.1.1 Bệnh ung thư tác động đến kinh tế xã hội quốc gia giới 1.1.2 Nguyên nhân chế gây ung thư 1.1.3 Các phương pháp điều trị .9 1.1.4 Bacteriocin kháng ung thư 11 1.2 Biểu tinh chế protein tái tổ hợp E coli 15 1.2.1 Nguyên lý quy trình biểu tinh chế protein tái tổ hợp 15 1.2.2 Các hệ thống vector biểu E coli .17 1.2.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến khả hòa tan protein tái tổ hợp 19 1.3 Tình hình nghiên cứu biểu tinh chế bacteriocin kháng ung thư từ hệ vi sinh vật đường ruột người 21 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 21 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 25 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 2.3 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3.1 Vector 25 2.3.2 Gen cnazu8 oligonucleotide 27 2.3.3 Chủng vi sinh vật 28 2.3.4 Enzyme hóa chất khác 28 iii 2.4 Máy móc thiết bị chuyên dụng 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1 Khuếch đại gen phương pháp PCR 30 2.5.2 Điện di DNA .32 2.5.3 Điện di protein 32 2.5.4 Tinh sản phẩm PCR plasmid kit PCR purification (Thermo Scientific) .34 2.5.5 Xử lý gen cnazu8, cắt mở vòng pE-SUMO3 enzyme cắt giới hạn 35 2.5.6 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp 36 2.5.7 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli OminiMax E coli BL21 khả nạp 36 2.5.8 Tách chiết plasmid tái tổ hợp kit Plasmid Purification Mini (Themo Fisher Scientific) 37 2.5.9 Giải phân tích trình tự gen .38 2.5.10.Kiểm tra biểu protein dung hợp E coli BL21 39 2.5.11 Khảo sát điều kiện biểu protein tái tổ hợp .40 2.5.12.Tăng tính hịa tan protein tái tổ hợp 42 2.5.13.Bước đầu tinh chế protein mục tiêu cột HisPur Ni-NTA 44 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Biểu bước đầu tinh chế protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 vector pET42a(+) 46 3.1.1 Khảo sát thời gian biểu protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 46 3.1.2 Khảo sát khả hòa tan protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 48 3.1.3 Khảo sát tinh chế protein tái tổ hợp GST-6xHis-TEV-Cnazu8 50 3.2 Tạo dòng gen cnazu8 vào vector pE-SUMO3 53 3.2.1 Thu nhận gen cnazu8 53 3.2.2 Cắt mở vòng vector pE-SUMO3 55 3.2.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli OminiMax 56 3.2.4 Kết giải trình tự kiểm tra hiệu tách dòng 59 3.3 Biểu protein 6xHis-SUMO3-Cnazu8 60 3.3.1 Kiểm tra biểu protein 6xHis-SUMO3-Cnazu8 60 iv 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả biểu protein 6xHis-SUMO3-Cnazu8 63 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG đến khả biểu protein 6xHisSUMO3-Cnazu8 65 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng đến protein 6xHis-SUMO3-Cnazu8 67 3.4 Bước đầu tinh chế protein 6xHis-SUMO3-Cnazu8 .67 3.4.1 Tăng khả hòa tan protein 6xHis-SUMO3-Cnazu8 67 3.4.2 Bước đầu tinh chế protein 6xHis-SUMO3-Cnazu8 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU Tên đầy đủ Ký hiệu mA Giải thích Đơn vị đo cường độ dịng Miliampe điện Đơn vị đo thể tích µl Microliter APS Amonium Persulphate Bp Base pair Cặp bazơ CAFs Cancer Associated Fibroblasts Nguyên bào sợi liên kết ung thư cs Cộng dATP Deoxyadenosine Triphosphate dCTP Deoxycytidine Triphosphate dGTP Deoxyguanosine Triphosphate dTTP Deoxythymidine Triphosphate DTT Dichloro Diphenyl Trichlorothane DNA Deoxyribonucleic Acid ECM Extracellular Matrix E coli Escherichia coli EDTA EthyleneDiamine TetraAcetate Chất ngoại bào acid Et al Và cộng FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ G Gam GST Glutathione-S-Transferase His Histidine vi IPTG Isopropyl-𝛽-DThiogalactopyranoside kDa Kilodalton LB Luria Bertani Broth M Mole mM Milimole MCS Multiple Cloning Sites MMP Matrix Metaloproteinase OD Optical Density Mật độ quang PAGE Polyacrylamide Gel Điện di gel polyacrylamide Vùng cắt đa vị trí Electrophoresis PCR Polymerase Chain Reaction PMSF PhenylMethylSulfonyl Fluoride RNA Ribonucleic Acid RBS Ribosome Binding Site SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAFs Tumor Associated Fibroblast Nguyên bào sợi khối u TAM Tumor Associated Macrophage Đại thực bào liên kết khối u TEMED N,N,N’,N’ Vị trí gắn ribosome Tetramethylethylenediamine TEV Protease Tobacco Etch Virus Protease V Volt VEGFR2 Vascular Đơn vị đo hiệu điện Endothelial Growth Yếu tố tăng trưởng nội mạc Factor Receptor mạch máu vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính chống ung thư bacteriocin 12 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR thu nhận gen 31 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 32 Bảng 2.4 Thành phần gel polyacrylamide .33 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn .35 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối 36 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra kết tạo dòng .38 viii 70 Nguyen, TKC, Pham, TT, Huynh, TBM, Tran, TH, Packianather, M, Le, CH & Nguyen, VD 2019a, 'Design and development of an novel anticancer peptide from human gut microbiome by using recombinant protein engineering', In: 7th International Conference on the Development of Biomedical Engineering in Vietnam (BME7): Translational Health Science and Technology for Developing Countries IFMBE Proceedings, 69 (69) Springer Verlag, Singapore, pp 837-843 71 Nguyen, VD, Nguyen, TT, Pham, TT, Packianather, M & Le, CH 2019b, 'Molecular screening and genetic diversty analysis of anticancer Azurin-encoding and Azurinlike genes in human gut microbiome deduced through cultivation-dependent and cultivation-independent studies', International Microbiology, pp 1-13 72 Nguyen, VD & Nguyen, HHC 2015, 'Molecular Screening of Azurin-Like Anticancer Bacteriocins from Human Gut Microflora Using Bioinformatics', Advances in Intelligent Systems and Computing, vol 358, pp 219-229 73 Paula, AD, Oliveria, MDd, Paula, SO, Pereira, MCB, Breukink, E & Mantovani, HC 2012, 'Toxicity of bovicin HC5 against mammalian cell lines and the role of cholesterol in bacteriocin activity', Microbiology, vol 158 (Pt 11), pp 2851-2858 74 Peciak, K, Tommasi, R, Choi, J, Brocchini, S & Laurine, E 2014, 'Expression of soluble and active interferon consensus in SUMO fusion expression system in E coli', Protein expression and purification, vol 99, pp 18-26 75 Piserchio, A, Ghose, R & Cowburn, D 2009, 'Optimised bacterial expression and purification of the c-Src catalytic domain for solution NMR studies', Journal Biomol NMR, vol 44, no 2, pp 87-93 76 Pugsley, AP, Francetic, O, Driessen, AJ & Loeno, V 2004, 'MicroMeeting Getting out: protein traffic in prokaryotes', Mol Microbiol, vol 52(1), pp 3-11 77 Punj, V, Bhattacharyya, S, Saint-Dic, D, Vasu, C, Cunningham, EA, Graves, J, Yamada, T, Constantinou, AI, Christov, K, White, B, Li, G, Majumdar, D, Chakrabarty, AM & Gupta, TK 2004, 'Bacterial cupredoxin azurin as an inducer of apoptosis and regression in human breast cancer', Oncogene, vol 23, no 13, pp 2367-78 78 Raguz, S & Yagüe, E 2008, 'Resistance to chemotherapy: new treatments and novel insights into an old problem', Brit Journal Cancer, vol 99, pp 387-391 81 79 Riedl, S, Rinner, B, Asslaber, M, Schaider, H, Walzer, S, Novak, A, Lohner, K & Zweytich, D 2011, 'Biochimica et Biophysica Acta In search of a novel target - Phosphatidylserine exposed by non-apoptotic tumor cells and metastases of malignancies with poor treatment ef fi cacy', BBA - Biomembranes, vol 1808, pp 2638-2645 80 Riley, MA 2009, 'Bacteriocins, Biology, Ecology, and Evolution', Encyclopedia of Microbiology, pp 32-44 81 Rosano, GL & Ceccarelli, EA 2014, 'Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges', Front Microbiol, vol 5, pp 1-17 82 Schneider, K 2001, 'Counseling about cancer: Strategies for genetic counseling', New York: John Wiley and Sons, pp 496 83 Schumann, W & Ferreira, LS 2004, 'Production of recombinant proteins in Escherichia coli', Genet Molecular Biol, vol 27, pp 442-453 84 Schweizer, F 2009, 'Cationic amphiphilic peptides with cancer-selective toxicity', European Journal of Pharmacology, vol 625(1-3), pp 190-194 85 Sedov, SA, Belogurova, NG, Shipovkov, S, Levashov, AV & Levashov, PA 2011, 'Lysis of Escherichia coli cells by lysozyme: Discrimination between adsorption and enzyme action', Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, vol 88, pp 131-133 86 Shaikh, F, Abhinand, P& Ragunath, P 2012, 'Identification & characterization of Lactobacillus salavarius bacteriocins and its relevance in cancer therapeutics', Bioinformation, vol 8, pp 589-594 87 Shitu, JO, Woodle, JM, Wnek, R, Chartrain, M & Hewitt, CJ 2009, 'Induction studies with Escherichia coli expressting recombinant interleukin-13 using multi-parameter flow cytometry', Biotechnol Lett, vol 31, pp 577-584 88 Siegel, RL, Miller, KD & Jemal, A 2016, 'Cancer statistics', CA Cancer J Clin, vol 66, pp 7-30 89 Sloan, FA & Gelband, H 2007, 'Cancer causes and risk factors and the Elements of cancer control', National Academies Press (US), vol 13 90 Smarda, J & Oravec, C 1989, 'Cytocidal effect of bacteriocin on lymphoma cells', Akt Klin Onkol, vol 21, pp 209-212 91 Sorensen, HP & Mortensen, KK 2005, 'Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli', Microb Cell Factories, vol 8, pp 1-8 82 92 Stewart, BW & Kleihues, P 2003, 'World Cancer Report', Lyon, France: IARC Press 93 Stewart, BW & Wild, CP (eds) 2014, 'World cancer report 2014', International Agency for Research on cancer, pp 630 94 Studier, FW & Moffattf, BA 1986, 'Use of Bacteriophage T7 RNA Polymerase to Direct Selective High-level Expression of Cloned Genes', Journal of Molecular Biology, vol 189, pp 113-130 95 Studier, FW, Rosenberg, AH, Dunn, JJ & Dubendorff, JW 1990, 'Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes', Methods Enzymol, vol 185, pp 60– 89 96 Torre, LA, Bray, F, Siegel, RL, Ferlay, F, Tieulent, JL & Jemal, A 2015, 'Global Cancer Statistics, 2012', Cancer, vol 65, no 2, pp 87-108 97 Wagner, S, Klepsch, MM, Schlegel, S, Appel, A, Draheim, R, Tarry, M, Högbom, M, van Wijk, KJ, Slotboom, DJ & Persson, JO 2008, 'Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression', Proc Natl Acad Sci U S A, vol 105, pp 14371-14376 98 Wang, H, Xiao, Y, Fu, L, Zhao, H, Zhang, Y, Wan, X, Qin, Y, Huang, Y, Gao, H & Li, X 2010, 'High-level expression and purification of soluble recombinant FGF21 protein by SUMO fusion in Escherichia coli', BMC Biotechnol, vol 10, no 14 99 Watanabe, T & Saito, H 1980, 'Cytotoxicity of pyocin S2 to tumor and normal cells and its interaction with cell surfaces', Biochimica et Biophysica Acta, vol 633, pp 77-86 100 World Health Organization 2018, International Agency for Research on Cancer 101 World Health Organization 2014, Viet Nam: Cancer country profiles 2014 102 Yamada, T, Christov, K, Das Gupta, TK & Beattie, CW 2011, 'Mechanism of action of p28, a first-in-class, non-HDM2 mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination', Journal of Clinical Oncology, vol 108(12), pp 2495-2504 103 Yamada, T, Goto, M, Punj, V, Zaborina, O, Chen, ML, Kimbara, K, Majumdar, D, Cunningham, E, Gupta, TKD & Chakrabarty, AM 2002, 'Bacterial redox protein azurin, tumor suppressor protein p53, and regression of cancer', Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol 99, no 22 104 Yamada, T, Goto, M, Punj, V, Zaborina, O, Chen, ML, Kimbara, K, Majumdar, D, Cunningham, E, Gupta, TKD & Chakrabarty, AM 2004, 'Apoptosis or growth arrest: Modulation of tumor suppressor p53 specificity by bacterial 83 redox protein azurin', Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol 101, no 14, pp 4770-4775 105 Xing, F, Saidou, J & Watabe, K 2010, 'Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment', Frontier Bioscience, vol 15, no 1, pp 166-179 106 Yildiz, M & Askin, H 2019, 'Heterologous expression of azurin from Pseudomonas aeruginosa in food-grade Lactococcus lactis', Prep Biochem Biotechnol, vol 49, no 8, pp 800-806 107 Zhang, L, Li, X, Wei, D, Wang, J, Shan, A & Li, Z 2015, 'Expression of plectasin in Bacillus subtilis using SUMO technology by a maltose - inducible vector', Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, vol 42, no 10, pp 1369-76 108 Zhao, H, Sood, R, Jutila, A, Bose, S, Fimland, G, Meyer, JN & Kinnunen, PKJ 2006, 'Interaction of the antimicrobial peptide pheromone Plantaricin A with model membranes: Implications for a novel mechanism of action', Biochimica et Biophysica Acta, vol 1758, pp 1461-1474 109 Zheng, Y & Roberts, R 2007, 'Selection of restriction endonucleases using artificial cells', Nucleic Acids Research, vol 35, no 11, pp e83 84  Tài liệu từ internet Novagen, Competent cell, truy cập tháng 3/2018, Quyagen 2009, QIAquick PCR Purification Kit Protocol, truy cập tháng 5/2018, Invitrogen 2004, One Shot OmniMAX™ T1 Phage-Resistant Cells, truy cập tháng 3/2018, Thermo Scientific, GeneJET Plasmid Miniprep Kit, Truy cập tháng 5/2018, Thermo Scientific, HisPur™ Ni-NTA Spin Columns, 0.2 mL, truy cập tháng 8/2018, World Health Organization, www.who.int/cancer 85 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số trang Môi trường ni cấy, đệm Hóa chất điện di SDS-PAGE Pha hóa chất sonication Pha hóa chất tinh chế Sơ đồ vector pET42a(+), pE-SUMO3-Cnazu8 Kết giải trình tự gen cnazu8 vector pE- SUMO8 Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan PHỤ LỤC Môi trường nuôi cấy, đệm Môi trường LB - Thành phần Thành phần Gam/ lit Casein enzymic hydrolysate 10.000 Yeast extract 5.000 Sodium chloride 10.000 pH (25°C) 7.5±0.2 - Cách pha 100 ml môi trường Cân 2,5 gam môi trường LB, cho 100 ml nước cất, hịa tan hồn toàn hấp khử trùng 121 oC 15 phút Sau chờ nhiệt độ mơi trường cịn khoảng 40 ºC – 50 ºC bổ sung kháng sinh kanamycine/ampicillin để đạt nồng độ 30 µg/ml Mơi trường LB-agar Bước 1: Cân 1,5 g LB 1,2 g agar (agar %), thêm 60 ml nước cất, lắc cho tan hấp khử trùng 121 °C 20 phút Bước 2: Để nguội đến khoảng 40 °C thêm ampicilin mg/ml để nồng độ cuối 30 μl/ml vào môi trường, lắc tiến hành đổ đĩa thạch Đổ đĩa với thể tích đĩa 20 ml Để nguội Đệm ly giải Cách pha 100 ml đệm ly giải màng tế bào (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM NaCl; mM mercaptoethanol; sau thêm lysozym với nồng độ đạt mg/ml) Pha stock: + Tris-HCl pha nồng độ 0,5 M, NaCl pha nồng độ M, lysozym pha nồng độ 10 mg/ml + Tris-HCl 0,5 M: cân 0,6 g Tris-HCl thêm 10 ml nước cất lần, hòa tan, khử trùng 121°C 20 phút + NaCl 1M: Cân 0,585 g thêm 10 ml nước cất lần, hòa tan, khử trùng 121°C 20 phút + Pha lyzozyme 10 mg/ml: Cân 50 mg lysozyme hòa tan ml nước cất lần, lọc vô trùng màng lọc vô khuẩn PHỤ LỤC Hóa chất điện di SDS-PAGE Monomere solution( 40 %) Acrylamide (FW 71,08) 10 g Bis-acrylamide (FW 154,2) 0,2 g Nước cất 25 ml Giữ tháng tối oC (Acrylamide chất độc thần kinh, thao tác phải cẩn thận) Resolving gel buffer 4X (0,5 M Tris HCl, pH 8,8) Tris base (FW 121,1) 1,815 g Nước cất thêm 7,5 ml Chỉnh pH 8,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 10 ml Giữ tháng tối 4oC Stacking gel buffer 4X (0,5 Tris HCl, pH 6,8) Tris base (FW 121,1) 1,5 g Nước cất thêm 20 ml Chỉnh pH 6,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 25 ml Giữ tháng tối oC SDS 10 % SDS 2,5 g Nước cất 25 ml Giữ tháng nhiệt độ phòng Ammonium persulfate Ammonium persulfate 0,2 g Nước cất ml Pha để dùng không để lại Treatment buffer 2X 4X Stacking gel buffer 2,5 ml SDS 10 % ml Glycerol ml Dithiothreitol (DTT) ( FW 154,2) 0,31 g Bromophenol Blue 0,002 g Thêm nước cất 10 ml Chia nhỏ thành thể tích 0,5 ml giữ tháng – 20 oC Tank buffer (0,025 M Tris HCl; 0,192 M Glycine; 0,1 % SDS; pH 8,3) Tris (FW 121,1) 3,028 g Glycine 14,413 g SDS 1g Nước cất lít Giữ tháng nhiệt độ phịng Dung dịch nhuộm gel (Staining solution) Coomassie Brilliant Blue G- 250: 0,025g Methanol: 40 ml Acid acetic: 10 ml Bổ sung nước cất vừa đủ 100 ml Dung dịch rửa màu Methanol: 40 ml Acid acetic: 10 ml Nước cất vừa đủ 100 ml PHỤ LỤC Pha hóa chất sonication Sonication buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole) NaH2PO4 1,138 g NaCl 0,351 g Imidazole 0,2 ml imidazole 1M Thêm 15 ml nước cất, lắc cho tan đều, điều chỉnh pH HCl đến pH Thêm nước vừa đủ 20 ml Sonication buffer (500 mM NaCl, glycerol %, Tris HCl 30 mM, pH 8) NaCl 0,2925 g Glycerol 0,5 ml Tris HCl 1M 0,3 ml Thêm ml nước cất, lắc cho tan đều, điều chỉnh pH HCl Thêm nước cất vừa đủ 10 ml Sonication buffer (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, pH 8) NaH2PO4 0,069 g NaCl 0,2925 g Thêm ml nước cất, điều chỉnh pH HCl Thêm nước cất vừa đủ 10 ml Sonication buffer (PBS pH 7,4, DTT mM) NaH2PO4 0,069 g NaCl 0,2925 g DTT 100 mM 0,1 ml Thêm nước cất vừa đủ 10 ml Sonication buffer (PBS pH 7,4) NaH2PO4 0,069 g NaCl 0,2925 g Thêm nước cất vừa đủ 10 ml PHỤ LỤC Pha hóa chất tinh chế NaH2PO4 1M Cân 2,84 g Na2HPO4, thêm 20 ml nước cất, lắc cho tan NaH2PO4.H2O 1M Cân 2,76 g NaH2PO4.H2O, thêm 20 ml nước cất, khuấy cho tan NaCl 2M Cân 4,68 g NaCl, thêm 40 ml nước cất, khuấy cho tan Imidazole 1M Cân 0,6808 g imidazole, thêm 10 ml nước cất, khuấy cho tan Equilibration buffer (50 mM PBS, 500 mM NaCl, imidazole 10 mM, pH 7,4) Na2HPO4 M 0,42 ml NaH2PO4.H2O M 0,08 ml NaCl M 2,5 ml Imidazole M 0,1 ml Thêm nước cất vừa đủ 10 ml Wash buffer (50 mM PBS, 500 mM NaCl, 100 mM imidazole, pH 7,4) Na2HPO4 M 0,42 ml NaH2PO4.H2O M 0,08 ml NaCl 2M 2,5 ml Imidazole M ml Thêm nước cất vừa đủ 10 ml Elution buffer (50 mM PBS, 500 mM NaCl, 400 mM imidazole, pH 7,4) Na2HPO4 M 0,42 ml NaH2PO4.H2O M 0,08 ml NaCl M 2,5 ml Imidazole M ml Thêm nước cất vừa đủ 10 ml PHỤ LỤC Sơ đồ vector pET42a(+) pE-SUMO3-Cnazu8 Hình PL1 Sơ đồ vector pET42a(+) Hình PL2 Sơ đồ vector pE-SUMO3-Cnazu8 PHỤ LỤC Kết giải trình tự gen cnazu8 vector pE-SUMO3 - Kết giải trình từ mồi T7 - Kết giải trình từ mồi Cnazu8-BamHI-R PHỤ LỤC Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan Nguyen, TKC, Pham, TT, Huynh, TBM, Tran, TH, Packianather, M, Le, CH & Nguyen, VD 2019, 'Design and development of an novel anticancer peptide from human gut microbiome by using recombinant protein engineering', In: 7th International Conference on the Development of Biomedical Engineering in Vietnam (BME7): Translational Health Science and Technology for Developing Countries IFMBE Proceedings, 69 (69) Springer Verlag, Singapore, pp 837-843 Trần Thị Châu Loan, Huỳnh Thị Bích Mai, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Văn Duy 2016, ‘Tách dòng biểu bacteriocin Cnazu8 tương tự Azurin kháng ung thư từ Clostridium nexile Escherichia coli, Poster Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam lần IV-2016, ngày 31/10/2016 ... MAI NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN VÀ BƯỚC ĐẦU TINH CHẾ BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT NGƯỜI BẰNG CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN KHÁC NHAU Ở E coli. .. biểu hiện và bước đầu tinh chế bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ hệ vi sinh vật đường ruột người bằng hệ thống biểu hiện khác ở E coli? ?? cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công... tài ? ?Nghiên cứu điều kiện biểu bước đầu tinh chế bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ hệ vi sinh vật đường ruột người hệ thống biểu khác E coli? ?? nhằm tìm hệ thống biểu bacteriocin dạng tan tinh