Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Nghiên cứu tích hợp một số gen kháng bạc lá và kháng đạo ôn vào giống lúa BC15 phục vụ công tác chọn tạo giống

Đề tài nghiên cứu nhằm sử dụng kỹ thuật marker phân tử kết hợp với lai hồi giao (backcross) để nhanh chóng đưa các gen kháng bạc lá và kháng đạo ôn vào giống lúa ưu tú BC15 đang trồng phổ biến (mega variety) phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và trực tiếp cho sản xuất.

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Trang

KHÁNG BẠC LÁ VÀ KHÁNG ĐẠO ÔN VÀO GIỐNG LÚA BC15

PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: PGS.TS Khuất Hữu Trung Hướng dẫn 2: PGS.TS Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng

dẫn của các Thầy cô hướng dẫn, kế thừa tiểu Dự án: “Nâng cao năng lực

nghiên cứu, làm chủ công nghệ genom học (Genomics – Assisted

Breeding-GAB) và công nghệ chọn giống ứng dụng chỉ thị phân tử (Marker Assisted

Backcrossing-MABC) để chọn tạo các giống lúa kháng đa yếu tố ứng phó với

biến đổi khí hậu” Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là

trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình

khoa học nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đã

được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ

nguồn gốc Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi luôn nhận được sự giúp nhiệt tình về nhiều mặt của các thầy cô giáo, lãnh đạo của đơn vị công tác, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới PGS.TS Khuất Hữu Trung và PGS.TS Phạm Bích Ngọc, là những người thầy, cô giáo hướng dẫn khoa học luôn tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu để đi đến hoàn thành luận văn này;

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu;

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến lãnh đạo và đồng nghiệp thuộc Viện

Di truyền Nông nghiệp đã luôn giúp đỡ, động viên và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi thực hiện hoàn thành đề tài nghiên cứu luận văn;

Tôi vô cùng biết ơn gia đình, cha mẹ đã sinh thành và chịu nhiều vất vả

để nuôi dưỡng tôi nên người, đã tạo mọi điều kiện và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này Xin trân trọng cảm ơn!

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

Bộ NN-PTNT Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

LRR Lecine rich repeats

MABC Marker assisted backcrossing

MAS Marker assisted selection

NBS Nucleotide binding site

PCR Polymerase chain reaction

SSR Simple Sequence Repeats

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Các giống lúa mang gen kháng bạc lá được chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) và đã thương mại hóa ở Châu Á 16 Bảng 2.1 Danh sách các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu 37

Bảng 3.1 Bảng thống kê số cây BC2F1 mang gen của tổ hợp lai (BC15/Tẻ tép) x BC15-4 52 Bảng 3.2 Danh sách các cá thể BC2F1, gen và đặc điểm nông sinh học 53

Bảng 3.3 Bảng thống kê các cá thể BC2F2 mang gen đồng hợp của tổ hợp lai (BC15/Tẻ tép) x BC15-4 62 Bảng 3.4 Đặc điểm nông sinh học các cá thể BC2F2 mang gen đồng hợp của

tổ hợp lai (BC15/Tẻ tép) x BC15-4 66

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Sản lượng gạo thế giới năm 2017/2018 6

Hình 1.2 Tình hình xuất khẩu gạo của top 5 năm 2017 và dự đoán năm 2018……… 9

Hình 2.1 Sơ đồ lai hồi giao tích hợp cacdidate gen/ gen Pikp, Xa4, Xa7, Xa21

vào giống nền BC15 39

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai (BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Pita sử dụng cặp mồi PitaTaq1……… 47

Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Pikp sử dụng cặp mồi Pikpdel16 47

Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Xa4 sử dụng cặp mồi MP1-MP2 48

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Xa7 sử dụng cặp mồi P3 49

Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Xa21 sử dụng cặp mồi pTA248 50

Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F2 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Pita sử dụng cặp mồi PitaTaq1 55

Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F2 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Pikp sử dụng cặp mồi Pikpdel16 57

Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F2 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Xa7 sử dụng cặp mồi P3 58

Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR các cá thể BC2F2 của tổ hợp lai

(BC15/Tẻ tép) x BC15-4 với gen Xa21 sử dụng cặp mồi pTA248 60

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

a) Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 3

b) Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TẦM QUAN TRỌNG CỦA SẢN XUẤT LÚA GẠO 4

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ LÚA GẠO TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 5

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thự lúa gạo trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lúa gạo Việt Nam 6

1.3 TỔNG QUAN VỀ BỆNH BẠC LÁ Ở LÚA 9

1.3.1 Lịch sử phát hiện bệnh 9

1.3.2 Triệu chứng bệnh bạc lá 9

1.3.3 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa 10

1.3.3.1 Vị trí phân loại 10

1.3.3.2 Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh 11

1.3.3.3 Các chủng sinh lý ở Việt Nam 12

1.3.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá 14

1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới 14

1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ở Việt Nam 17

1.4 TỔNG QUAN VỀ BỆNH ĐẠO ÔN Ở LÚA 18

1.4.1 Lịch sử phát hiện bệnh 18

1.4.2 Triệu trứng bệnh đạo ôn 19

1.4.3 Vi khuẩn gây bệnh đạo ôn 20

1.4.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn 21

1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn trên thế giới 21

1.4.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn ở Việt Nam 23

1.5 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA 24

1.5.1 Ứng dụng phương pháp chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của marker trong chọn tạo giống lúa (Marker Assisted Selection – MAS) 25

1.5.2 Phương pháp MABC (Marker-assisted backcrossing) 32

1.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU QUY TỤ CÁC GEN KHÁNG BẠC LÁ /ĐẠO ÔN VÀO 1 GIỐNG LÚA 33

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 36

2.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 36

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.2.1 Phương pháp lai trở lại kết hợp với chỉ thị phân tử 37

2.2.2.2 Kỹ thuật lai tạo 40

2.2.2.3.Các phương pháp sinh học phân tử 41

2.2.2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN 41

2.2.2.3.2 Phương pháp PCR 42

2.2.2.3.3 Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn Taq1 43

2.2.2.3.4 Phương pháp điện di sản phẩm PCR 43

2.2.2.4 Phương pháp đánh giá các tính trạng nông sinh học chính của các dòng

BC 2 F 2 mang đa gen 44

2.2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 45

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 KẾT QUẢ CHỌN LỌC DÒNG MANG GEN KHÁNG BẠC LÁ/ĐẠO ÔN THẾ HỆ CON LAI BC 2 F 1 ( VỤ MÙA 2018) 46

3.2 KẾT QUẢ CHỌN LỌC DÒNG MANG GEN KHÁNG BẠC LÁ/ĐẠO ÔN THẾ HỆ BC 2 F 2 , VỤ XUÂN 2019 54

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ VÀ CHỌN LỌC CÁC DÒNG BC 2 F 2 MANG ĐA GEN KHÁNG BẠC LÁ VÀ ĐẠO ÔN 62

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

4.1 KẾT LUẬN 68

4.2 KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 78

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Gạo đóng một vai trò quan trọng trong việc cung cấp lương thực cho dân số thế giới, chiếm gần 44% tổng lượng lương thực thực phẩm (http://www.worldriceproduction.com, 2014-2015) [1] Trong 20 năm tới, cứ trung bình 1 tỷ dân sẽ tiêu thụ 65 triệu tấn gạo (tương đương 100 triệu tấn thóc) Năm 2035, tổng sản lượng thóc phải tăng thêm so với bây giờ là 114 triệu tấn Năng suất trung bình có xu hướng đứng lại (hoặc tăng rất chậm) Nhưng có 3 điều đáng lo: đất lúa mất dần, người lao động trồng lúa giảm dần, nước tưới cho lúa thiếu, khiến cho mục tiêu tăng them 114 triệu tấn: trở nên

vô cùng khó khăn Điều đáng lo nữa là chỉ có ít hơn 5% vật liệu di truyền trong ngân hàng gen của IRRI được sử dụng trong các chương trình cải tiến giống lúa (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2014) [2] Việc sản xuất gạo phải được nhân đôi để đáp ứng yêu cầu dân số ngày càng gia tăng Thách thức này đã được khắc phục nhờ sự ra đời và phát triển các giống lúa năng suất cao

có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi sinh học (sâu bệnh hại) và phi sinh học (mặn, hạn, lạnh ) Trong đó, việc nghiên cứu chọn, tạo các giống lúa kháng các bệnh đạo ôn và kháng bệnh bạc lá là rất cần thiết và đã được nghiên cứu từ khá sớm

Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường (2012) [3], dự báo đến năm 2100 mực nước biển sẽ dâng cao 1m và sẽ có khoảng 2,5% diện tích đất nông nghiệp ven biển miền Trung bị ngập lụt, GDP giảm 10%, tác động trực tiếp đến 8,9% dân số và đói nghèo sẽ tăng từ 21,2 - 35,0% Theo Hossain MA và

cs (2012) [4], nước biển dâng là một trong những nguyên nhân chính làm tăng nhanh diện tích đất nhiễm mặn và là một thách thức lớn đối với sản xuất lúa bền vững

Để đảm bảo sự ổn định về năng suất của các giống lúa, các nhà nghiên cứu trước đây đã nỗ lực tạo ra các giống lúa có khả năng kháng bạc lá, nhưng

đa số họ đã không thành công do sự biến đổi đa dạng quần thể bệnh và sự phát triển rộng rãi các chủng, nòi trong các vùng trồng lúa (Sreewongchai và

cs., 2010) [5] Việc chọn tạo các giống lúa có phổ kháng rộng là rất cần thiết

để cải thiện tính kháng bệnh bạc lá và đạo ôn ở lúa Các gen kháng có thể đặc hiệu đối với các tác nhân gây bệnh Các gen kháng bệnh ban đầu được đưa vào nền di truyền duy nhất mà có thể tạo ra tính kháng bền vì nhiều gen kháng được tích hợp vào các kiểu gen đơn (Koide và cs., 2010) [6] Trước đây, các nhà chọn tạo giống thường tạo ra các giống lúa kháng bạc lá và kháng đạo ôn bằng phương pháp nhân giống truyền thống Nhưng nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian do phải tạo ra số lượng lớn cá thể

để xác định hiệu quả và chọn lọc các kiểu gen mong muốn Mặt khác phương pháp nhân giống truyền thống không phân biệt được kiểu gen dị hợp tử, mà điều này là cần thiết trong các chương trình chọn giống Gần đây, kỹ thuật MAS (Marker-assisted selection) và MABC (Marker-assisted backcrossing)

là 2 kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công và được triển khai rộng rãi trong chương trình chọn giống Kỹ thuật MAS và MABC được ứng dụng để chọn lọc các tính trạng chất lượng trong các quần thể phân

ly Đó là các tính trạng quy định bởi đơn gen mà có thể có bản đồ vật lý gần với marker

Hiện nay, phương pháp MAS được sử dụng rộng rãi để hỗ trợ giúp quy

tụ các gen đích vào các giống lúa ưu tú đã được chứng minh bằng cách lai hồi giao tạo ra giống cây trồng có sức kháng bệnh bền hơn (Win và cs 2012 [7], Win và cs 2013 [8], Singh và cs 2013 [9], Fatah A Tanweer và cs 2015 [10], Abhilash Kumar V và cs 2017 [11], Xiao và cs 2017 [12], Jairin và cs 2017 [13])

Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi nghiên cứu đề tài “Nghiên

cứu tích hợp một số gen kháng bạc lá và kháng đạo ôn vào giống lúa BC15 phục vụ công tác chọn tạo giống” nhằm sử dụng kỹ thuật marker phân tử kết

hợp với lai hồi giao (backcross) để nhanh chóng đưa các gen kháng bạc lá và kháng đạo ôn vào giống lúa ưu tú BC15 đang trồng phổ biến (mega variety) phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và trực tiếp cho sản xuất

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tích hợp gen kháng bạc lá và kháng đạo ôn vào giống lúa BC15 đang phổ biến trong sản xuất tạo được vật liệu mang 2-3 gen kháng phục vụ công tác chọn tạo giống lúa

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

a) Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Giống lúa BC15 đang phổ biến trong sản xuất, thích ứng rộng với các vùng sinh thái khác nhau có năng suất cao, chất lượng tốt ( giống nền nhận gen)

và các giống lúa mang gen kháng bạc lá và kháng đạo ôn (nguồn cho gen)

b) Phạm vi nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Thí nghiệm đồng ruộng: Tại xã Đại Đồng, Thạch Thất, Hà Nội;

+ Thí nghiệm về sinh học phân tử: Thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp

- Thời gian thực hiện: Từ tháng 08/2018 - 08/2019

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TẦM QUAN TRỌNG CỦA SẢN XUẤT LÚA GẠO

An ninh lương thực, khủng hoảng năng lượng, biến đổi khí hậu toàn cầu, ô nhiễm môi trường là ba vấn đề lớn của nhân loại Việt Nam với trên 75% dân số phụ thuộc chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp và 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo làm lương thực chính Năm 2018, thời tiết khá thuận lợi cho phát triển trồng trọt Trong năm, nông dân gieo trồng 185.037ha lúa, sản lượng thu hoạch 1.110.551 tấn, đạt 101,4% kế hoạch, tăng 4,07% so với cùng

kỳ năm 2017[14]

Lúa là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba trên thế giới sau ngô và lúa mì tuy nhiên gạo lại là lương thực chính cho khoản 3,7 tỷ người trên hành tinh vào thời điểm hiện tại Hiện nay trên thế giới có 114 nước trồng lúa và phân bố ở tất cả các châu lục trên thế giới Việc sản xuất lúa gạo vẫn tập trung chủ yếu ở các nước châu Á, nơi chiếm hơn 90% về diện tích gieo trồng cũng như về sản lượng Hiện nay lúa rất đa dạng về chủng loại cũng như hình thái, chất lượng để phù hợp với từng khu vực, địa phương

Ngoài tầm quan trọng của gạo như một loại lương thực chủ yếu thì việc sản xuất lúa gạo còn gắn liền với những nền văn minh lúa nước lâu đời ở nhiều khu vực khác nhau trên thế giới, đứng đầu là các quốc gia châu Á như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc

Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sản xuất lúa gạo trên thế giới ngày càng được nâng cao.Tuy nhiên sản lượng lúa gạo tạo ra vẫn chưa đủ cung cấp cho nhu cầu ngày càng tăng của con người, đặc biệt là sự gia tăng dân số và thương mại hóa toàn cầu Vì vậy việc sản xuất lúa gạo để đảm bảo

an ninh lương thực là vấn đề cấp thiết đặt ra cho mọi quốc gia, tổ chức quan tâm giải quyết.Trong tình trạng tác động của biến đổi khí hậu ngày một tăng như các hiện tượng thời tiết cực đoan (bão, lũ, hạn hán)

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ LÚA GẠO TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thự lúa gạo trên thế giới

Diện tích trồng lúa ở châu Á dẫn đầu về thế giới, nhưng năng suất lúa không cao, đạt trên 5 tấn/ha chỉ có ở Việt Nam và Trung Quốc Từ năm 1990 đến nay, năng suất lúa thế giới vẫn liên tục tăng và trung bình đạt 4,38 tấn/ha năm 2010 Mặc dù năng suất lúa ở các nước Châu Á còn thấp, nhưng do có diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là khu vực đóng góp lúa gạo chủ yếu

và quan trọng trên thế giới (trên 90%)

Theo Hiệp hội lượng thực Việt Nam (2014) [15], gạo thơm, hạt dài luôn có giá cao hơn gạo trắng hạt dài từ 2-3 lần và gạo thơm Jasmine của Việt Nam cũng chỉ có giá trị tương đương với mức giá cao nhất của chủng loại gạo

trắng, hạt dài chất lượng cao của thế giới Các giống lúa thơm của Thái Lan,

Ấn Độ và Pakistan là giống lúa Khao Dawk Mali 105 và Basmati Riêng xuất khẩu gạo của hai nước Thái Lan và Việt Nam sẽ chiếm khoảng nửa tổng lượng gạo xuất khẩu của thế giới Theo FAO (2012) [16], dự báo thị phần xuất khẩu gạo của Hoa Kỳ trên thị trường thế giới sẽ giảm từ 12% năm 2007 xuống chỉ còn khoảng 10% vào năm 2017 Trong các nước xuất khẩu gạo với khối lượng nhỏ hơn như Úc, Achentina, các nước Nam Mỹ khác (Uruguay, Guyana, Surinam) dự kiến sẽ tăng xuất khẩu trong giai đoạn tới Úc dự kiến

sẽ tăng xuất khẩu từ 150 nghìn tấn năm 2007/08 lên 220 nghìn tấn vào năm 2008/09 Xuất khẩu gạo Achentina dự kiến sẽ tăng 3-4% năm trong giai đoạn 2007/08 đến 2016/17, do sản lượng gạo tăng dự kiến vượt nhu cầu gạo nội địa Xuất khẩu gạo của các nước Nam Mỹ (chủ yếu từ Uruguay) dự báo tăng 2-3% mỗi năm, do tăng trưởng sản lượng thấp hơn mức tăng tiêu dùng

Rejesus, I và Soest, H (2012) [17], đã sử dụng mô hình AutoRegressive Model (AR) để nghiên cứu và dự báo nhu cầu tiêu thụ gạo trên toàn cầu Theo Đào Thế Anh (2012) [18], việc đánh giá diễn biến, xu hướng sản xuất tiêu thụ gạo của các nước sẽ giúp Việt Nam hiểu và có được định hướng chung cho các sản phẩm lúa gạo của mình

Hình 1.1 Sản lượng gạo thế giới năm 2017/2018

1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lúa gạo Việt Nam

So sánh diện tích canh tác và sản lượng giữa lúa và các cây lương thực khác ở Việt Nam thì lúa gạo vẫn là cây lương thực chủ lực được ưu tiên hàng đầu với diện tích nhiều nhất hơn hẳn ngô và sắn, sản lượng cao hơn khoai lang và sắn Việt Nam vượt trội trong khu vực Đông Nam Á nhờ hệ thống thủy lợi được đầu tư cải thiện đáng kể cũng như việc ứng dụng nhanh các tiến

bộ kỹ thuật mới về giống, phân bón và bảo vệ thực vật

Theo đánh giá của Bộ Nông nghiệp và PTNT (2011) [19], việc sản xuất lúa của các địa phương đã tập trung và có bước đột phá mạnh mẽ trong khâu

tổ chức sản xuất, nhất là chú trọng việc xây dựng cánh đồng mẫu lớn Lợi nhụân bình quân chung của bà con nông dân vẫn đạt được 30% Năm 2012, diện tích sản xuất lúa của cả nước đạt khoảng 7,76 triệu ha, tăng 117.000 ha

so với năm 2011 Tổng sản lượng ước đạt khoảng 43,96 triệu tấn, tăng 1,64 triệu tấn so với năm 2011 Đặc biệt, xuất khẩu gạo đạt sản lượng cao nhất từ trước đến nay với hơn 7,7 triệu tấn gạo, tăng hơn 630.000 tấn so với năm

2011 Theo Bộ Nông nghiệp và PTNT (2011) [19], giai đoạn 1989 - 1995, Việt Nam xuất khẩu bình quân hàng năm trên 3 triệu tấn gạo sang 128 quốc gia, đạt mức đỉnh 5.2 triệu tấn vào năm 2005 và năm 2006- nay đã có một kỷ lục mới trên 7.0 triệu tấn gạo xuất khẩu Năm 1989, kinh ngạch xuất khẩu trên

300 triệu USD, sau 10 năm phá mốc 1 tỉ USD và đạt mức kỷ lục 2.9 tỉ USD vào năm 2008, và đến 2012 đã đạt 3,8 tỉ (chưa tính gạo xuất tiểu ngạch khoảng gần 1 triệu tấn) Ngành hàng lúa gạo không chỉ tạo an ninh lương thực vững chắc để Việt Nam yên tâm đẩy mạnh công nghiệp hoá mà còn trực tiếp đóng góp vào tiến trình này thông qua tạo ra một lượng ngoại tệ thặng dư cho đất nước nhập khẩu máy móc, trang thiết bị hiện đại hoá cho nhiều ngành công nghiệp Năm 2011, Việt Nam thắng lợi trong xuất khẩu gạo, đạt kỷ lục hơn 7 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu hơn 3,7 tỷ USD Số lượng xuất khẩu tăng, nhưng giá trị lại thấp hơn so với các đối thủ cạnh tranh Làm sao để nâng cao chất lượng và giá trị gạo xuất khẩu? là câu hỏi và là thách thức trong những mùa vụ mới

Theo Hiệp hội lương thực Việt Nam (2014) [15], những năm tới đây Việt Nam vẫn giữ được vị trí thứ 2 thế giới về xuất khẩu gạo, thế nhưng cũng như hơn 20 năm qua Việt Nam xuất khẩu gạo xếp vào hạng nhất nhì thế giới với hàng trăm giống lúa nhưng vẫn chưa tạo dựng được một loại gạo chất lượng cao có thương hiệu tầm cỡ quốc gia Từ đầu năm đến nay, trong khi thị trường gạo trầm lắng, thì ngược lại, chỉ với hai loại gạo chất lượng cao mang thương hiệu đặc trưng của mình, Thái Lan, Ấn Độ vẫn xuất khẩu khá mạnh với giá lên đến 700 - 1.000 USD/tấn, cao hơn gấp đôi so với loại gạo trắng hạt dài vốn chiếm 80 - 90% sản lượng của Việt Nam Theo Hiệp hội lương thực Việt Nam (2014) [15], hiện nay cơ hội cho xuất khẩu gạo của Việt Nam vào thị trường Trung Quốc, Hongkong là rất lớn: xuất khẩu gạo, đặc biệt là gạo thơm của Việt Nam vào thị trường Hồng Kông trong 2 năm 2011-2012 đã có một cuộc bứt phá ngoạn mục Số liệu của Hiệp hội nhập khẩu gạo Hồng Kông cho biêt: từ chỗ chỉ chiếm khoảng 1% lượng nhập khẩu vào Hồng Kông trong năm 2008, đến hết năm 2011, Việt Nam đã chiếm một thị phần tương đương 30%, khoảng 100.000 tấn gạo Nhập khẩu gạo Việt Nam vào thị trường này chủ yếu dành cho tiêu 28 thụ nội địa Người tiêu dùng Hồng Kông ưa chuộng gạo thơm, và gạo thơm Thái đã chiếm lĩnh thị trường trong suốt một thời gian dài Tuy nhiên tình hình đã thay đổi trong 3 năm trở lại So với gạo Thái thì chất lượng của gạo Việt Nam còn thấp hơn gạo thơm Thái nhưng vấn đề quan

trọng là giá cả thì giá gạo Việt Nam đang ngày càng trở nên hấp dẫn so với gạo Thái Ưu thế này đang ngày càng trở nên đáng kể trong bối cảnh chính phủ Thái tuyên bố duy trì chính sách trợ giá lúa, khiến giá gạo không có khả năng giảm giá

Theo Hiệp hội lương thực Việt Nam (2014) [15], với thị trường Trung Quốc trong 3 năm gần đây gạo Việt Nam đã chiếm thị phần đáng kể và phát triển ổn định: thị trường xuất khẩu gạo thời gian qua có nhiều thay đổi, trong

đó thị trường Trung Quốc tăng gấp 5,2 lần về lượng và 4,4 lần về giá trị so với cùng kỳ năm trước và trở thành thị trường nhập khẩu gạo lớn nhất của Việt Nam Theo các chuyên gia nông nghiệp, sắp tới, gạo Việt sẽ phải chịu rất nhiều sức ép về giá, sản lượng và chất lượng Nhiều nước xuất khẩu gạo đã xây dựng được thương hiệu gạo quốc gia, bảo đảm chất lượng nên gặt hái lợi nhuận khá cao Từ thực tế trên, chiến lược phát triển của ngành hàng lúa gạo

là không nên tiếp tục đi theo hướng tăng khối lượng gạo xuất khẩu Những năm tới, cần tập trung vào tăng chất lượng để nâng cao giá bán, đồng thời cơ cấu lại chuỗi tiêu thụ lúa gạo để tăng lợi nhuận cho nông dân Có như vậy, sản xuất và tiêu thụ lúa gạo Việt nam mới bền vững và ổn định lâu dài

Về xuất khẩu, theo số liệu thống kê của Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) ước tính Việt Nam xuất khẩu được 6,6 triệu tấn trong năm 2017 [20] Con số này dự báo sẽ cải thiện hơn nữa khi bước sang năm 2018 nhờ nhu cầu mua hàng từ các nước châu Á tăng mạnh, đặc biệt là từ các thị trường truyền thống như Philippines và Indonesia USDA dự đoán, xuất khẩu gạo năm 2018 của Việt Nam đạt 7,2 triệu tấn

Hình 1.2 Tình hình xuất khẩu gạo của top 5 năm 2017 và dự đoán năm 2018 1.3 TỔNG QUAN VỀ BỆNH BẠC LÁ Ở LÚA

1.3.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm

1884 Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là

do acid đất Nhưng không lâu sau đó, người ta đã công nhận nguyên nhân của

nó là do vi khuẩn gây nên và theo Ishiyama, 1922 thuộc loại Bacillus oryzae

Vi khuẩn này sau đó được Tagami, Mizukami, 1962 và Mizukami,

Wakimoto, 1969 đặt tên là Pseudomonas oryzae, cuối cùng Ezuka, 1974 đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên

Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ (1990), Philippin (1918), Indonexia (1950), Trung Quốc (1957) có xu hướng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân (David O.N et al., 2006) [21] Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới

1.3.2 Triệu chứng bệnh bạc lá

Vi khuẩn Xoo gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc

lá, vàng nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek) Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà

lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh Các giống lúa khác nhau có thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá Triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra

Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng dễ nhầm lẫn với các triệu chứng khác Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc,lá dễ bị khô

Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặcđiểm điển hình sau đây:

- Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá

- Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái vàng lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám

- Thông thường ranh giới giữa mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt, có giới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng

Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh Tuy nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều hiệnbên ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lásinh lý (Bùi Trọng Thủy và cs., 2007) [22]

1.3.3 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

1.3.3.1 Vị trí phân loại

Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa được nhiều nhà nghiên cứu, phân lập nên

nó được gọi với nhiều tên khác nhau Trước đây vi khuẩn bạc lá lúa có tên là

Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama, hoặc Phytomonas oryzae Magrou

Đến năm 1982 vi khuẩn được đặt tên là Xanthomonas campestris pv.oryzae

(Uyeda et Ishiyama) Dowson Về sau Dowson đổi tên lại là Xanthomonas

oryzae pv Oryzae (Ishiyama) Dowson

Dựa theo hệ thống phân loại của Bergey (1939) và Gorlenco (1966) thì

loài Xanthomonas oryzae thuộc chi Xanthomonas, họ Pseudomonadaceae,

bộ Eubacteriales, lớp Schizomycetes (Eubacteria)

Tuy nhiên hệ thống phân loại này còn có nhiều tiêu chí chưa được nghiên cứu đầy đủ nên hệ thống chưa có được sự thống nhất toàn diện Trong những năm gần đây, phân loại vi khuẩn hiện đại dựa trên các nghiên cứu và phân tích trực tiếp cấu trúc ADN Các cá thể, các isolate khác nhau nhưng cùng một loài sẽ có cấu trúc di truyền tương tự nhau Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượng các nucleotit G+C đặc trưng cho mỗi loài và được sử dụng làm 1 trong những chỉ tiêu phân loại Theo đó, các kế quả nghiên cứu cũng

cho thấy hàm lượng G+C của những loài trong chi Erwinia là 50-54%;

Corynebacterium: 54-55%; Pseudomonas: 58-63%; còn ở Xanthomonas là

63-69% (Vũ Triệu Mân, 2007) [23]

1.3.3.2 Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh

Trong hệ thống phân loại, Xanthomonas bao gồm 3 loài là X Oryzae

pv oryzae, X Axonopodis pv citri, và X Campestris pv campestris Hệ gen của Xanthomonas oryzae pv oryzae (gọi tắt là Xoo) có chiều dài xấp xỉ 5

triệu bp (4.940.217 bp), trong đó thành phần G+C chiếm 63.72% và vùng mã hoá protein chiếm tới 84.12% (Ochiai và cs, 2005) [24] Về đặc tính gây bệnh của vi khuẩn, các nghiên cứu chỉ ra rằng có liên quan đến 3 nhóm gen là:

nhóm hrp, avr và hrpX

- Nhóm gen hrp mã hoá cho hệ thống các enzyme tiết, có chức năng chuyển các protein thụ thể vào tế bào cây chủ Ở Xanthomonas oryzae pv

oryzae, nhóm này bao gồm 27 gen khác nhau

- Nhóm gen avr đóng vai trò quyết định sự đặc hiệu ký sinh - ký chủ

Chúng mã hoá ra các yếu tố tạo nên độc lực của vi khuẩn, giúp vi khuẩn ký

sinh, gây bệnh Xanthomonas oryzae pv oryzae bao gồm 17 bản copy các

thành viên của họ gen avrBs3/pth, một kiểu gen chính avr được định vị trên 7

vùng khác nhau của hệ gen

- Nhóm gen HrpX: Ở cả 3 loài thì sự biểu hiện của nhóm gen hrp và avr đều phụ thuộc vào sản phẩm của gen hrpG và hrpX Một vài gen HrpX có sự

đồng nhất về trình tự (TTCGC-N15-TTCGC), người ta đặt tên cho nó là đoạn

PIP box Vì vậy PIP box là đặc điểm để phân loại các gen HrpX Ở loài Xoo,

các nghiên cứu đã tìm thấy có 37 bản copy hoàn chỉnh hoặc gần hoàn chỉnh của đoạn PIP box trong vùng khởi đầu phiên mã của các gen, 5 trong số các

gen đó nằm trong vùng của nhóm gen hrp, còn lại thì nằm rải rác khắp bộ genome của vi khuẩn Họ gen avrBs2 có ở cả 3 loài, họ gen avrBs1 chỉ tìm thấy ở X.campestis pv campestris, còn họ gen avrBs3/pth xuất hiện phổ biến

ở loài X Oryzae pv Oryzae (NIAS, 2010) [25] Ở loài X Axonopodis pv citri thì những gen avr đều nằm trên plasmid Còn ở loài X Oryzae pv oryzae có 1 gen là thuộc họ gen avrBs2 còn lại đa số thuộc họ gen avrBs3 và nằm trong cấu trúc genome của vi khuẩn Ví dụ như Avrxa5 thuộc nhóm AvrBs3,

AvrXa7 cũng là một thành viên của họ gen avrBs3 AvrXa7 có đặc trưng là

chứa trình tự lặp ở vùng trung tâm Đoạn sợi kép của AvrXa7 rất giàu trình tự

T Nếu xảy ra đột biến ở vùng kết thúc có chứa trình tự CCC thì AvrXa7 sẽ trở thành avrXa7 (tức là gen gây độc) AvrXa21 muốn hoạt động được đòi hỏi sự

có mặt của các gen raxA, raxB, raxC, những gen mã hoá cho các thành phần của hệ thống bài tiết Trong khi đó với loài Xanthomonas campestris pv

campestris thì AvrXa21chỉ hoạt động khi có gen raxAvà raxST, mã hoá ra

enzyme sulfotransferase Sự biểu hiện của các gen rax lại phụ thuộc vào mật

độ chủng cũng như các gen rax chức năng khác

1.3.3.3 Các chủng sinh lý ở Việt Nam

Vi khuẩn bạc lá rất phong phú và đa dạng về thành phần nòi Các nghiên cứu để phân chia các nòi thành các chủng sinh lý đều dựa trên độc tính gây bệnh của chúng trên các giống lúa khác nhau Tuy nhiên, mỗi quốc gia lại gieo trồng các giống khác nhau vì thế để phân nhóm và so sánh các chủng sinh lý giữa các quốc gia, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) và Nhật Bản xây dựng nên hệ thống các dòng lúa phục vụ cho mục

đích này Hệ thống này bao gồm các dòng cận đẳng gen (NIL) được tạo ra dựa vào việc lai chuyển các gen kháng bạc lá vào nền gen của 3 giống IR24, Toyonishiki và Milyang 23 (NIAS, 2010) [25] Các dòng NIL này còn được gọi là differential và được dùng để phân nhóm các chủng vi khuẩn bạc lá Ngoài ra, các dòng NIL còn là nguồn cho gen kháng

Ở Nhật Bản, nghiên cứu nòi vi khuẩn bạc lá được tiến hành từ năm

1957, khi phát hiện thấy giống Aisacase chống bệnh trở nên nhiễm bệnh Họ

đã xác định được ở Nhật Bản có 5 nhóm nòi vi khuẩn Phillipines đã xác định được 6 nhóm nòi và ở Indonesia có 9 nhóm nòi

Ở Việt Nam, những nghiên cứu bước đầu về thành phần nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá đã được Tạ Minh Sơn (1987) nghiên cứu và cho thấy: Vi khuẩn bạc lá có 4 nhóm nòi phổ biến nhất Nhóm I tập trung ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ Nhóm II tập trung ở các tỉnh đồng bằng Nam Bộ Nhóm III và nhóm

IV phân bố rải rác trong cả nước So với thành phần nòi ở Nhật Bản thì nòi tìm thấy ở Việt Nam khác hẳn Một số nhóm nòi ở Philippines và Indonesia đều tìm thấy ở Việt Nam Nhóm II ở Việt Nam tương tự như nhóm IV của Philippin, nhóm IV ở Việt Nam tương tự nhóm I ở Philippines hay nhóm B ở Indonesia Như vậy, thành phần nhóm nòi ở Việt Nam thể hiện đa dạng và phức tạp hơn ở các nước (Tạ Minh Sơn, 1987) Gần đây, trong nghiên cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc Phan Hữu Tôn (2004), đã nhận thấy các nhóm

chủng Xoo thường xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện

nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương Trên một vết bệnh đôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định (Phan Hữu Tôn, 2004) [26]

Khi nghiên cứu về thành phần nhóm nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở vùng đồng Bằng Sông Hồng tác giả Lưu Văn Quyết (1999) đã xác định có 7 nhóm nòi dựa trên phản ứng của các isolate được thu thập với bộ giống chuẩn nòi quốc tế bao gồm nhóm I đến nhóm VII Trong 7 nhóm nòi trên, nhóm I gây nhiễm với các giống DV85, Zenith, BJ1, Nigeria và IR20 Nhóm II gây nhiễm với các giống Kuntlan, IR1545, Chugoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm III gây nhiễm trên các giống IR1545,

Chugoku, Kogyoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm IV gây nhiễm trên các giống Kogyoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm V gây nhiễm trên các giống IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm VI nhiễm trên giống Chugoku, IR24, Milyang46 và Kinmaze Dựa trên cơ sở phản ứng của các isolate được thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau đối với các

dòng đẳng gen có nền chung là IR24 có chứa gen kháng là Xa1 Phan Hữu

Tôn và Bùi Trọng Thủy (2003) cũng đã phân lập 64 isolate thành 10 chủng khác nhau: kiểu 1, kiểu 2A, 3B,3A, 3B,4, 5A, 5B, 6,7,8, 10 Các tác giả cũng phân tích và cho biết kiểu 2 (A’, A và B) phổ biến hầu hết các vùng trồng lúa với 73,8%, các chủng còn lại tùy vùng sinh thái mà tồn tại hoặc không Theo

kết quả nghiên cứu của Bùi Trọng Thuỷ (2004) các gen đơn trội Xa7, Xa21 và gen lặn xa5 có phản ứng kháng (R), kháng vừa (M) với tất cả 10 chủng vi khuẩn X oryzae gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam Đây là ba gen Xa -

gen kháng rất có ý nghĩa trong việc sử dụng lai tạo, chọn lọc các giống lúa

chống bệnh bạc lá Gen Xa4 kháng được các chủng Y3,Y4, Y5 và Y7 Gen

Xa3 có phản ứng kháng(R) chủng Y1 Gen Xa10 kháng được chủng Y2 và

kháng vừa (M) chủng Y3 Năm 2005 tác giả Bùi Trọng Thủy đã xác định

được 12 nhóm nòi vi khuẩn X.oryzae có mặt ở miền Bắc Việt Nam đồng thời

xây dựng được bảng chuẩn thể hiện phổ phản ứng kháng, nhiễm của 12 dòng đẳng gen với 12 nòi đó Đến năm 2008, Nguyễn Văn Viết và cs đã xác định được 13 nhóm chủng sinh lý của vi khuẩn gây bạc lá hiện diện ở các vùng trồng lúa miền Bắc Việt Nam (Nguyễn Văn Viết và cs., 2008) [27] Điều đó chứng tỏ thành phần các chủng nòi sinh thái ở miền Bắc Việt Nam rất đa dạng

và phong phú

1.3.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá

1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới

Có rất nhiều phương pháp được áp dụng để tạo giống lúa kháng bạc lá như: Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp chọn lọc truyền thống

và chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các dòng đẳng gen (Near Isogenic Line) có mang gen kháng sau đó lai quy tụ

(pyramiding) nhiều gen kháng hoặc nhiều QTL từ nhiều nguồn bố mẹ vào trong một giống Cho đến nay, với những thành tựu đạt được trong việc phát hiện các gen kháng về cả định lượng và định tính đã đặt nền tảng cho những

nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh (Pei và cs., 2011) Đối với bệnh bạc lá,

cho đến nay đã phát hiện có trên 36 gen kháng chính với các chủng vi khuẩn gây bệnh tại các vùng trồng lúa trên thế giới Trong đó, 28 gen đã được định

vị trên các nhiễm sắc thể và có chỉ thị liên kết đã được đưa ra (X Chun, H Chen, X Zhu, 2012) [28]

Đối với bệnh bạc lá, các gen Xa4, Xa5, Xa7 và Xa21 được các chuyên

gia lưu tâm nhất vì các gen này khi tổ hợp cùng với nhau có phổ kháng rộng Tại Ấn Độ, việc quy tụ nhiều gen kháng vào cùng một tổ hợp gen đã được thực hiện và tạo ra được các dòng mang nhiều gen kháng làm nguôn vật liệu tốt để chuyển tổ hợp gen này vào các giống lúa thương mại tăng tính kháng

bạc lá của các giống, dòng NH56 mang 4 gen (Xa4, Xa5, Xa7 và Xa21) (Sanchez và cs., 2000) Trong chương trình lúa lai tại Trung Quốc, việc quy

tụ các gen kháng bệnh vào các dòng phục hồi để tăng tính kháng của lúa lai

cũng được quan tâm đặc biệt các gen Xa7, Xa21 đã được quy tụ vào giống lúa

Minhhue 63 (Yan-chang và cs., 2004) [29]

Trong các chương trình chọn giống sử dụng phương pháp lai trở lại, MAS giúp đẩy nhanh việc tập hợp các gen mong muốn Chen và cs ( 2001) [30] đã áp dụng MAS để cải thiện được tính kháng bệnh bạc lá của hai dòng

phục hồi ưu việt là “6078” và “Minghui 63” nhờ quy tụ gen kháng Xa21 từ

“IRBB21” vào 2 dòng phục hồi này Các con lai có bố mẹ là các dòng phục hồi đã được cải tiến này có năng suất cải thiện đáng kể trong điều kiện dịch bệnh

Các gen Xa5, Xa13 và Xa21 kháng mạnh với các chủng nấm bệnh bạc lá

ở Ấn Độ đã được lai quy tụ vào giống lúa Indica (PR106) nhờ sự hỗ trợ của

MAS (Singh và cs., 2001) [31] Năm 2002, Indonesia đã thương mại hóa hai

giống lúa Angke và Conde, là hai giống lúa có mang tổ hợp gen Xa4+Xa5 và

Xa4+Xa7 (Bustamam và cs., 2002) [32]

Các nhà chọn tạo giống Philippin cũng đã thành công khi tích hợp tổ hợp

gen Xa4+Xa5+Xa21 (có nguồn gốc từ giống NSIC Rc142 và NSIC Rc154)

vào giống IR64 nhờ sự hỗ trợ của MAS (Toenniessen và cs., 2003) [33] Ở Trung Quốc, dòng lúa bất dục đực nhạy cảm với ánh sáng - 3418s (Luo và cs., 2003) [34], dòng duy trì R8006 và R1176 (Cao và cs., 2003) [35] và dòng

Kang 4183 (Luo và cs., 2005) [36] mang gen Xa21, có khả năng kháng bạc lá cao đã được phát triển Các gen Xa13 và Xa21 đã được tích hợp vào giống

Pusa Basmati 1 nhờ sự hỗ trợ của MAS (Joseph và cs., 2004) [37] Cũng với

giống lúa Pusa Basmati 1, ba gen Xa5, Xa13 và Xa21 đã được tích hợp vào

giống này và tạo ra giống Pusa Basmati 1 cải tiến Đây là giống lúa đầu tiên được chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của MAS đã được thương mại ở Ấn Độ vào năm

2007 (Gopalakrishnan và cs., 2008) [38] Song song với những nỗ lực này, các nhà chọn tạo giống của Cục Nghiên cứu lúa gạo (DRR)cũng đã tích hợp 3

ba gen kháng bạc lá này (Xa5, Xa13 và Xa21) vào giống lúa ưu tú

SambaMahsuri nhờ sự hỗ trợ chỉ thị phân tử (Sundaram và cs., 2008) [39] Pandey và cs (2013) [40] đã cải tiến hai giống Basmati mẫn cảm với bệnh bạc

lá (Taraori Basmati và Basmati 386) nhờ tích hợp hai gen Xa13 và Xa21 sử

dụng kỹ thuật lai trở lạivới sự hỗ trợ của marker (MABC) kết hợp với lựa chọn kiểu hình

Bảng 1.1 Các giống lúa mang gen kháng bạc lá được chọn tạo nhờ sự

hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) và đã thương mại hóa ở Châu Á

Giống

thương mại

Giống gốc

Tổ hợp

Năm thương mại

Cơ quan nghiên

cứu

Angke IR64 Xa4/Xa5 Indonesia 2002 Trung tâm Nghiên

cứu lúa Indonesia và Trung tâm Công nghệ Sinh học Nông nghiệp và Phát triển nguồn gen Indonesia (ICRR/ICABIOGRAD)

Conde IR64 Xa4/Xa7 Indonesia 2002

2004 Viện nghiên cứu lúa

Quốc gia Trung Quốc (CNRRI) Guodao 1 Zhong8

Xa21,Xa5 , Xa13

Ấn Độ 2007 Ủy ban Chuyển giao

Giống Trung ương

1

Xa21, Xa5, Xa13

Ấn Độ 2007

Với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử, nhiều giống lúa cải tiến mang nhiều gen kháng bệnh nói chung và bạc lá nói riêng đã và đang được chọn tạo Tính đến này, khu vực Châu Á đã có hơn 10 giống lúa kháng bệnh bạc lá đã được phát triển và thương mại hóa Các giống này đều được chọn tạo nhờ sử hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) (Valérie và cs., 2011) [41]

1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ở Việt Nam

Trước đây ở Việt Nam, các nhà chọn tạo giống thường sử dụng phương pháp nhân giống truyền thống để tạo ra các giống lúa kháng bạc lá Tuy nhiên phương pháp này thường tốn thời gian và không phân biệt được kiểu gen dị hợp tử Gần đây, với sự phát triển nhanh chóng cũng như là đặc điểm ưu việt của các chỉ thị phân tử, các nhà nghiên cứu của Việt Nam đã bước đầu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống

Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Thị Lang (2004) đã sử dụng các chỉ thị STS (RG556, RG136, pTA248), SSR (RM21, RM114, RM122, RM164,

RM190) để phát hiện các gen Xa21, xa5, xa13 trên các giống lúa địa phương

và bố mẹ lai Lã Vinh Hoa đã sử dụng các chỉ thị Npb 181, P3 và RG 556 để

phát hiện ra các gen Xa4, Xa7, xa5 trong số 150 mẫu giống thu được từ các địa phương ở miền Bắc Việt Nam (Lã Vinh Hoa và cs., 2010) [42]

R308BB có 90% số cá thể của mang gen kháng Xa21 đồng hợp tử, 10% số cá

thể mang gen dị hợp tử; dòng bố D42BB có 10% số cá thể mang gen kháng dị

hợp tử, dòng bố 9311BB có 100% số cá thể mang gen Xa7 và tất cả các cá thể này đều đồng hợp tử về gen Xa7 (Vũ Hồng Quảng và cs., 2011) [43]

Trong công tác chọn tạo giống, chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở Miền Bắc của Học viện Nông Nghiệp Việt Nam dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụngcông nghệ sinh học để phân lập, nuôi cấy

và phân biệt gen kháng bệnh bằng PCR đã xác định 16 chủng vi khuẩn

Xanthomonas oryzea gây bệnh khác nhau Các dòng chỉ thị IRBB5 (xa5),

IRBB7 (Xa7), IRBB21 (Xa21) có tính kháng đa số các chủng vi khuẩn gây

bệnh

Tại Viện Di truyền Nông Nghiệp, tác giả Vũ Đức Quang và nhóm tác giả đã thu thập được một số giống nhận gen trong các tổ hợp lai, dòng NILs

mang đơn gen kháng Xa21; Xa4; xa5; Xa7, chọn được 15 nòi vi khuẩn có độc

tính cao và đánh giá được một số đặc tính nông học của các mẫu giống

1.4 TỔNG QUAN VỀ BỆNH ĐẠO ÔN Ở LÚA

1.4.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Bệnh đạo ôn chính thức được phát hiện ở Ý vào năm 1560, sau đó bệnh được quan sát thấy ở các nước châu Á như Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản

năm 1760, Ấn Độ năm 1913, các nước Trung Á, Tây Á, Bắc Mỹ, Nam Mỹ, quần đảo Antin và ở châu Âu: Yas, Bungari, Rumani, Bồ Đào Nha, Liên Xô,

1.4.2 Triệu trứng bệnh đạo ôn

Bệnh đạo ôn có thể gây hại trên tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa Theo Peresipkin V.Ph (1974), triệu chứng bệnh được chai làm ba dạng là đạo ôn lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông Bomam J.M, Vergel de Dios, T.I, Khin M.M (1986) và Torres C.Q (1986), căn cứ vào tính chất và vịt rí bộ phận bị nhiễm chia bệnh làm 4 dạng là đạo ôn lá, đạo ôn cổ

lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông

 Bệnh trên mạ

Vết bệnh trên lá mạ lúc đầu hình bầu dục nhỏ sau tạo thành hình thoi nhỏ hoặc dạng tương tự hình thoi, màu nâu hoặc nâu vàng Khi bệnh nặng, từng đám vết bệnh kế tiếp nhau làm cây mạ có thể héo khô hoặc chết

+ Trên các giống kháng, vết bệnh là những chấm nhỏ hình dạng không đặc trưng Tùy thuộc vào mức độ kháng của giống lúa mà vết bệnh có kích thước khác nhau: trên giống kháng mạnh, vết bệnh là những đốm nâu nhỏ có kích thước từ bằng đầu kim đến 1 – 2 mm; ở các giống kháng vừa, vết bệnh

có hình tròn hay trứng, tâm sáng trắng, viền nâu, kích thước 2-3 m m Nhiễm nặng và sớm lúa có thể bị lùn, nhiều vết bệnh trên lá ở các giống kháng vừa, vết bệnh có hình tròn hay trứng, tâm sáng trắng, viền nâu, kích thước 2-3 m

m Nhiễm nặng và sớm lúa có thể bị lùn, nhiều vết bệnh trên lá liên kết với nhau làm cháy lá

- Đạo ôn cổ lá: Vết bệnh hình khum theo chiều cong giữa cổ lá và phiến

lá Từ cổ lá bệnh lan ra bẹ lá và phiến lá làm lá lúa khô lụi và gãy gục

- Đạo ôn đốt thân: Lúc đầu là một đốm nhỏ màu nâu sau lớn rộng ra thành một vành tròn bao quanh đốt thân làm cho thân lõm tóp lại, màu đen Khi trời mưa ẩm thân mềm nhũn dễ bị gãy gập khi gặp mưa giông, gió

- Đạo ôn cổ bông và gié lúa: Trên cổ bông, gié lúa vết bệnh ban đầu là đốm nhỏ, sau lan ra theo chiều dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô tóp Nếu nhiễm bệnh sớm ( ngay sau trỗ) làm cho toàn bộ bông lúa bị lép trắng; nhiễm bệnh muộn ( vào thời kỳ làm hạt – chín ) gây ra hiện tượng bông lúa nhỏ, có nhiều hạt lép lửng, dễ gãy, gié lúa dễ rụng dẫn đến làm giảm năng suất lúa

- Đạo ôn hạt: Vết bệnh gây hại trên hạt không đồng nhất về hình dạng như trên lá lúa mà có dạng đốm tròn hoặc không định hình, có màu nâu đen hoặc xám Nấm ký sinh ở vỏ trấu và có thể ở bên trong hạt Hạt giống bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh lây truyền từ vụ này sang vụ khác Trên bề mặt vết bệnh ở các bộ phận lá, đốt thân, cổ bông đều có thể hình thành bào tử trông như lớp mốc xám

1.4.3 Vi khuẩn gây bệnh đạo ôn

Bệnh đạo ôn do nấm Magnaporthe oryzae (Hebert) là một trong những

bệnh gây hại chính ngày càng trở nên nghiêm trọng đối với nền sản xuất lúa

gạo trên thế giới (Padmavathi et al., 2005 [44]) đặc biệt ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Ấn Độ, Phillipines và Việt Nam (Vitte et al., 2004; Nguyen Thi Ninh Thuan et al., 2006 [45]), bệnh có khả năng thích nghi cao

với các điều kiện của môi trường, nơi có khí hậu ôn hòa, độ ẩm cao, hay ở những vùng đất thấp và những vùng núi cao nhiệt đới Khi dịch bệnh xảy ra

có thể làm giảm năng suất từ 1-50% tổng sản lượng lương thực của thế giới

và gây thiệt hại về kinh tế lên đến trên 70 tỉ đô la (Shimono et al., 2012 [46])

Theo Viện nghiên cứu lúa quốc tế, mỗi năm Ấn Độ mất hơn 266.000 tấn lúa hay khoảng 0,8% tổng sản lượng do bệnh đạo ôn; Nhật Bản có 865.000 ha lúa

bị nhiễm bệnh, Philippines có hàng nghìn hecta lúa bị nhiễm bệnh thiệt hại hơn 50% sản lượng Bệnh đạo ôn đặc biệt gây hại ở các quốc gia nóng ẩm như Việt Nam, Thái Lan và nhiều nước trồng lúa khác Ở Việt Nam, theo trung tâm thống kê Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2012 cả nước bị nhiễm 294.130 ha bệnh đạo ôn lá, tăng 21% so với năm 2011 Các tỉnh phía Nam bị nhiễm 239.430 ha và các tỉnh phía Bắc có 54.700 ha bị nhiễm bệnh Diện tích nhiễm bệnh đạo ôn cổ bông là 72.282 ha, tăng 40% so với năm 2011 Trong đó diện tích nhiễm nặng 1.699 ha, tăng 156% so với năm 2011, bệnh gây hại chủ yếu trên lúa tại các địa phương bị nhiễm bệnh đạo ôn lá nặng

1.4.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn

1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn trên thế giới

Năm 2009, Y Jia đã lai giống lúa Japonica nhiệt đới Katy chứa gen kháng đạo ôn Pi-tavà giống lúa Japonica ôn đới M202(Pi-ta) đã được lây nhiễm với chủng IB49 của Magnaportheoryzae mà chứa Pi-ta Con lai kháng

được xác định bằng cách lai hồi quy qua năm thế hệ Mỗi thế hệ, con lai kháng đã được lựa chọn sử dụng một chủng nấm có chứa AVR-Pita, và lai với giống bố mẹ M202 dễ bị nhiễm Hai con lai trong số 22BC5F1 được xác định

kiểu gen bằng cách sử dụng 12 marker SSR xung quanh vùng genome của

Pi-ta trên nhiễm sắc thể 12 Nhóm nghiên cứu đã kiểm tra kích thước của gen

đưa vào trong 43 con lai BC5F2 bằng cách sử dụng các marker SSR Kết quả

đã chứng minh rằng, một loạt các kích cỡ của ADN liên kết với thể cho đã được đưa vào giống bố mẹ hồi quy M202 và các giống ưu tú, còn ADN không được liên kết với thể cho đã bị loại bỏ khỏi cá thể BC5F2 Tuy nhiên, kích

thước các đoạn xung quanh bộ gen Pi-ta khác nhau giao động từ một nửa

(14Mbp) đến toàn bộ nhiễm sắc thể (27Mbp) đã được tìm thấy từ thể cho Tương tự như vậy, các phân đoạn lớn của các kích thước có thể so sánh của

vùng genome Pi-ta có nguồn gốc từ giống Tetep của Việt Nam, cũng được nhận biết trong Pi-ta của các giống lúa ở Mỹ như: Katy, Madison, Kaybonnet

và Drew Tetep có nhiễm sắc thể 12 giống hệt với giống Tadukan của Philippines Nghiên cứu này chứng tỏ rằng, một tỷ lệ lớn của nhiễm sắc thể

được duy trì bởi sự chọn lọc nhân tạo đối với tính kháng đạo ôn trong quá trình chọn giống (Y Jia et al., 2009 [47])

Năm 2011, Kei Matsushita và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng bệnh đạo ôn của giống lúa Chumroo, đây là giống lúa thường được trồng ở các vùng cao của Bhutan, Nhật Bản Trong hơn 20 năm qua, giống lúa này được xem là kháng bền với đạo ôn và chưa có bằng chứng nào chứng tỏ chúng bị nhiễm Chumroo đã được lây nhiễm với 22 chủng đạo ôn được chọn lọc theo tiêu chuẩn về các chủng khác nhau của Nhật Bản Kết quả cho thấy, giống lúa Chumroo có khả năng kháng tất cả các chủng này Để xác định các gen kháng, Chumroo được lai với giống lúa Koshihikari dễ bị nhiễm bệnh, các cây thu được ở thế hệ F1 có khả năng kháng bệnh Phân tích sự khác biệt của 300 dòng bố mẹ F3 cho thấy sự khác biệt theo tỷ lệ 1:2:1 và chỉ ra rằng một gen đơn trội kiểm soát tính kháng đạo ôn với chủng Ao92-06-2 Các

locus của Chumroo (Pi46(t)) được lập bản đồ giữa hai marker SSR là

RM6748 và RM5473, nằm ở phần cuối của cánh tay dài nhiễm sắc thể số 4,sử dụng phân tích liên kết với các marker SSR Marker gần nhất RM5473 đã liên kết với locus kháng giả định ở khoảng cách bản đồ là 3,2cm Trên nhiễm sắc thể, không xác định được gen nào kháng hoàn toàn, trong khi đó, lại có mặt 2

gen kháng một phần là Pi39(t) và Pikahei-1(t) được đặt trên phần cuối của

nhiễm sắc thể số 4 và liên kết chặt chẽ với RM5473 Vì vậy, Kei Matsushita

và Cs đã thiết kế tPi46(t) như là một locus lạ kháng đạo ôn (Kei M et al.,

2011 [48])

Năm 2015 tác giả Singh và cộng sự đã sàng lọc gen kháng đạo ôn chính trong 192 dòng/giống lúa bằng các chỉ thị phân tử SSR Kết quả nghiên cứu cho thấy 7 dòng/giống là IC337593, IC346002, IC346004, IC346813, IC356117, IC356422 và IC383441 có số gen kháng đạo ôn lớn nhất là 8 gen

10 dòng/giống FR13B, Hourakani, Kala Rata 1-24, Lemont, Brown Gora, IR87756-20-2-2-3, IC282418, IC356419, PKSLGR-1 và PKSLGR-39 có 7 gen kháng đạo ôn, 20 dòng/giống có 6 gen kháng đạo ôn, 36 dòng/giống mang 5 gen kháng đạo ôn, 41 dòng/giống mang 4 gen kháng đạo ôn, 38 dòng/giống mang 3 gen kháng đạo ôn, 26 dòng/giống mang 2 gen kháng đạo

ôn, 13 dòng/giống mang 1 gen kháng đạo ôn, duy nhất dòng/giống IC438644 không mang gen kháng đạo ôn nào Việc xác định và phân tích các gen kháng đạo ôn cho thấy các chỉ thị DNA là công cụ hữu ích để xác định và sàng lọc gen kháng đạo ôn trong các dòng/giống lúa Trong nghiên cứu này các marker SSR được sử dụng để sàng lọc các gen kháng đạo ôn khác nhau rất hiệu quả

và đáng tin cậy 17 dòng/giống mang 7 và 8 gen kháng đạo ôn của nghiên cứu này có thể được sử dụng như nguồn vật liệu cho gen kháng trong các chương trình chọn giống kháng bệnh đạo ôn (Singh et al., 2015 [49])

1.4.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn ở Việt Nam

Chọn tạo các dòng/giống lúa kháng đạo ôn bền vững được xem là biện pháp đem lại hiệu quả cao trước nguy cơ hình thành chủng nấm mới và bùng phát dịch bệnh Để có đủ cơ sở dữ liệu và nguồn vật liệu cần thiết phục vụ cho công tác chọn tạo các giống lúa kháng đạo ôn, đáp ứng được yêu cầu của thực

tế sản xuất chúng ta cần phải tiến hành nghiên cứu một cách toàn diện hơn nữa trong giai đoạn hiện nay Triển khai giống kháng luôn tỏ ra là một trong những biện pháp hiệu quả trong quản lý bệnh đạo ôn Tuy nhiên, các giống đơn gen thường bị mất hiệu lực rất nhanh sau khi xuất hiện các chủng mới do chỉ kháng được một vài chủng địa lý nhất định Nghiên cứu quy tụ đa gen kháng đã được tiến hành ở Việt Nam và đã đạt được những hiệu quả nhất định trong công tác phát triển giống lúa kháng đạo ôn

Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự (2009) [50] đã lai quy tụ gen kháng bệnh đạo

ôn Pi-1 và Pi-5 vào dòng lúa được tạo ra bằng phương pháp đột biến phóng

xạ bằng tia gama - (60Co) giống lúa Bắc thơm 7 Quá trình qui tụ 2 gen kháng

đạo ôn Pi-1 và Pi-5 được tiến hành cùng lúc Khi đã có được 2 cá thể BC3F2Pi-1 và BC3F2Pi-5 mang kiểu gen đồng hợp tử gen kháng Pi-1 và Pi-

5, đồng thời vẫn mang trên mình nền của dòng lúa triển vọng ban đầu Tiến

hành lai tạo đưa 2 gen Pi-1 và Pi-5 vào cùng một cá thể, đồng thời tiến hành

sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lựa được dòng có triển vọng (đồng hợp tử 2

gen kháng đạo ôn) từ việc tiến hành tự thụ cá thể F1 (mang 2 gen kháng Pi-1

và Pi-5) Do gen Pi-1 và gen Pi-5 nằm trên 2 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau (Pi-1 nằm trên NST số 11 và Pi-5 nằm trên NST số 9), nên ta có thể quy ước

như sau: p2p2 là cặp gen nằm trên NST số 9 của cây lúa được quy tụ gen Pi-1

(là gen lặn, không được biểu hiện ra bên ngoài kiểu hình) có vị trí tương ứng

với vị trí của gen Pi-5 (có kiểu gen P2P2) trên NST số 9; p1p1 là cặp gen nằm trên NST số 11 của cây lúa được quy tụ gen Pi-5 (là gen lặn, không được biểu hiện ra bên ngoài kiểu hình) có vị trí tương ứng với vị trí của gen Pi-1 (có

kiểu gen P1P1) trên NST số 11 Bởi vậy, khi tiến hành lai tạo giữa BC3F2Pi-1

và BC3F2Pi-5 chúng ta sẽ có những kiểu gen của F1 là P1p1P2p2 Khi F1 tiến hành tự thụ; sử dụng chỉ thị phân tử để chọn cá thế mang kiểu gen đồng

hợp tử trội gen kháng (có kiểu gen P1P1P2P2) mang hai gen Pi-1 và Pi-5

kháng đạo ôn Qua nhiều thế hệ chọn lọc đánh giá dòng lúa triển vọng đã ổn định, có tiềm năng năng suất cao hơn giống Bắc thơm 7, chống chịu tốt, kháng đạo ôn và chống chịu sâu, được đặt tên là dòng NB-01

Hiện nay, các trình tự SSR vẫn là một nguồn dấu chuẩn ADN quan trọng trong phân tích di truyền và chọn giống lúa, nhưng các đa hình đơn nucleotit (SNPs) sẽ trở thành một nguồn dấu chuẩn di truyền thường gặp nhất của đa hình ADN Việc tập hợp thông tin về SNPs sẽ giúp chúng ta trong việc lập kế hoạch cho chương trình chọn giống kháng đạo ôn và phát hiện tái tổ hợp xảy ra giữa các khối haplotype (các cá thế có SNPs) Để có được số lượng SNPs đủ cho mục tiêu này, chúng ta phải giải trình tự toàn bộ hệ gen của các giống đại điện để xây dựng được một cơ sở dữ liệu dựa trên các SNPs toàn bộ hệ gen để chọn lọc các SNPs và xác định tần số SNPs trong quần thể

Dữ liệu SNPs đầy đủ của hệ gen sẽ tạo điều kiện cải tiến khả năng kháng đạo

ôn của cây lúa một cách hiệu quả khi kết hợp với hệ thống chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS)

1.5 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA

Marker phân tử đã trở thành công cụ quan trọng cho phân tích di truyền

và cải tiến cây trồng Có nhiều chỉ thị phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, ISSR, SSR, EST, CAPS, và SNP) đã được phát triển và ứng dụng trong chọn tạo một số cây trồng (Doveri và cs 2008 [51]) Chúng đều có những ưu, nhược điểm nhất định Tuy nhiên, một số chỉ thị phân tử vẫn được sử dụng rộng rãi

trong chọn tạo giống cây trồng có sự hỗ trợ bởi các kỹ thuật như MAS và MABC

1.5.1 Ứng dụng phương pháp chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của marker trong chọn tạo giống lúa (Marker Assisted Selection – MAS)

MAS được cho là chỉ thị phân tử liên kết với các locut đích để thay thế cho việc sàng lọc theo kiểu hình Bằng cách xác định alen của chỉ thị phân tử, cây trồng có chứa các gen đặc hiệu hoặc các QTL có thể được xác định dựa trên kiểu gen chứ không cần xác định theo kiểu hình Các ưu điểm nổi trội của MAS đó là:

- Có thể được áp dụng để tiến hành chọn lọc ở giai đoạn phát triển đầy của cá thể, do đó rút ngắn được thời gian chọn lọc;

- MAS không chịu tác động của các điều kiện môi trường;

- MAS giúp hỗ trợ hiệu quả việc chọn lọc các alen lặn quy định tính trạng mong muốn;

- MAS giúp tăng cường hiệu quả của việc quy tụ nhiều gen mong muốn vào một giống/dòng mới;

- Tùy thuộc vào từng tính trạng, MAS có thể có giá thành rẻ hơn và dễ thực hiện hơn so với hình thức chọn lọc truyền thống;

Tuy nhiên việc sử dụng MAS cũng có một vài hạn chế sau:

- Chi phí cho MAS có thể cao hơn các kĩ thuật truyền thống;

- Sự phân ly và tái tổ hợp giữa chỉ thị và gen cần qua tâm có thể xảy ra dẫn đến việc chọn lọc không chính xác Nhược điểm này có thể được hạn chế bằng cách sử dụng cùng lúc hai marker nằm ở hai phía của gen cần quan tâm;

- Việc sử dụng một số marker trong quá trình chọn giống rất phức tạp,

vì vậy các marker này cần được cải tiến thành dạng dễ sử dụng hơn cho các nhà chọn giống;

- Việc ước lượng không chính xác vị trí của QTL và mức độ tác động một QTL đối với tính trạng mong muốn có thể làm kéo dài thời gian chọn lọc;

- Marker phát triển cho MAS ở một quần thể có thể không thể sử dụng được ở quần thể khác

Tuy nhiên, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống bằng MAS vẫn bị hạn chế do tác động của phân ly tái tổ hợp, chỉ thị phân tử và gen không còn liên kết với nhau trên một nhiễm sắc thể Khi đó việc chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả không chính xác Để loại

bỏ tác động của hoạt động phân ly tái tổ hợp, có thể sử dụng các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trên gen kháng, khi đó sự biểu hiện của chỉ thị có thể đảm bảo sự có mặt của gen kháng trong cá thể Ngoài ra có thể sử dụng kết hợp 2 chỉ thị nằm ở hai phía của gen kháng trong quá trình chọn lọc Sự

có mặt của hai chỉ thị này trong cùng một cá thể sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc Chính vì vậy, việc phân tích genome, xác định chính xác vị trí, trình

tự gen để thiết kế các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trong hoặc ngay

2 đầu gen đích có thể loại bỏ tác động của sự phân ly tái tổ hợp, làm tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc cá thể mang gen kháng phục vụ công tác lai tạo

giống (Miah và cs., 2013 [52])

 Ứng dụng MAS trong quy tụ gen chọn tạo giống lúa trên thế giới

Các gen kháng khác nhau sẽ tạo ra tính khác đối với các chủng hay nòi gây bệnh khác nhau, vì vậy việc quy tụ gen được coi là một giải pháp khả thi

để cải thiện độ bền vững của tính kháng Quá trình tập hợp nhiều gen vào một giống lúa có thể được tiến hành hiệu quả hơn nhờ sử dụng MAS Sử dụng MAS trong quá trình quy tụ gen giúp đồng thời chọn lọc nhiều gen cũng như hạn chế việc tiêu tốn thời gian vào việc lây nhiễm các chủng/nòi bệnh khác nhau ở các khoảng thời gian khác nhau Các dòng mang hai, ba và 4 gen kháng đã được phát triển và các dòng mang nhiều gen quy tụ này có phổ kháng rộng hơn và mức độ kháng cao hơn các dòng đơn gen Sanchez và cs

(2000) [53] tiến hành chuyển ba gen kháng bạc lá là xa5, xa13 và Xa21 vào

ba dòng lúa triển vọng nhưng mẫn cảm với bạc lá là IR65598-112,

IR65600-42, and IR65600-96 nhờ sử dụng các marker STS Các dòng đẳng gen thế hệ BC3F3 có nhiều hơn một gen kháng bạc lá và biểu hiện tính kháng mạnh hơn

và phổ kháng rộng hơn đối với các chủng Xoo Độ chính xác trong chọn lọc

các cá thể kháng đồng hợp đối với 2 gen xa5 và xa13 ở hai quần thể là 95%

và 96% Một thí nghiệm quy tụ gen với sự hỗ trợ của marker phân tử khác là thí nghiệm quy tụ 3 gen đã đề cập ở trên vào giống lúa PR106 được trồng phổ biến ở Ấn Độ do Singh và cs (2001) [31] thực hiện Thử nghiệm đồng ruộng đối với các dòng mang gen quy tụ ở Philipin và Ấn Độ đã cho thấy tính kháng bạc lá tăng cường của các dòng này so với các dòng đơn gen kháng

Nhiều thử nghiệm kết hợp nhân giống ở cấp độ phân tử và chuyển gen thực vật đã được tiến hành nhằm cải tiến các dòng lúa ưu việt Narayanan và

cs (2002) [54] đã tập hợp ba gen kháng chính là Pi-1, Piz-5 và Xa21 vào dòng lúa Co39 và hai gen kháng chính là Pi-5 và Xa21 vào dòng lúa IR50 nhờ

sử dụng kết hợp MAS và phương pháp chuyển gen để tạo ra tính kháng bệnh bạc lá và khô vằn Ở giai đoạn đầu tiên, các dòng kháng bạc lá được tạo ra nhờ 4 vòng lai trở lại kết hợp chọn lọc bằng marker phân tử Ở giai đoạn thứ

hai, các dòng kháng được chuyển gen Xa21 Ở một nghiên cứu khác, Datta và

cs (2002) [55] đã áp dụng MAS để tạo ra giống lúa IR72 IR72 được chọn tạo

từ phép lai giữa hai dòng lúa chuyển gen mang các gen kháng khác nhau như

gen kháng bạc lá - Xa21, gen kháng sâu đục thân lúa hai chấm - Bt, gen chống

chịu bệnh khô vằn - chitinase gen Giống lúa này biểu hiện tính kháng bền vững với phổ kháng bệnh và côn trùng rộng Trong nghiên cứu này, các gen chuyển được sử dụng như những marker STS để tạp ra các dòng quy tụ đồng

hợp tử một cách nhanh chóng Jiang và cs (2004) [56] quy tụ gen Xa21 kháng đạo ôn và một gen Bt liên hợp (cry1Ab/cry1Ac) qui định tính kháng với côn

trùng bộ cánh vảy vào một dòng lúa phục hồi Minghui63 Các thử nghiệm đồng ruộng chỉ ra rằng con lai của dòng quy tụ này với dòng bất dục tế bào chất “Zhenshan 97A” và “Maxie A” có khả năng giữ vững năng suất mà không cần sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Với sự trợ giúp của marker STS và

SSR cho gen Xa21 và gen waxy

Năm 2009, Y Jia đã lai giống lúa Japonica nhiệt đới Katy chứa gen kháng đạo ôn Pi-ta và giống lúa Japonicaôn đới M202(Pi-ta) đã được lây nhiễm với chủng IB49 của Magnaportheoryzae mà chứa Pi-ta Con lai kháng

được xác định bằng cách lai hồi quy qua năm thế hệ Mỗi thế hệ, con lai

kháng đã được lựa chọn sử dụng một chủng nấm có chứa AVR-Pita, và lai với giống bố mẹ M202 dễ bị nhiễm Hai con lai trong số 22BC5F1 được xác định kiểu gen bằng cách sử dụng 12 marker SSR xung quanh vùng genome của Pi-

ta trên nhiễm sắc thể 12 Nhóm nghiên cứu đã kiểm tra kích thước của gen đưa vào trong 43 con lai BC5F2bằng cách sử dụng các marker SSR Kết quả

đã chứng minh rằng, một loạt cáckích cỡ của ADN liên kết với thể cho đã được đưa vào giống bố mẹ hồi quy M202 và các giống ưu tú,còn ADN không được liên kết với thể cho đã bị loại bỏ khỏi cá thể BC5F2.Tuy nhiên,kích thước các đoạn xung quanh bộ gen Pi-ta khác nhau giao động từmột nửa (14Mbp) đến toàn bộ nhiễm sắc thể(27Mbp) đã được tìm thấy từ thể cho.Tương tự như vậy, các phân đoạn lớn của các kích thước có thể so sánh của vùng genome Pi-ta có nguồn gốc từ giống Tetep của Việt Nam,cũng được nhận biết trong Pi-ta của các giống lúa ở Mỹ như: Katy, Madison, Kaybonnet

và Drew Tetep có nhiễm sắc thể 12 giống hệt với giống Tadukan của Philippines Nghiên cứu nàychứng tỏ rằng, một tỷ lệ lớn của nhiễm sắc thể được duy trì bởi sự chọn lọc nhân tạo đối với tính kháng đạo ôn trong quá trình chọn giống

Năm 2013, Singh và cộng sự đã lai tạo giống lúa Pusa1609 mang hai

gen kháng đạo ôn Piz5 (từ giống C101A51) và gen Pi54 (từ giống Tetep) với

nền di truyền là PRR78, một dòng lúa lai ưu tú của Basmati, bằng phương pháp lai hồi quy và sử dụng marker phân tử trong chọn lọc Các dòng cho gen (C101A51, và Tetep) được lai riêng rẽ với dòng nhận gen (PRR78), các con lai ưu tú được chọn lọc và lai trở lại đến thế hệ BC2F1 Các con lai này được lai chéo với nhau tạo ra thế hệ F1, rồi cho tự thụ, và chọn lọc đến F5 để tạo ra

dòng đồng hợp về hai gen Piz5 và Pi54 mang nền di truyền của giống bố mẹ

(91,6%).Kết quả là dòng lai này đã cải thiện được tính kháng đạo ôn của dòng

bố mẹ (PRR78) trong cả điều kiện lây nhiễm nhân tạo và điều kiện tự nhiên (trong vùng nhiễm bệnh)

Fatah A Tanweer và cs (2015) [10] đã sử dụng phương pháp MABC

(marker-assisted backcrossing) tích hợp hai gen Pikp và Pib vào giống lúa

MR219, giống lúa nhiễm bệnh đạo ôn của Malaysia Tác giả đã chọn lọc được

15 dòng mang gen đồng hợp cả hai gen Pib và Pikh có nền di truyền hơn 95% của giống MR219, năng suất cao và chất lượng tương đương giống MR219 Kết quả đóng vai trò uan trọng trong việc duy trì sản xuất lúa gạo ở Malaysia

Năm 2016, Ellur [57] và cộng sự đã lai tạo và tích hợp được 2 gen

kháng đạo ôn (Pi2 và Pi54) từ hai dòng cho gen và 2 gen kháng bạc lá (xa13

và Xa21) từ dòng cho gen P1460 vào nền di truyền của Pusa Basmati

(PB1121) và Pusa Basmati 6 Nghiên cứu cho thấy các chỉ thị SNP là tốt hơn cho việc chọn lọc nền di truyền so với các chỉ thị SSR, do độ bao phủ toàn hệ gen của các chỉ thị SNP Dòng tích hợp các gen kháng đạo ôn và bạc lá này có khả năng chống chịu tốt và cho năng suất cao khi đánh giá ở nhiều vùng khác

nhau Hai gen kháng Pi64, Pita của giống H4 được tích hợp vào giống

Hang-Hui-179 (HH179) bằng phương pháp MABB (marker-assisted backcross breeding) Kết quả đã tạo được ba dòng, R1791 mang gen Pi64, R1792 mang

gen Pita, R1792 mang gen Pi46, R1793 mang hai gen Pi46 và Pita Khả năng

kháng bệnh của ba dòng ở giai đoạn mạ tương ứng là 91.1, 64.7 và 97.1%, cao hơn rõ rệt so với HH179 (23,5%) R1793 biểu hiện tính kháng đạo ôn bông nhưng R1791 và R1792 không biểu hiện tính kháng ở cả hai giai đoạn

mạ ( đạo ôn hại lá) và giai đoạn vào chắc (đạo ôn bông) Kết quả thể hiện việc tích hợp hai gen Pi64 và Pita làm tăng sức đề kháng hơn so với việc tích hợp từng gen đơn lẻ của dòng/giống (Xiao at al, 2016 [58]) Abhilash Kumar V,

2016 sử dụng phương pháp MABB quy tụ đa gen bạc lá và đạo ôn Xa21, xa33, Pi2 vào 10 dòng đạt các chỉ tiêu nông sinh học tốt hơn giống nền nhận gen ban đầu

Chaipanyaet và cộng sự, 2017 đã tạo ra các dòng lúa monogenic chứa QTL1 (QTL1-C) và QTL11 (QTL11-C) trên nền di truyền của giống CO39 thông qua lai với giống cho gen kháng Phân tích “cluster” trên cơ sở phản ứng bệnh của QTL1-C và QTL11-C, kết hợp với các dòng lúa IRBLs, cho thấy: hai dòng monogenic ấy được xếp vào cùng nhóm di truyền với IRBLsh-

S (Pish) và IRBL7-M (Pi7), theo thứ tự Thêm vào đó, phân tích chuỗi trình

tự cho thấy gen Pish và Pi7 được gắn vào trong vùng QTL1 và QTL11 –

quãng giữa phân định ranh giới genomic, theo thứ tự Nghiên cứu kết luận

rằng QTL1 và QTL11 có thể mã hóa các alen của Pish và Pi7, ký hiệu là

Pish-J và Pi7-J, theo thứ tự Muốn minh chứng giả định nói trên, các vùng

genomic của gen Pish-J và Pi7-J được người ta dòng hóa (cloned) và giải trình tự So sánh chuỗi trình tự protein của các gen Pish-J và Pi7-J cho thấy

có sự đồng nhất với Pish và Pi7, theo thứ tự Phổ kháng bệnh chính của giống

lúa JHN đã được tìm thấy có tính chất “additive” (hoạt động tương tác của gen cộng tính) của QTL1-C và QTL11-C (Chaipanyaet và cs 2017)

Tác giả Xiao, 2017 [59] sử dụng các giống 75-1-127, Toride 1 và K3 của Thái lan mang gen Pi9, Pizt, Pi54 lai với giống Japonica 07GY31 có tính trạng nông học tốt Bằng phương pháp MABC, nghiên cứu đã tạo các dòng (NILs) NILPi9, NILPizt, NILPi54 Các dòng trên có nền di truyền so với giống 07GY31 là 97% (BC3F5), tiếp tục lai tạo và tạo ra hai dòng PPLPi9+Pi54 và PPLPi54+Pizt Khi lây nhiễm nhân tạo các dòng trên có tần số kháng bệnh cao hơn giống nên ban đầu 07GY31 ở cả hai đạo ôn cổ bông và lá Tần số kháng bệnh đạo ôn ở lá của hai dòng PPL cao hơn hai dòng NIL và dòng PPLPi54+Pizt

có tần số kháng bệnh đạo ôn cổ bông cao hơn hai dòng NILPizt, NILPi54 (P < 0.001) Tuy nhiên, dòng PPLPi9+Pi54 có tần số kháng bệnh đạo ôn cổ bông thấp hơn dòng NILPi9 (P < 0.001) Kết quả cũng xác định dòng PPLPi54+Pizt có khả năng kháng bệnh đạo ôn cổ bông tốt hơn dòng PPLPi9+Pi54

Jairin và cộng sự, 2017 [13] đã sử dụng phương pháp MAS tạo ra giống

lúa chất lượng, chịu ngập, kháng bạc lá quy tụ 6 gen xa5, Xa21, xa33, badh2,

Wx b , Sub1 tại Thái Lan

 Ứng dụng MAS trong quy tụ gen ở Việt Nam

Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự (2009) [50] đã lai quy tụ gen kháng bệnh đạo

ôn Pi-1 và Pi-5 vào dòng lúa được tạo ra bằng phương pháp đột biến phóng xạ bằng tia gama - (60Co) giống lúa Bắc thơm 7 Quá trình qui tụ 2 gen kháng

đạo ôn Pi-1 và Pi-5 được tiến hành cùng lúc Khi đã có được 2 cá thể BC3F2Pi-1 và BC3F2Pi-5 mang kiểu gen đồng hợp tử gen kháng Pi-1 và Pi-

5, đồng thời vẫn mang trên mình nền của dòng lúa triển vọng ban đầu Tiến

hành lai tạo đưa 2 gen Pi-1 và Pi-5 vào cùng một cá thể, đồng thời tiến hành

sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lựa được dòng có triển vọng (đồng hợp tử 2

gen kháng đạo ôn) từ việc tiến hành tự thụ cá thể F1 (mang 2 gen kháng Pi-1

và Pi-5) (Hình 6) Sơ đồ chọn tạo ở hình 6 cho thấy: Do gen Pi-1 và gen Pi-5 nằm trên 2 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau (Pi-1 nằm trên NST số 11 và Pi-5

nằm trên NST số 9); Nên ta có thể qui ước như sau: p2p2 là cặp gen nằm trên

NST số 9 của cây lúa được quy tụ gen Pi-1 (là gen lặn, không được biểu hiện

ra bên ngoài kiểu hình) có vị trí tương ứng với vị trí của gen Pi-5 (có kiểu gen

P2P2) trên NST số 9; p1p1 là cặp gen nằm trên NST số 11 của cây lúa được

quy tụ gen Pi-5 (là gen lặn, không được biểu hiện ra bên ngoài kiểu hình) có

vị trí tương ứng với vị trí của gen Pi-1 (có kiểu gen P1P1) trên NST số 11

Bởi vậy, khi tiến hành lai tạo giữa BC3F2Pi-1 và BC3F2Pi-5 chúng ta sẽ có những kiểu gen của F1 là P1p1P2p2 Khi F1 tiến hành tự thụ; sử dụng chỉ thị phân tử để chọn cá thế mang kiểu gen đồng hợp tử trội gen kháng (có kiểu

gen P1P1P2P2) mang hai gen Pi-1 và Pi-5 kháng đạo ôn Qua nhiều thế hệ

chọn lọc đánh giá dòng lúa triển vọng đã ổn định, có tiềm năng năng suất cao hơn giống Bắc thơm 7, chống chịu tốt, kháng đạo ôn và chống chịu sâu, được đặt tên là dòng NB-01

Nguyễn Thị Lang và cộng sự đã tạo ra sáu tổ hợp lai, OM 24/IR 64, IR 24/OM 2514, C 53/IR 64, C53/OM 2514, OM 1308/TeTep và IR 36/C53 Trong số đó, có bốn tổ hợp lai đã được lập bản đồ bằng cách sử dụng marker phân tử Các gen kháng là di truyền trội và nằm trên nhiễm sắc thể 6, 8 và 11 Marker SSR (RM483) đã được sử dụng để phát hiện khả năng kháng đạo ôn của 100 giống địa phương ở Đồng bằng sông Cửu Long So sánh giữa chọn lọc kiểu hình và kiểu gen cho thấy sử dụng marker SSR với mồi RM483 chính xác đến 100%, so với hệ thống chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS) Những phương pháp này có thể được áp dụng trong thực tế để lựa chọn các giống lúa có gen kháng bệnh đạo ôn cao Đa hình cũng cho thấy MAS đạt độ chính xác 100% khi sử dụng marker STS với mồi RG64 và chính xác đến 99,49% khi sử dụng marker SSR với mồi RM21 Ngoài ra, một số giống lúa kháng đạo ôn như P(OM1), OMP2, OMP4, OMP5 và OMP6 đã được báo cáo