Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Nghiên cứu vi sinh vật chịu mặn, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật trên đất trồng cây bưởi Da xanh và cây sầu riêng tại tỉnh Bến Tre

Mục đích nghiên cứu của đề tài là phân lập, định danh tên loài chủng vi sinh vật (vi khuẩn) có khả năng chịu mặn, có hoạt tính sinh học (kích thích sinh trưởng thực vật) nhằm hỗ trợ cây ăn quả (cây bưởi Da xanh, cây sầu riêng) phục hồi và phát triển trên đất bị nhiễm mặn.

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Mai Thị Hồng Hạnh

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT CHỊU MẶN, TỔNG HỢP KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT TRÊN ĐẤT TRỒNG CÂY BƯỞI DA XANH VÀ CÂY SẦU RIÊNG

TẠI TỈNH BẾN TRE

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS Nguyễn Đức Thành Hướng dẫn 2: PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng

Hà Nội - năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn

đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên cao học

Mai Thị Hồng Hạnh

LỜI CÁM ƠN

Luận văn là một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phục hồi sản xuất cây ăn quả trên đất bị nhiễm mặn tại tỉnh Bến Tre”, mã số: ĐTĐLCN.29/17 do Bộ Khoa học và Công nghệ cấp kinh phí thực hiện, TS Nguyễn Đức Thành làm chủ nhiệm đề tài Phần kết quả nghiên cứu này đã được những người cùng tham gia thực hiện cho phép

và sử dụng trong luận văn

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng và TS Nguyễn Đức Thành đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này

Tôi xin được gửi lời chân thành cám ơn tới Ban Giám đốc Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban Giám đốc Viện Di truyền Nông nghiệp, cùng các thầy, cô giáo đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập

Tôi cũng xin được chân thành cám ơn tập thể cán bộ tại Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên cao học

Mai Thị Hồng Hạnh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Diễn giải ký hiệu, chữ viết tắt

1 BVTV Bảo vệ thực vật

3 CFU Colony forming unit (Số đơn vị khuẩn lạc)

4 CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

5 DNA Deoxy nucleic acid

6 ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

7 IAA Indole-3-acetic acid

8 ITS Internal transcribed spacer (Vùng liên gen)

9 LB Luria-Bertani medium (môi trường Luria-Bertani)

10 Nts Nucleotides

11 OD Optical density (Mật độ quang)

12 PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

13 PGPR Plant growth-promoting rhizobacteria (Vi khuẩn vùng

rễ kích thích sinh trưởng thực vật)

14 VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích sinh

trưởng thực vật từ mẫu thu thập tại Bến Tre và một số tỉnh lân cận 31

Bảng 3.2 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA của vi khuẩn chịu mặn bằng phương pháp so màu 34

Bảng 3.3 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA của chủng vi khuẩn chịu mặn bằng đo mật độ quang 37

Bảng 3.4 Một số đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn T0906 39

Bảng 3.5 Một số đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn T0906 41

Bảng 3.6 Kết quả tìm kiếm các trình tự gần gũi trên Ngân hàng Gen 43

Bảng 3.8 Khả năng chịu muối NaCl của chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 trên môi trường Ashby 47

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 48

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 trên môi trường Ashby 49

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 trên môi trường Ashby 51

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Triệu chứng trên cây (a), trên lá (b) và triệu chứng trên quả bưởi Da

xanh (c, d) bị ảnh hưởng của nhiễm mặn tại tỉnh Bến Tre 9

Hình 1.2 Triệu chứng trên cây (a), trên lá (b), triệu chứng trên hoa (c), quả sầu riêng RI6 (d) bị ảnh hưởng của nhiễm mặn tại tỉnh Bến Tre 9

Hình 3.1 Tỷ lệ chủng vi khuẩn có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật trên các mẫu thu thập tại 4 tỉnh 32

Hình 3.2 Một số hình thái khuẩn lạc của chủng vi sinh vật có khả năng chịu muối NaCl ≥ 1%, có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật 33

Hình 3.3 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp IAA của chủng vi khuẩn bằng phương pháp so màu 36

Hình 3.4 Hàm lượng IAA của các chủng vi khuẩn 38

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR 43

Hình 3.7 Cây phả hệ dựa trên vùng 16S ribosome của vi khuẩn 45

Hình 3.8 Ảnh hưởng của các nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 trên môi trường Ashby 47

Hình 3.9 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 49

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 50

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn Achromobacter sp T0906 51

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ v

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 3

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 3

2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 4

2.1 Mục đích 4

2.2 Yêu cầu 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA BIỆN PHÁP CẢI TẠO ĐẤT NHIỄM MẶN BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT 5

1.2 TÌNH HÌNH XÂM NHẬP MẶN TẠI TỈNH BẾN TRE 7

1.2.1 Đặc điểm đất nhiễm mặn 7

1.2.2 Nguyên nhân gây mặn 7

1.2.3 Xâm nhập mặn ở tỉnh Bến Tre 7

1.3 NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT CHỊU MẶN, CÓ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT 10

1.3.1 Khả năng tổng hợp IAA của vi sinh vật 10

1.3.2 Nghiên cứu vi sinh vật có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật trên thế giới 11

1.3.3 Nghiên cứu vi sinh vật có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật ở Việt Nam 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19

2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.5.1 Phương pháp phân lập, tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn, tổng hợp kích

thích sinh trưởng thực vật 22

2.5.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật của vi khuẩn chịu mặn được nồng độ muối NaCl ≥ 1% 22

2.5.3 Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn 24

2.5.4 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn 28

2.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 PHÂN LẬP VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH TỔNG HỢP KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT 31

3.2 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH TỔNG HỢP KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT CỦA VI KHUẨN CHỊU MẶN ĐƯỢC NỒNG ĐỘ MUỐI NaCl ≥ 1% 34

3.3 ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN TUYỂN CHỌN CÓ KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI NaCl 1%, CÓ HOẠT TÍNH TỔNG HỢP KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT 39

3.3.1 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng kỹ thuật truyền thống 39

3.3.2 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử 42 3.4 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI SINH VẬT TUYỂN CHỌN 46

3.4.1 Khả năng chịu mặn của chủng vi khuẩn T0906 46

3.4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 48

3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 49

3.4.4 Ảnh hưởng của pH môi trường 50

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

4.1 KẾT LUẬN 52

4.2 KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 61

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ cuối năm 2014, do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu làm cho nền nhiệt độ tăng cao, thiếu hụt lượng mưa, là nguyên nhân gây ra tình trạng hạn hán, xâm nhập mặn, đã gây thiệt hại nặng nề và đe dọa nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, sinh hoạt của người dân Các khu vực bị ảnh hưởng nặng là Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long

Do ảnh hưởng của xâm nhập mặn, nhiều diện tích cây trồng đã bị ảnh hưởng

Ở vụ Mùa và Thu Đông năm 2015, có khoảng 90.000 ha lúa bị ảnh hưởng đến năng suất, trong đó thiệt hại nặng khoảng 50.000 ha (Kiên Giang 34.000 ha, Sóc Trăng 6.300 ha, Bạc Liêu 5.800 ha, ) Vụ Đông Xuân 2015-2016, có 104.000 ha lúa bị ảnh hưởng nặng đến năng suất (chiếm 11% diện tích gieo trồng 8 tỉnh ven biển - đang bị ảnh hưởng nặng của xâm nhập mặn) Dự kiến, trong thời gian tới, diện tích bị ảnh hưởng khoảng 340.000 ha (chiếm 35,5% diện tích 8 tỉnh ven biển)

Đến đầu năm 2020, mức ảnh hưởng của xâm nhập mặn được đánh giá còn diễn ra gay gắt hơn so với năm 2015 - 2016 Tính đến ngày 4 tháng 3 năm 2020, đã có 5 tỉnh Kiên Giang, Bến Tre, Tiền Giang, Cà Mau và Long

An công bố tình huống khẩn cấp về hạn, mặn Dù các địa phương đã rút kinh nghiệm từ những đợt hạn, mặn trước đây nhưng vẫn không tránh được thiệt hại Ở hạ nguồn 3 nhánh sông Mekong gồm sông Tiền, sông Hàm Luông và sông Cổ Chiên, tỉnh Bến Tre là địa phương chịu ảnh hưởng sớm nhất của tình huống nước mặn xâm nhập Đợt xâm nhập mặn năm 2016 được xem là đợt mặn kỷ lục, 100 năm mới lặp lại thì mùa khô năm 2020 đã phá vỡ mọi kỷ lục được xác lập trước đó Nếu như năm 2016, nước mặn “âm thầm” xâm nhập vào những ngày người dân đang đón Tết Nguyên đán thì năm 2020 nước mặn xâm nhập sớm hơn năm 2016 khoảng 1 tháng

Bến Tre là một trong những địa phương sẽ chịu ảnh hưởng nặng nề do biến đổi khí hậu Đặc biệt, năm 2010, hạn mặn đã làm thiệt hại và giảm năng suất 1.575 ha lúa, bỏ hoang không sản xuất 4.500 ha, thiệt hại và giảm năng

suất 10.162 ha cây ăn quả Theo dự báo của Trung tâm Khí tượng - Thủy văn tỉnh Bến Tre, nhiễm mặn 1‰ trên 3 sông lớn là Hàm Luông, Cửa Đại và Cổ Chiên vào sâu trong đất liền từ 57 - 68 km Nhiễm mặn 4‰ trên sông Hàm Luông đã và sâu 50km; đặc biệt mặn 1 - 3‰ trên sông Hàm Luông đã tấn công đến vương quốc trái cây đặc sản, hoa kiểng, cây giống Chợ Lách Trong khi đó, trên sông Cửa Đại mặn 4‰ đã vào sâu gần 50 km, đến xã Quới Sơn, Tân Thạch thuộc huyện Châu Thành; trên sông Cổ Chiên mặn 4‰ lên đến xã Nhuận Phú Tân, Hưng Khánh Trung (khoảng 55 - 60 km) Tình hình thiệt hại

do xâm nhập mặn tính đến tháng 3/2016 trên địa bàn tỉnh Bến Tre, diện tích cây ăn quả bị thiệt hại khoảng 1.275 ha (UBND tỉnh Bến Tre, 2016)

Xuất phát từ thực tiễn trên, với mong muốn tìm ra giải pháp cải tạo đất giúp cây trồng sinh trưởng phát triển tốt trên nền đất nhiễm mặn, tăng năng suất, chất lượng và đem lại hiệu quả kinh tế cao, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu vi sinh vật chịu mặn, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật trên đất trồng cây bưởi Da xanh và cây sầu riêng tại tỉnh Bến Tre”

2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

2.1 Mục đích

Phân lập, định danh tên loài chủng vi sinh vật (vi khuẩn) có khả năng chịu mặn, có hoạt tính sinh học (kích thích sinh trưởng thực vật) nhằm hỗ trợ cây ăn quả (cây bưởi Da xanh, cây sầu riêng) phục hồi và phát triển trên đất bị nhiễm mặn

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và độ pH đến

sự phát triển của chủng vi khuẩn đã phân lập, tuyển chọn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA BIỆN PHÁP CẢI TẠO ĐẤT NHIỄM MẶN BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT

a) Khả năng chống chịu mặn

Nhiều nghiên cứu cho thấy sau khi nhiễm nấm cộng sinh vùng rễ như

Glomus mosseae, G intraradices, G versiform, G etunicatum, Paraglomus occultum (Selvaraj & Chellappan, 2006; Wu & Zou, 2009; Evelin et al., 2009; Porcel et al., 2011), vi khuẩn như các loài thuộc chi Azospirillum, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter (Kumar et al., 2001; Khan et al., 2007) lên cây trồng giúp cho cây trồng tăng khả năng

chống khô hạn, chống chịu mặn, nhiệt độ, độ ẩm và pH cực đoan và hàm lượng kim loại nặng

Cây nhiễm vi sinh vật có ích thì có thể chống chịu được với độ mặn trong đất hoặc trong nước tưới Hệ thống nấm đóng vai trò quan trọng trong quá trình thẩm thấu và tạo điều kiện cho sự hấp thụ nước có nồng độ muối

cao hơn (Khan et al., 2007; Maheshwari, 2013)

b) Khả năng kích thích tăng trưởng của vi sinh vật

Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, vi sinh vật hình thành nhiều chất kích thích sinh trưởng như chất sinh trưởng tế bào (auxin), chất phân chia tế

bào (cytokinin), vitamin B1, indol-3acetic acid (IAA),… (Hayat et al., 2010; Khan et al., 2007; Maheshwari, 2013)

c) Khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng

Trong đất, hàm lượng lân khó tan (insoluble phosphate) chiếm tỷ lệ 95

- 99% (Hayman, 1975), chỉ một lượng rất ít lân dễ tiêu (soluble phosphate)

mà cây có thể hấp thụ được Vi sinh vật tiết ra enzym phosphorase chuyển hóa lân khó tan thành lân dễ tiêu giúp cho cây sinh trưởng phát triển Ngoài

ra, vi sinh vật có thể sản sinh muối oxalate kết hợp với sắt (Fe), nhôm (Al),

lân (P) không tan trong đất, từ đó mà làm tăng khẳ năng hút P của rễ cây

(Khan et al., 2007; Maheshwari, 2013)

d) Khả năng kháng bệnh

Nhiều loại vi sinh vật có khả năng kháng bệnh hại cây trồng bởi một số

cơ chế sau như tạo ra kháng sinh là một chất quan trọng sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật để tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất, giúp cây trồng phát triển Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự

sinh trưởng của vi khuẩn một cách đặc hiệu

Tăng cường sức đề kháng của cây:

Tác dụng của vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR - Plant Growth Promoting Bacteria) là vi khuẩn vùng rễ, sống tự do ở trong đất, tác động trực tiếp hoặc gián tiếp kích thích sinh trưởng bộ rễ và toàn bộ cây trồng

(Mayak et al., 1999) Tác động gián tiếp, khi tương tác với rễ cây thông qua

rất nhiều cơ chế khác nhau tạo ra tính kháng của cây chống lại các tác nhân gây bệnh cây Tác động trực tiếp lên cây trồng như khả năng cố định ni tơ, phân giải lân, sắt, sản sinh ra phytohormone, enzym 1-aminocyclopropane-1-

carboxylate (ACC),… (Glick, 1995; Hayat et al., 2010) Hiện tượng này được

gọi là tính kích kháng hệ thống (ISR - Induced Systemic Resistance), cũng giống như tính kích kháng hệ thống có điều kiện (SAR- Systemic Acquired

Resistance) (Ryu et al., 2005) Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận việc ứng dụng

vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật trong trồng trọt làm tăng sức đề kháng và năng suất của các loại cây trồng khác nhau trong cả điều kiện bình thường và bất lợi

Cơ chế do siderophore:

Siderophore là một loại protein sinh ra trong quá trình sinh trưởng của

vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe+3 trong môi trường với ái lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vi sinh vật, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không có đủ ion Fe+3 cho quá trình sinh trưởng của mình, do đó chúng sẽ

không sinh trưởng được (Sadeghi et al., 2012; Maheshwari, 2013)

1.2 TÌNH HÌNH XÂM NHẬP MẶN TẠI TỈNH BẾN TRE

1.2.1 Đặc điểm đất nhiễm mặn

Đất có thành phần cơ giới nặng, tỷ lệ sét cao (50-60%), đất bí chặt, thấm nước kém, khi khô đất co lại nứt nẻ, khi ướt đất dẻo dính, khó làm đất, vùng rễ cây hoạt động kém Thành phần muối trong đất phổ biến là NaCl (mặn clo), ngoài ra còn có các muối khác như Na2SO3, Na2SO4, Na2CO3 và MgCl2, MgSO4 Các muối này ở nồng độ cao sẽ gây độc cho cây trồng Đất có tính kiềm (pHH2O

> 6), vi sinh vật hoạt động yếu (Hồ Quang Đức và cs., 2010)

Đất bị nhiễm mặn do sự tích tụ quá mức bình thường của các loại muối hòa tan trong đất, dẫn đến áp suất thẩm thấu của dung dịch đất tăng cao, natri trao đổi ở mức độ cao, dẫn đến tính chất vật lý của đất rất xấu, hàm lượng dễ tiêu của một số chất dinh dưỡng cần thiết rất thấp Đất nhiễm mặn làm cho cây trồng bị thiếu dinh dưỡng và nhiễm độc ion, làm cho kết cấu đất bị suy

thoái (Setter et al., 2009)

1.2.2 Nguyên nhân gây mặn

Do hạn hán, mực nước sông thấp, nước biển theo các con sông vào kênh rạch rồi đi vào đồng ruộng gây mặn Mặt khác, những vùng ở xa sông thì do nước ngầm mặn di chuyển tầng đất mặt gây mặn (Hồ Quang Đức và cs., 2010)

Đặc biệt, trong các năm 2004, 2005, 2010 độ mặn 4‰ đã xuất hiện tại Vàm Mơn, cách cửa sông Hàm Luông khoảng 60 km Những năm này, độ mặn 1‰ hầu như xâm nhập toàn bộ tỉnh Bến Tre Nguyên nhân chính ảnh

hưởng đến mức độ xâm nhập mặn là do ảnh hưởng biến đổi khí hậu làm cho dòng chảy cạn trên sông Tiền, ở mức thấp, thủy triều biển Đông lên cao vào những ngày mùa khô Những biến đổi này đã dẫn đến hậu quả nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp Năm 1995 - 2008, hạn hán và xâm nhập mặn gây

ra những thiệt hại 672,305 tỷ đồng Đặc biệt, năm 2010, hạn mặn đã làm thiệt hại và giảm năng suất 1.575 ha lúa, bỏ hoang không sản xuất 4.500 ha, thiệt hại và giảm năng suất 10.162 ha cây ăn quả Tổng giá trị thiệt hại ước khoảng

198 tỉ đồng

Bến Tre là một trong những địa phương bị ảnh hưởng nặng nề nhất bởi mặn xâm nhập Theo số liệu thống kê của Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật các địa phương, tình hình thiệt hại do xâm nhập mặn tính đến tháng 3/2016 trên địa bàn tỉnh Bến Tre bao gồm: Diện tích lúa Đông - Xuân bị thiệt hại 13.844 ha/14.759 ha đã xuống giống chiếm 94% Diện tích hoa màu, rau

bị thiệt hại khoảng 503 ha Diện tích cây ăn quả bị thiệt hại khoảng 1.275 ha (chủ yếu là các loại cây ăn quả có múi như bưởi, chanh, cam, quýt…) Ngày 15/2/2016 Phó Chủ tịch UBND tỉnh Bến Tre đã ký ban hành Quyết định số 294/QĐ-UBND công bố thiên tai xâm nhập mặn năm 2016 trên địa bàn tỉnh Sau Kiên Giang, đây là tỉnh thứ hai ở ĐBSCL công bố thiên tai xâm nhập mặn trong kỳ đại hạn, mặn năm 2016 (Ủy ban Nhân dân tỉnh Bến Tre, 2016)

1.3 NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT CHỊU MẶN, CÓ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT

1.3.1 Khả năng tổng hợp IAA của vi sinh vật

Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA

đã được Jinichiro et al (1991) mô tả chi tiết như sau:

Tryptophan  indole-3-acetamide  IAA

Carreno-López et al (2000) cũng nhận thấy trong các lộ trình tổng hợp IAA ở loài Azospirillum brasilense thì lộ trình indole-3-pyruvic acid vẫn là

con đường chủ yếu để tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan và được xúc tác chủ yếu bởi enzym indole pyruvic decarboxylase

Indole-3-acetic acid (IAA) là một dạng auxin, chất điều hòa sinh trưởng của thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt và chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây

trồng Theo Sergeeva et al (2002), các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi

khuẩn đất, vi khuẩn biểu sinh, vi sinh vật nội sinh và một số vi khuẩn lam đã được phát hiện là có khả năng sinh tổng hợp IAA từ tiền chất L-tryptophan, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng IAA là một trong số những kích thích

tố làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ Nhiều loài vi sinh vật

có khả năng tổng hợp IAA giúp tăng khả năng hấp thu khoáng chất và nước, nhờ đó, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất của cây Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu được điều kiện bất thuận

như nhiễm mặn, phèn, khô hạn (Sadeghi et al., 2012; Maheshwari, 2013)

1.3.2 Nghiên cứu vi sinh vật có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật trên thế giới

Vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật được xem là những công cụ tiềm năng cho sản xuất nông nghiệp bền vững và xu hướng phát triển cho tương lai Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu để tìm hiểu thêm về

sự thích nghi của VSV kích thích sinh trưởng vùng rễ, cơ chế của rễ, các hiệu ứng sinh lý, sinh hóa và sự kích thích tăng trưởng ở những loài này để sản xuất các loại phân bón vi sinh phục vụ cho phát triển nông nghiệp

Xác định và sử dụng các vi sinh vật chịu mặn không chỉ có thể tăng cường khả năng chịu mặn của cây trồng mà còn giảm áp lực lên vùng đất trồng trọt Trong số các vi sinh vật liên quan đến thực vật, vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (Plant growth-promoting rhizobacteria - PGPRs) đã có hiệu quả trong việc cải thiện khả năng chịu stress của thực vật (Etesami & Beattie, 2017; Etesami & Maheshwari, 2018)

Hiệu quả của vi sinh vật hòa tan lân (PSM - phosphate solubilizing

microorganisms) bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các yếu tố môi trường (Yoon et al., 1996; Sánchez-Porro et al., 2009; Walpola & Yoon, 2012) Upadhyay et

al (2009) đã phát hiện ra rằng PGPR làm mất các đặc điểm thúc đẩy tăng

trưởng thực vật (PGR - plant growth regulation) với việc tăng độ muối NaCl trong thí nghiệm Do đó, việc sử dụng vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật ưa mặn hoặc chịu mặn được lựa chọn dựa trên cả khả năng chịu mặn và hiệu quả cao trong việc thể hiện tính trạng PGP có thể thúc đẩy đáng kể khả

năng để trồng cây trong môi trường có độ mặn tự nhiên hoặc gây ra (Zhu et al., 2011)

Có nhiều công trình công bố vi khuẩn Azotobacter chroococum, A vinnel&ii, Azospirillum brasilense, Rhizobium hoặc các chi thuộc Pseudomonas là các vi khuẩn cố định nitơ, ngoài ra người ta còn chứng minh

được rằng ngoài hoạt tính cố định nitơ chúng còn có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật

Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Rhizobacteria thúc đẩy tăng trưởng thực

vật (PGPR) liên quan đến cây chịu mặn (halophytes) và sử dụng làm men vi sinh cho nông nghiệp đất mặn là một thay thế đầy hứa hẹn cho phương pháp

cổ điển Cây chịu mặn thích nghi với môi trường nước muối vì cấu trúc di truyền của chúng Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn liên quan đến tính chịu mặn, trực tiếp và gián tiếp, hỗ trợ sự phát triển và năng suất của cây trong điều kiện nhiễm mặn; do đó, những vi khuẩn này có thể được sử dụng làm chế phẩm sinh học cho cây nhạy cảm với muối (glycophytes) được trồng ở khu vực bị

ảnh hưởng bởi muối để tăng năng suất cây trồng (Alexander et al., 2019)

Các tác giả Nautiyal et al (1999), đã tìm kiếm các vi khuẩn chịu mặn

phân giải phốt phát để sử dụng trong những vùng đất nhiệt đới có nồng độ muối khoảng 2%, pH lên tới 10,5 và nhiệt độ dao động 35oC đến 45oC Các loài vi khuẩn ưa mặn đã được các tác giả phân lập các vùng đất khác nhau Các loài vi sinh vật trên đều có khả năng ưa mặn và phân hủy phốt phát hay

cố định nitơ, tăng sức đề kháng cho cây trồng, qua đó giúp cho cây trồng sinh trưởng và phát triển được trên đất bị nhiễm mặn

Khi đất bị nhiễm mặn, vi khuẩn có lợi trong đất đã thúc đẩy sự phát triển và tăng trưởng của nhiều loài thực vật Các nghiên cứu tác động của vi

khuẩn có lợi trên các cây trồng như cà chua (Mayak et al., 2004), cây đậu xanh, cỏ linh lăng (Medicago sativa), cỏ ống (Salicornia europea), ngô (Zea mays) (Bano & Fatima, 2009) và lúa mì (Triticum aestivum) (Tiwari et al.,

2010) đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

Sử dụng vi sinh vật (như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn) kích thích sinh trưởng ở thực vật (PGPM - plant growth promoting microorganisms) đang là một chiến lược khả thi nhằm giúp cây trồng sinh trưởng phát triển trên các vùng đất bị nhiễm mặn Có tác động hiệu quả rõ rệt đến các chỉ tiêu sinh trưởng như tỷ lệ mọc mầm, khối lượng thân, rễ và năng suất cây trồng

(Gamalero et al., 2009, 2010; Vivekanandan et al., 2015) PGPM kích thích

trực tiếp sự phát triển của thực vật thông qua sự cố định đạm, hòa tan lân khó tan, phân giải kali, sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật, v.v…

Cơ chế tăng trưởng của thực vật trực tiếp thông qua việc hấp thụ kim

loại và các ion trên bề mặt rễ cây cũng đã được báo cáo (Bertrand et al.,

2000) PGPM tác động tốt đến cây trồng một cách gián tiếp, thông qua sự khống chế các vi sinh vật gây bệnh Các cơ chế có thể kể đến là cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh các nguyên tố kẽm, sắt với vi sinh vật gây bệnh; tổng hợp các chất kháng khuẩn; tiết enzym phân hủy màng tế bào nấm hại; sản sinh hydrogen cyanide khống chế nấm gây hại, v.v Bên cạnh đó, PGPM còn đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học thông qua tính kháng hệ thống tạo được (induced systemic resistance, ISR) và tính kháng tập nhiễm hệ thống (systemic acquired resistance, SAR), từ đó làm giảm tác động xấu của mầm bệnh lên sự tăng trưởng của cây ký chủ, giúp cây có thể duy trì và sinh trưởng trong điều kiện đất bị nhiễm mặn

Nhiều kết quả nghiên cứu đều khẳng định phân vi sinh vật phân giải lân làm tăng khả năng hấp thụ lân, kích thích sinh trưởng cây trồng và làm tăng năng suất cây trồng (Gaur, 1990)

Kết quả nghiên cứu của Ponmurugan & Gobi (2006) cho thấy, sử dụng

vi sinh vật phân giải hợp chất lân khó tan làm tăng cường khả năng cố định nitơ sinh học của nhóm vi sinh vật cố định nitơ Sử dụng hỗn hợp vi sinh vật

phân giải quặng lân (Pseudomonas chlororaphis) và vi sinh vật cố định nitơ (Arthrobacter pascens) giúp tăng chiều cao cây, khối lượng thân lá, tăng khả

năng hấp thụ nitơ và lân (Mohammadi, 2012)

Sử dụng vi khuẩn phân giải lân khó tan Pseudomonas sp làm gia tăng

số lượng nốt sần, trọng lượng khô của nốt sần, năng suất của cây đậu tương

(Son et al., 2007) Sử dụng chế phẩm vi sinh vật phân giải hợp chất lân khó

tan làm tăng năng suất cho mía tới 12,6%

Nghiên cứu tại Ấn Độ cho thấy, khi bón 100% lượng phân khoáng nitơ

và lân cho cây dâu tằm kết hợp sử dụng hỗn hợp vi khuẩn phân giải hợp chất

phốt phát khó tan (B megaterium) và vi khuẩn cố định nitơ (A chroococcum) cho năng suất lá dâu tăng 11,45%, đồng thời khả năng hấp thụ

nitơ tăng 20,15%, khả năng hấp thụ lân tăng 15,0% Sử dụng hỗn hợp vi sinh vật trên đồng thời giảm 25% lượng phân bón nitơ và lân, năng suất lá dâu vẫn

tăng 2,4%, khả năng hấp thụ nitơ tăng 10,32% và hấp thu lân tăng 8,16% (Kumar & Nussinov, 1999)

Nghiên cứu của Sharma et al (2013) cho thấy, sử dụng vi sinh vật phân

giải hợp chất lân khó tan kết hợp với vi sinh vật sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật, giảm 50% lượng phân bón chứa lân, không làm ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

Akbari et al (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azospirillum spp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng cây lúa mì Kết quả là sự nhiễm các chủng Azospirillum spp đã làm tăng đường

kính gốc lúa, chiều dài rễ, trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với đối

chứng Naiman et al (2009) đã nghiên cứu gây nhiễm vi khuẩn Azospirillum brasilens và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì Kết quả cho thấy chiều cao

cây tăng 12%, đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16%

Những nghiên cứu trước đây đều tập trung vào các vi khuẩn thuộc chi

Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum có khả năng sinh tổng hợp IAA Sau

này các công trình lại tập trung nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA của

vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas (vi khuẩn ưa khí sử dụng metanol) và Erwinia herbicola, gần đây nhiều nghiên cứu bắt đầu tập trung hơn tới hoạt tính này của vi khuẩn thuộc chi Bacillus (Cassán & Diaz-Zorita, 2016)

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, hầu hết các vi khuẩn vùng rễ là các vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử nên việc bảo quản các chế phẩm

chứa các chủng vi khuẩn tốn kém và ít hiệu quả Các chủng thuộc chi Bacillus

tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngày càng được quan tâm chú ý

nhiều hơn vì chúng sinh bào tử Các chủng vi sinh vật thuộc chi Bacillus

trong chế phẩm được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc có thể tổng hợp được 0,2 - 0,6 µg IAA/ml, 0,3 - 0,5 µg GA3/ml, 0,1 - 0,6 µg zeatin/ml trong môi trường nuôi cấy và làm tăng năng suất cây trồng một cách đáng kể, vi khuẩn

Bacillus firmus có khả năng tổng hợp IAA làm tăng sản lượng cây trồng một

cách ổn định

Datta et al (1982) bằng phương pháp so màu trong môi trường thích hợp, vi khuẩn Rhizobium sp phân lập từ nốt sần của rễ cây đậu Dalbergia sissoo có thể tổng hợp tới 89,5 µg IAA/ml môi trường nuôi cấy

Sandhya et al (2010) đã phân lập được loài vi khuẩn Pseudomonas entomophila trên các loại cây trồng tại các vùng đất khô cằn ở Ấn Độ Qua

nghiên cứu khảo nghiệm thì thấy chủng này có khả năng sản xuất các phytohoocmon (IAA, GA, cytokinin), phân giải phốt phát khó tan, ngoài ra chúng còn có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát sinh học để tạo ra thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả mà không gây ảnh hưởng đến môi trường

Một trong những hướng đi trong chế tạo phân bón vi sinh vật là sử dụng một số loại vi khuẩn tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật liên kết với các vi khuẩn cố định nitơ tự do đã được coi là một trong những lựa chọn có thể thay thế cho phân bón chứa nitơ vô cơ nhằm thúc đẩy tăng trưởng cây trồng và tăng năng suất (Ladha & Reddy, 2000)

1.3.3 Nghiên cứu vi sinh vật có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật ở Việt Nam

Theo Phạm Thanh Hà và Nguyễn Thị Phương Chi (1999), 02 chủng

nấm sợi Aspergillus awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1 có khả

năng phân giải lân khó tan và nguồn dinh dưỡng KNO3, NaNO3 và (NH4)2SO4

là những nguồn nitơ tốt nhất cho môi trường nuôi chủng MN1 để tạo khả năng phân giải lân cao Trong khi đó, đối với chủng ĐT1 thì NH4Cl là nguồn cung cấp nitơ tốt nhất Ngoài tác dụng phân giải lân, các chủng vi sinh vật này còn có khả năng sản sinh ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật hoặc các chất kháng sinh giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài

Tác giả Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thị Mộng Huyền (2015) đã phân lập được 36 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI từ các mẫu rễ cây khoai lang trồng ở huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang Tất cả các dòng vi khuẩn này đều có dạng hình que và có khả năng chuyển động Thực hiện các

phép thử sinh hóa đã xác định được các dòng KL9, KL11, KL39a, KL39b là các vi khuẩn nội sinh có đủ 3 đặc tính tốt là cố định đạm, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA Khi giải trình tự đoạn gen 16S-DNA của 4 dòng vi khuẩn này, nhận diện được dòng KL9 có tỷ lệ đồng hình của đoạn gen 16S-DNA với loài

Burkholderia sprentiae và Burkholderia vietnamiensis là 99%; tỷ lệ đồng hình đoạn gen 16S-DNA của dòng KL39a với loài Burkholderia ambifaria và Burkholderia vietnamiensis là 99%; tỷ lệ đồng hình đoạn gen 16S-rDNA của dòng KL39b với loài Enterobacter ludwigii và Enterobacter cloacae là 99%;

tỷ lệ đồng hình đoạn gen 16SDNA của dòng KL11 với loài loài Klebsiella pneumoniae là 99%

Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Thị Việt (2015) nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Ashby dịch thể bổ sung NaCl ở các nồng độ 0,2‰, 6‰, 12‰, 18‰, 24‰ và 30‰ Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ muối NaCl

có ảnh hưởng khá rõ rệt đến sự tích lũy sinh khối và cố định N-NH4 + của 2

chủng vi khuẩn Đối với chủng P pseudoalcaligenes V94, nồng độ NaCl thích hợp nhất cho sinh trưởng phát triển là 12‰ Đối với chủng K pneumonia V204, nồng độ NaCl thích hợp nhất cho sinh trưởng phát triển là

6‰ Cả 2 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh trưởng phát triển trong phạm vi pH khá rộng (4-8), có khả năng chịu muối NaCl và có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật Đây là ưu điểm nổi trội của chủng giống khi sử dụng làm chế phẩm sinh học dùng cho đất bị nhiễm mặn

Kết quả đánh giá của Lăng Ngọc Dậu và cs (2007) về khả năng tạo

IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum khi tiến hành nuôi cấy chủng vi

khuẩn này trên môi trường NFb có bổ sung tryptophan và theo dõi tại những thời điểm khác nhau cho thấy, tại thời điểm 10 ngày sau khi nuôi cấy thì khả năng tạo IAA là cao nhất

Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phốt phát vô cơ

khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium spp nhận thấy, chủng vi khuẩn này có

khả năng tổng hợp 2 - 10 µg IAA/ml môi trường nuôi cấy Các chủng vi sinh vật kích thích sinh trưởng nội sinh nuôi trong môi trường không chứa tryptophan (môi trường Baz), có khả năng sinh IAA cao nhất ở ngày thứ 2,

đạt 2,98 µg/ml Còn trên môi trường NFb, khả năng sinh IAA của các chủng

vi khuẩn trong nghiên cứu đạt cao nhất ở ngày thứ 4 (3,16 µg IAA/ml)

Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất phân hữu cơ vi sinh cho cây chè ở Yên Bái đã lựa chọn được 3 chủng ST1, ST8 và ST18 có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật cao Sau 3 ngày nuôi cấy, hoạt tính của các chủng vi khuẩn đạt 42,28 - 105,90 IAA µg/ml IAA thô Theo phương pháp phân loại sinh học phân tử, 03 chủng vi khuẩn nói trên có

quan hệ gần gũi với các loài Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus polyfermenticus

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LOÀI VI KHUẨN Achromobacter CÓ HOẠT

TÍNH SINH HỌC

Vi khuẩn thuộc chi Achromobacter được tìm thấy trong đất, nước, có

hình dạng que ngắn, nhuộm gram âm

Loài điển hình: Achromobacter xylosoxidans

Nhiều loài thuộc chi Achromobacter có hoạt tính sinh học quý như phân giải lân, kích thích sinh trưởng thực vật (Ermakova et al., 2017), hoạt

tính hủy hydrocarbon thơm đa vòng (polycyclic aromatic hydrocarbons -

PAHs) (Tiwari et al., 2010)

Loài Achromobacter piechaudii ARV8 có hoạt tính kích thích sinh

trưởng thực vật được phân lập trên đất trồng cây cà chua tại cùng Arava,

Israel (Mayak et al., 2004)

Ở Việt Nam, một số nghiên cứu công bố vi khuẩn Achromobacter sp

có khả năng phân hủy dibenzofuran, hydrocarbon thơm đa vòng, lên men cồn

từ bã mía, kích thích sinh trưởng thực vật (Trần Thị Giang và cs., 2014; Dương Đức Hoàng Sinh và cs., 2018)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Chủng vi khuẩn có khả năng chịu muối NaCl ≥ 1% và có hoạt tính sinh học (kích thích sinh trưởng thực vật)

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp

Thời gian nghiên cứu: tháng 12/2019 - tháng 4 năm 2020

2.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Các mẫu đất trồng cây sầu riêng và bưởi Da xanh thu thập tại tỉnh Bến Tre và một số tỉnh lân cận năm 2017 được lưu trữ tại Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp

- Thiết bị nghiên cứu:

Máy PCR, máy li tâm để bàn, cân điện tử, bể nhiệt, tủ cấy vi sinh

- Dụng cụ nghiên cứu:

Ống đong, bình thuỷ tinh, giấy thấm, …

Dụng cụ khác như găng tay, bút viết, sổ ghi chép,

- Hóa chất dùng trong phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction, PCR): 10x Taq buffer, dNTPs, Taq polymerase (5U/l), nước cất vô

trùng (Invitrogen)

- Đệm CTAB để tách chiết DNA tổng số: 5M NaCl; 0,5M EDTA (pH 8,0); 1M Tris-HCl (pH 8,0); polyvinyl pyrrolidone (MW 40.000); 0,8%

CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide)

- Đệm TE 1x để hòa tan cặn chứa DNA tổng số: 10 mM Tris-HCl (pH

8,0) và 1 mM EDTA (pH 8,0)

- Đệm TAE 1x để chạy điện di: 10 mM Tris-acetate và 0,5 mM EDTA

(pH 7,8)

- Ethidium bromide (EtBr) dùng để nhuộm bản gel: 2 l EtBr (10

mg/ml) trong 100 ml đệm TAE lX

+ Hóa chất: Agar, pepton, glucose, MgSO4.7H2O, K2HPO4.7H2O,

KH2PO4.7H2O, cao nấm men, Ca3(PO4)2,, (NH4)2SO4, KCl, MnSO4, FeSO4, mật rỉ đường, tinh bột tan, KNO3, NaCl

- Một số dụng cụ trang thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp

 Môi trường nghiên cứu:

- Môi trường Ashby:

K2HPO4.7H2O : 3,0 g

KH2PO4.7H2O : 3,0 g Cao nấm men : 1,0 g

2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn được NaCl ≥ 1%, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật

- Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn chịu mặn được NaCl ≥ 1%, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật:

+ Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật truyền thống

+ Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Xác định một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn chịu mặn được NaCl ≥ 1%, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật đã tuyển chọn:

+ Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

+ Ảnh hưởng của pH môi trường

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5.1 Phương pháp phân lập, tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật

Thu thập mẫu đất trồng cây sầu riêng, bưởi Da xanh ở tỉnh Bến Tre đã

bị ảnh hưởng của xâm nhập mặn Mẫu đất được lấy ở độ sâu tầng đất 0-30

cm, 0,5 kg đất/mẫu, cho vào lọ nhựa sạch, ghi thông tin mẫu thu thập

Cân 1 g đất rồi pha loãng với nước cất cho đến khi dung dịch có nồng

độ pha loãng từ 10-3 đến 10-6 rồi nhỏ 0,1 ml dung dịch sang đĩa petri chứa môi trường đặc hiệu là Ashby đã bổ sung thêm muối NaCl 1% vào trong môi trường phân lập

Dùng que cấy vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ 30°C từ 4 - 7 ngày Sau đó, chủng vi sinh vật được cấy chuyển sang các đĩa petri chứa môi trường Ashby khác để làm thuần

2.5.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật của vi khuẩn chịu mặn được nồng độ muối NaCl ≥ 1%

Theo tiêu chuẩn TCVN 10784:2015 (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2015)

2.5.2.1 Phương pháp xác định định tính

Các chủng vi khuẩn sau khi làm thuần được nuôi cấy trên môi trường

LB (Luria-Bertani medium) không có agar, có bổ sung 0,1% tryptophan ở

28oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trên máy lắc ổn nhiệt trong thời gian 2 ngày

Sau 2 ngày nuôi cấy, ly tâm ống nghiệm nuôi dịch vi khuẩn ở tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn Thu lấy dịch trên tủa Lấy dịch

đã ly tâm pha với thuốc thử Salkowski với hàm lượng 2 ml dịch với 8 ml thuốc thử Salkowski (Gordon & Weber, 1951)

Chỉ tiêu đánh giá:

+: phản ứng với thuốc thử Salkowski (có phản ứng tạo màu);

– : không phản ứng với thuốc thử Salkowski (không phản ứng

tạo màu)

Nếu thấy dịch đổi màu đỏ, hồng, hồng nhạt do IAA thô đã được sinh ra trong môi trường nuôi cấy

2.5.2.2 Phương pháp xác định định lượng IAA

Các chủng vi khuẩn sau khi làm thuần được nuôi cấy trên môi trường

LB (Luria-Bertani medium) không có agar, có bổ sung 0,1% tryptophan Nuôi lắc trên máy lắc ổn nhiệt ở điều kiện nhiệt độ ở 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong thời gian 48 giờ

Sau 48 giờ nuôi cấy, ly tâm ống nghiệm nuôi lắc vi khuẩn ở trên bằng máy ly tâm để bàn tốc độ 5.000 vòng/phút trong 7 phút để loại bỏ cặn Thu dịch trên tủa Lấy dịch đã ly tâm pha với thuốc thử Salkowski với hàm lượng

2 ml dịch nuôi cấy đã li tâm với 8 ml thuốc thử Salkowski

Đối chứng là 2 ml dịch thể không nuôi cấy vi khuẩn đã ly tâm với 8 ml thuốc thử Salkowski

Lấy dịch đã ly tâm pha với thuốc thử hàm lượng (1 ml dịch với 4 ml thuốc thử Salkowski), đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 530 nm Chỉ số

OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuôi cấy (Glickmann & Dessaux, 1995)

Thí nghiệm được lặp lại 3 ống nuôi cấy

Chỉ tiêu đánh giá:

- Hàm lượng IAA thô có trong môi trường (µg/ml)

2.5.3 Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn

2.5.3.1 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật truyền thống

Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá và khoá phân loại của Bergey (Niall & Paul, 2009)

a) Xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá

Đặc điểm khuẩn lạc, khả năng hình thành bào tử, phản ứng catalase, nhu cầu oxy, các đặc điểm sinh hoá được thực hiện theo các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học thông thường

* Mô tả đặc điểm khuẩn lạc:

- Đo kích thước khuẩn lạc

- Mô tả hình thái khuẩn lạc, bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng,

độ nổi, dạng bìa khuẩn lạc

* Mô tả một số đặc điểm tế bào:

- Quan sát hình thái và khả năng chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép (Nguyễn Thành Đạt, 2007)

- Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame sạch

- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame sạch

- Đậy lamen lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí

- Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 - 1.000 lần

b) Xác định khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon

Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường cơ bản LB (dạng dịch thể) ở điều kiện 2, thay thế các nguồn hydrat cacbon khác nhau Dựa vào sự chuyển biến màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng dương tính hay âm tính

c) Khả năng thủy phân tinh bột của chủng vi sinh vật

Thu enzym từ môi trường lỏng: chủng vi sinh vật sau khi được nuôi trên môi trường LB không có agar Lắc ở tốc độ 110 vòng/phút trong vòng 2 ngày Sau đó, dịch thể được ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzym thô

2.5.3.2 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử a) Phương pháp tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn

DNA tổng số của chủng vi khuẩn chịu mặn được chiết bằng phương pháp CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987)

Các bước thực hiện như sau:

- Bước 1: Ngay trước khi chiết, ủ đệm chiết CTAB có bổ sung -ME (mercapto ethanol) với tỷ lệ 1 ml đệm CTAB/10 μL -ME trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 30 phút;

- Bước 2: Dùng tăm nhọn vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt đĩa nuôi cấy (phần ngoài rìa) và cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml Lượng khuẩn lạc vi

khuẩn lấy khoảng 100 mg;

- Bước 3: Cho 0,5 ml đệm CTAB đã ủ ở trên vào ống eppendorf chứa khuẩn lạc của vi khuẩn Dùng chày nhựa chuyên dụng nghiền nhuyễn mẫu Ủ ống ở 65oC trong 10 - 30 phút ở bể nhiệt;

- Bước 4: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa

(khoảng 450 μl) cho vào ống eppendorf mới;

- Bước 5: Cho chloroform: isoamylalcolhol (24 :1) vào ống với tỷ lệ thể

tích tương đương Đảo đều ống;

- Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa

- Bước 9: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ dịch phía

trên, thu lấy cặn có chứa DNA tổng số;

- Bước 10: Rửa cặn bằng ethanol 70% hai lần (mỗi lần từ 0,7-1 ml);

- Bước 11: Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp ống, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút ở trong buồng cấy DNA tổng số được hòa trong 50 μl đệm TE và bảo quản ở điều kiện  20°C trong tủ lạnh sâu

b) Cặp mồi sử dụng và phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi 27F (5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’ TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) để nhân gen mã hóa 16S DNA ribosome của vi khuẩn chịu được nồng độ muối NaCl ≥ 1%, có hoạt

tính kích thích sinh trưởng thực vật (Weisburg et al., 1991)

Cho vào mỗi ống PCR loại 0,5 ml, tổng thể tích phản ứng là 25 µl, trong đó có chứa 2,5 µl đệm PCR; 0,5 µl DNA tổng số; 0,5 µl dNTPs; 1 µl mỗi loại mồi và 0,2 µl Taq polymerase

Cho các ống vào máy PCR và thực hiện phản ứng PCR với điều kiện phản ứng sau:

Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0,5 mg/ml ethidium bromide

c) Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự

Sản phẩm PCR được tinh sạch dùng PureLinkTM quick gel extraction kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Các bước thực hiện như sau:

i) Sau khi chạy điện di, dùng dao cắt phần gel agarose chứa sản phẩm PCR Lượng gel cắt được cân (thường xấp xỉ 200 mg);

ii) Cho 600 µl đệm GS1 vào tuýp đựng gel chứa DNA, ủ tuýp ở 50oC trong thời gian 10 phút trong bể nhiệt Lắc tuýp để đảm bảo tan gel;

iii) Cho toàn bộ dịch vào cột chứa màng liên kết DNA Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột;

iv) Cho 600 µl đệm GS1 vào cột để hoà tan gel còn sót Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột;

v) Cho 700 µl đệm rửa GS2 đã vào cột và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột Ly tâm lại một lần nữa trong 2 phút để đảm bảo loại bỏ hết cồn;

vi) Cho cột sang 1 tuýp mới Cho 30-50 µl nước cất sạch vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút Loại bỏ cột và thu dịch DNA tinh khiết trong tuýp

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được ước lượng nồng độ trên bản điện di agarose và được giải trình tự trực tiếp với bộ mồi dùng trong phản ứng PCR

Gửi mẫu giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc)

d) Phương pháp phân tích trình tự sản phẩm PCR

Trình tự nucleotide của các mẫu vi khuẩn được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)

Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu trên Ngân hàng Gen (GenBank) bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (National Center for Biotechnology Information, Hoa Kỳ)

Phân tích trình tự và phân tích phả hệ được thực hiện với các phần mềm BioEdit 7.0, ClustalX 1.83 và MEGA 6.0

e) Phương pháp phân tích phả hệ

Trình tự nucleotide vùng gen 16S rRNA của vi khuẩn có khả năng chịu mặn, có hoạt tính sinh học sẵn có trên Ngân hàng Gen cũng được sử dụng trong phân tích làm mẫu tham khảo (mẫu phân tích phả hệ ở trong phần phụ lục)

Trước khi phân tích phả hệ, các trình tự nucleotide được căn trình tự đa

chuỗi bằng phần mềm BioEdit 7.0 (Hall, 1999), ClustalW2 (McWilliam et al.,

2013) và dùng chương trình trực tuyến (BLAST) để tìm kiếm các chuỗi nucleotide tương đồng có sẵn trên Ngân hàng Gen (GenBank) của Trung tâm Thông tin công nghệ quốc gia Hoa Kỳ

Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining với khoảng cách di truyền giữa các chuỗi được xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura 2 tham số, giá trị thống kê bằng kỹ thuật bootstrap (%) với 1.000

lần lặp lại trong phần mềm MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011)

2.5.4 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn

2.5.4.1 Phương pháp đánh giá khả năng chịu mặn của chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn chịu mặn, có hoạt tính sinh học được nuôi cấy trên môi trường Ashby ở các ngưỡng pH khác nhau và được đặt ở ngưỡng nhiệt độ

30oC ± 2oC Các công thức thí nghiệm bao gồm: