Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng phục vụ chăn nuôi lợn

Đề tài nghiên cứu nhằm tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus spp. sinh celllase và các enzym ngoại bào cao; tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao; tuyển chọn các chủng nấm men tích lũy protein đơn bào cao;... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Phí Quyết Tiến

Hà Nội - 2019

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn là do sự tìm tòi, học hỏi của bản

thân và sự hướng dẫn tận tình của PGS TS Phí Quyết Tiến và các đồng nghiệp tại

Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Bộ môn Dinh dưỡng động vật – Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mọi kết quả nghiên cứu cũng như ý tưởng của tác giả khác, nếu có đều được trích dẫn cụ thể Đề tài luận văn này cho đến nay chưa được bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chưa hề được công bố trên bất kỳ một phương tiện nào Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Người cam đoan

Nguyễn Văn Thế

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Phí Quyết Tiến đã trực tiếp

định hướng, tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn sự động viên giúp đỡ chỉ bảo tận tình của các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, đã tạo hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn TS Trần Hiệp giảng viên Bộ môn Dinh dưỡng động vật –

Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trong gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo cùng các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biêt ơn đến gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp những người đã luôn động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học này

Học viên

Nguyễn Văn Thế

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

polymerase)

Danh mục các Bảng

Bảng 2.1 Thành phần hóa hóa học của các nguyên liệu thức ăn 24

Bảng 2.2 Thành phần nguyên liệu thí nghiệm lên men thức ăn thô xanh kết hợp với một số nguồn dinh dưỡng khác 24

Bảng 3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 38 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 26

Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải CaCO 3 trên môi trường MRS (bổ sung 1% CaCO 3 ) của 24 chủng vi khuẩn lactic 29

Bảng 3.3 Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 31

Bảng 3.4 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng tuyển chọn 32

Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái của 14 chủng nấm men sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 3.6 Kết quả sàng lọc của 03 chủng vi khuẩn và 01 nấm men được tuyển chọn 36

Bảng 3.7 Đặc điểm sinh học của 04 chủng vi sinh vật được tuyển chọn 37

Bảng 3.8 So sánh trình tự gen 16S rDNA và vùng ITS4 của các chủng VSV tuyển chọn 39

Bảng 3.9 Giá trị dinh dưỡng của khẩu phần ăn cho lợn sau 120 giờ lên men với các tỷ lệ phối trộn chế phẩm vi sinh khác nhau 45

Danh mục Hình ảnh

Hình 2.1 Đường chuẩn axit lactic 17

Hình 3.1 Hoạt tính xylanase (A) và cellulase (B) trên môi trường có cơ

chất của hai chủng đại diện VTX16 và VTX18 27Hình 3.2 Hoạt tính cellulase của 26 chủng vi khuẩn được tuyển chọn 28

Hình 3.3 Đặc tính phân giải CaCO3 trên môi trường MRS của một số

chủng vi khuẩn lactic đại diện trong nghiên cứu 28

Hình 3.4 Phản ứng với thuốc thử Uphenmen của một số chủng vi khuẩn

lactic đại diện 29Hình 3.5 Hàm lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic 30Hình 3.6 Hình thái tế bào của một số chủng nấm men đặc trưng 34

Hình 3.7 Khối lượng sinh khối khô và hàm lượng protein thô của các

chủng nấm men 35Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene mã hóa 16S rRNA

của 03 chủng vi khuẩn tuyển chọn 39

Hình 3.9 Khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng vi khuẩn

tuyển chọn sau 3h ủ 42

Hình 3.10 Động học quá trình lên men của chủng B subtilis VTX16 (A)

và B licheniformis VTX18 (B) trên quy mô 5 L/mẻ 43 Hình 3.11 Động học quá trình lên men của chủng L plantarum LTX28

trên quy mô 5 L/mẻ 44

Hình 3.12 Động học quá trình lên men của chủng S cerevisiae MTX14

trên quy mô 5 L/mẻ 44

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt iii

Danh mục các Bảng iv

Danh mục hình ảnh v

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 THỨC ĂN THÔ XANH VÀ LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG CHO CHĂN NUÔI LỢN 3

1.1.1 Nguồn thức ăn thô xanh phù hợp sử dụng lên men thức ăn cho lợn 3

1.1.2 Yêu cầu chung của một số nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng 4

1.1.3 Một số đặc điểm của thức ăn thô xanh lên men dạng lỏng 5

1.2 ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ NHÓM VI SINH VẬT SỬ DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG 6

1.2.1 Vi sinh vật lên men lactic 6

1.2.2 Vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào 7

1.2.3 Nấm men tích lũy protein đơn bào 8

1.2.4 Yêu cầu về an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong chăn nuôi 9

1.2.5 Một số đặc tính sinh học của nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn chăn nuôi 9

1.3 HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG 11

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM VI SINH TRONG LÊN MEN THỨC ĂN CHO LỢN VIỆT NAM 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 15

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 15

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 15

2.1.3 Môi trường nghiên cứu 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Phương pháp phân tích hóa sinh 16

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử 20

2.2.3 Lên men vi sinh vật tạo chế phẩm và phối trộn thức ăn thô xanh lên men 22

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH CELLLASE VÀ CÁC ENZYM NGOẠI BÀO CAO 26

3.1.1 Sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 26

3.1.2 Xác định hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 27

3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO 28

3.2.1 Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit tổng số cao 28

3.2.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit lactic cao 29

3.2.3 Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic 30

3.3 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH CỦA CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN 32

3.4 TUYỂN CHỌN NẤM MEN TÍCH LŨY PROTEIN ĐƠN BÀO 33

3.4.1 Đặc điểm hình thái, tế bào của các chủng nấm men 33

3.4.2 Tuyển chọn chủng nấm men tích lũy protein đơn bào cao 35

3.5 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG ĐƯỢC TUYỂN CHỌN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 37

3.5.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng VSV được tuyển chọn 37

3.5.2 Phân loại các chủng VSV được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử 38

3.5.3 Khảo sát khả năng chịu muối mật và pH axit của các chủng tuyển chọn 41

3.6 NGHIÊN CỨU THU HỒI VÀ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH 42

3.6.1 Nghiên cứu thu hồi sinh khối các chủng được tuyển chọn và tạo chế phẩm vi sinh 42

3.6.2 Tạo chế phẩm vi sinh ứng dụng cho lên men thức ăn thô xanh 44

3.7 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH CHO LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG 45

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 56

MỞ ĐẦU

Theo báo cáo của Cục Chăn nuôi, nước ta hiện có đàn lợn khoảng 29 triệu con, đứng đầu ASEAN, đứng thứ 2 ở châu Á và nằm trong nhóm 15 nước có đàn lợn lớn nhất thế giới Tốc độ tăng trưởng đàn lợn trong giai đoạn 2007 –

2017 đạt trung bình 0,91%/năm Sản lượng thịt lợn trong năm 2016 đạt mức kỷ lục 3,36 tấn, tăng 5% so với năm 2015 và đứng thứ 7 trên thế giới sau Trung Quốc, Mỹ, Đức, Tây Ban Nha, Brazil và Nga Lợn thịt xẻ chính ngạch mới được xuất sang thị trường Hong Kong và Malaysia khoảng 15-20 ngàn tấn (tương đương 200.000 con) trong giai đoạn từ năm 2013 - 2016 Các số liệu thống kê trên cho thấy, tình hình xuất khẩu thịt lợn Việt Nam hoàn toàn không tương xứng với năng lực sản xuất trong nước Nguyên nhân chính thịt lợn Việt Nam không thể cạnh tranh với thịt lợn xuất khẩu của các nước do giá thành sản xuất cao, phụ thuộc vào thức ăn công nghiệp, chất lượng thịt không bảo đảm, dư lượng kháng sinh vượt ngưỡng cho phép Năm 2017 đặc biệt khó khăn với ngành chăn nuôi Việt Nam khi việc xuất lợn hơi theo đường tiểu ngạch giảm mạnh do nhu cầu thịt lợn của Trung Quốc sụt giảm, chi phí chăn nuôi lợn cao hơn giá bán, nguồn cung cao hơn cầu dẫn tới nhiều chuồng trại chăn nuôi lợn bỏ trống

Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi phí và là yếu tố chính quyết định chất lượng, giá thành sản phẩm Năm 2017, Việt Nam nhập khẩu 1,5 triệu tấn thức ăn chăn nuôi thành phẩm từ nước ngoài, và nhập khẩu 16,3 triệu tấn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi trong khi nguồn nguyên liệu nội địa chỉ đáp ứng 16,3 triệu tấn Như vậy ngành chăn nuôi trong nước thực tế đang mang lợi nhuận chủ yếu cho các công ty sản xuất thức ăn Đây cũng là lý do giá thịt lợn sản xuất trong nước cao và dự kiến hạn chế lợi thế cạnh tranh với sản phẩm nhập khẩu khi Hiệp định Đối tác xuyên Thái Bình Dương (TPP) được thực hiện

Ở các nước nhiệt đới, việc sử dụng thức ăn thô xanh trong chăn nuôi lợn ngày càng phát triển so với hệ thống chăn nuôi thâm canh do giảm chi phí đầu vào Một số nghiên cứu công bố lên men thức ăn thô xanh sẽ nâng cao được hàm lượng protein của thức ăn giàu xơ nhờ tăng sinh khối nấm men Manivanh và Preston (2015) công bố lên men thân cây chuối và dọc khoai nước đã cải thiện được lượng protein thu nhận được và tốc độ tăng trọng ở lợn

Để nâng cao được dinh dưỡng của các loại thức ăn thô xanh đáp ứng nhu cầu phát triển chăn nuôi thâm canh, cần thiết phải áp dụng đồng thời công nghệ

chế biến và lên men thích hợp Để hạ giá thành thức ăn chăn nuôi, tăng tỷ lệ chất

xơ cần sử dụng, một số nghiên cứu đã sử dụng vật liệu thô xanh như bã sắn, bã rong riềng, thân/vỏ chuối, bèo tây, cỏ voi… để thay thế một phần ngũ cốc Theo một số nghiên cứu, trong các mẻ lên men thì hỗn hợp thức ăn có thành phần dinh dưỡng cân đối kết hợp với nước sẽ tạo ra hỗn hợp thức ăn lỏng (Liquid Feed, LF) cho lợn và không cần sử dụng thêm các loại thức ăn bổ sung

(Scholten et al., 2002) Ưu điểm của quá trình lên men thức ăn này là dễ dàng

kiểm soát và giúp cho thức ăn không bị hỏng nhờ quá trình lên men lactic, thời gian lên men không dài và tạo ra loại LF có chất lượng tốt

Nhóm vi sinh vật (VSV) chủ yếu sử dụng trong công nghệ trên gồm nấm

men Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp., Lactobacillus spp Chất lượng của

thức ăn được lên men tự nhiên có thể được cải thiện bằng cách bổ sung các loại

vi khuẩn lactic (Lactobacillus plantarum và Pediococcus spp.), nấm men và vi

sinh vật khác vào môi trường lên men đồng thời giúp giảm pH của thức ăn, tăng

lượng axit lactic giúp bảo quản thức ăn (Scholten et al., 2002) Do tầm quan

trọng và tiềm năng sử dụng vi sinh vật cho lên men thức ăn thô xanh cho chăn

nuôi lợn, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng phục vụ chăn nuôi lợn” với mục tiêu tuyển chọn các VSV phù hợp cho việc tạo chế phẩm để lên

men chế biến thức ăn thô xanh (TATX) dạng lỏng cho chăn nuôi lợn, với các nội dung chính sau đây:

1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus spp sinh celllase và các

enzym ngoại bào cao;

2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao;

3 Tuyển chọn các chủng nấm men tích lũy protein đơn bào cao;

4 Đánh giá đặc tính ức chế vi sinh vật gây bệnh, chịu muối mật, kháng kháng sinh của các chủng tuyển chọn;

5 Nghiên cứu lên men, thu hồi sinh khối VSV và tạo chế phẩm vi sinh;

6 Bước đầu ứng dụng chế phẩm vi sinh cho lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỨC ĂN THÔ XANH VÀ LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG

LỎNG CHO CHĂN NUÔI LỢN

1.1.1 Nguồn thức ăn thô xanh phù hợp sử dụng lên men thức ăn cho lợn

Thức ăn thô xanh ở nước ta rất đa dạng và phong phú, bao gồm thân lá của cây, cỏ trồng hoặc mọc tự nhiên, sinh trưởng trên cạn hoặc dưới nước, đây

là nguồn cung cấp thức ăn quan trọng cho gia súc ở nước ta Thức ăn thô xanh chứa hầu hết các chất dinh dưỡng cần thiết cho vật nuôi, phần lớn giàu protein, các vitamin, khoáng đa lượng, vi lượng cần thiết Cỏ Voi được sử dụng làm thức

ăn thô xanh do năng suất thu hoạch cỏ cao, năng suất từ 100-300 tấn/ha/năm và

có thể lên đến 500 tấn/ha/năm Sau khi trồng 3 tháng có thể thu lứa đầu, sau đó 40-45 ngày thì cắt lần tiếp theo Ở Việt Nam thời điểm cắt tốt nhất là 80 ngày (cao 80-100 cm) Giá trị dinh dưỡng của cỏ voi bao gồm 20% vật chất khô, trong đó có 9% protein thô, 28,6% xơ thô, 14,8% khoáng, 1,1% NN và 46,5% NFE so với vật chất khô (Gohl 1975) Tại các vùng nông thôn bèo tây từ lâu đã được tận dụng làm thức ăn để chăn nuôi lợn Bèo tây tồn tại tự nhiên ở các mặt nước ao, hồ, đầm Bèo tây có hàm lượng chất khô thấp (6 – 7%) nhiều xơ (trên

200 g/kg chất khô), giàu khoáng 180 – 190 g/kg chất khô và giá trị năng lượng thấp (1800 – 1900 Kcal/kg chất khô; hay 7,6 – 8,0 MJ/kg chất khô) Cây rau muống là thực vật có tốc độ sinh trưởng nhanh trong mùa mưa, kém chịu lạnh, được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi lợn Hàm lượng chất khô ở rau muống trung bình 100 g/kg rau tươi Trong 1 kg chất khô có 2450 – 2500 kcal (10,3 – 10,5 MJ) năng lượng trao đổi là 170 – 250 g protein thô, 130 – 200 g đường, 100 – 115 g khoáng tổng số Rau muống dùng làm thức ăn xanh cho lợn rất tốt, thích hợp với các mô hình chăn nuôi nông hộ Cây khoai lang ngoài mục đích trồng

để lấy củ là chính còn có mục đích trồng để cung cấp thức ăn thô xanh cho vật nuôi Khoai lang nếu được chăm sóc tốt có khả năng tái sinh nhanh, thu cắt được nhiều lần trong năm và cho năng suất cao Giá trị dinh dưỡng của thân lá khoai lang khi thu hoạch non sẽ đạt mức khá Protein trong thân lá đạt trung bình khoảng 15 – 16% vật chất khô, xơ thô khoảng 16 – 17%, đây là nguồn thức ăn rất tốt cho gia súc dạ dày đơn (Điền Văn Hưng 1975)

Với ưu thế là một nước nhiệt đới quanh năm cây trái xanh tốt, ngành chăn nuôi Việt Nam luôn sẵn có nguồn nguyên liệu phong phú Song song với nguồn

thức ăn xanh phong phú và đa dạng là nguồn phụ phẩm công, nông nghiệp cũng rất dồi dào như: bã bia (vật chất khô (92,5-93%), protein thô (23,5-27%), lipit (6,2-6,5%), xơ thô (14,0-15,5%), khoáng (3,7-4%)), bã sắn (hàm lượng tinh bột

từ 8%, xơ chiếm khoảng 15 - 20%), rất phù hợp làm nguyên liệu chế biến thức

ăn gia súc nhưng lại nghèo chất đạm) và bã dong riềng (hàm lượng protein thô của bã dong riềng ướt là 0,9%, bã dong riềng khô là 3,45%, hàm lượng lipid thô

là 0,1% ở bã dong riềng ướt, 1% ở bã dong riềng khô và tỉ lệ xơ trong bã ướt và

bã khô lần lượt là 2,7% và 8,28%) (Điền Văn Hưng 1975)

1.1.2 Yêu cầu chung của một số nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng

Mật độ VSV trong thức ăn lên men dạng lỏng (Fermented Liquid Feed, FLF) thông thường đạt 106 - 107 CFU/ml (Royer et al., 2003) Lên men thức ăn

cho lợn hoàn chỉnh thường thông qua 3 pha: Pha 1 là trộn nguyên liệu với nước

pH > 6, thời điểm này cho phép sự tăng nhanh của trực khuẩn đường ruột; Pha 2

là sau lên men thức ăn, pH xuống ~ 4.0 giúp hạn chế sự phát triển của các vi

khuẩn thuộc chi Enterobacteriaceae và các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác;

Pha 3 quần thể LAB giúp ổn định pH, mật độ nấm men trong thức ăn tiếp tục tăng nhờ sử dụng các nguồn protein trong nguyên liệu thô xanh giúp thức ăn ổn định và tăng cường hàm lượng protein nấm men đơn bào trong thức ăn (Odunfa,

Oyeyiola 1985, Russell et al., 1996) Năm 2010, đã tìm thấy 146 chủng vi khuẩn

có khả năng kiểm soát Salmonella có trong FLF Vi khuẩn LAB thường được sử dụng trong sản xuất FLF là Lactobacillus plantarum và Pediococcus spp (Missotten et al., 2010)

Đa dạng nấm men trong FLF khá cao và đã được công bố trong một số nghiên cứu Tại Châu Âu, khi lên men sản xuất FLF từ ngũ cốc, phế phụ phẩm nông nghiệp các loài nấm men chủ yếu được phân lập và bổ sung vào mẻ lên

men sau chủ yếu gồm các loài Pichia galeiformis, P membranifaciens và P anomala Trong một vài nghiên cứu khác, nấm men chủ yếu sử dụng là P fermentans Tuy nhiên, một số nghiên cứu tại Châu Á sản xuất FLF từ nguyên liệu thức ăn thô xanh sử dụng chủ yếu Candida milleri (60%), Kazachstania bulderi (20%), Saccharomyces cerevisiae (20%) Đối với vi sinh vật phân giải chất xơ, vi khuẩn thuộc chi Bacillus, chủ yếu là Bacillus subtilis, B licheniformis, B amyloliquefaciens được sử dụng Nhóm vi khuẩn này vừa có

hoạt tính phân giải chất xơ, giàu enzyme thủy phân và có hoạt tính probiotic

(Gori et al., 2011)

Năm 2002 sử dụng hai chế phẩm: chất A có L plantarum và Enterococcus faccium và chất B là L plantarum và Bacillus subtilis để ủ chua

cây cao lương tại Trung Quốc cho thấy tác dung rõ rệt khi ủ đơn chủng, cụ thể là

làm giảm nhanh độ pH, tăng hàm lượng axit lactic (Wutai et al., 2002) Dùng probiotic cho lợn với L acidophilus (lô 1), Streptococcus faecium (lô 2), hoặc phối hợp giữa L acidophilus với S faecium (lô 3), hoặc giữa L acidophilus với

S faecium, L casei, LactoBacillus fermentum và L plantarum (lô 4) Để kiểm tra sự tồn tại trong hệ tiêu hóa của lợn của VK E coli Q157, ông đã trộn các VK

trên với liều 6 x l06 CFU/kg thức ăn liên tục trong 7 tuần Kết quả cho thấy lô 4

có sự tồn tại trong hệ tiêu hóa của lợn của VK E coli trong phân cao hơn các lô

khác Khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng

probiotic (Lema et al., 2001) Đã sử dụng 2 chủng L plantarum và L acidophilus được phân lập từ ruột lợn để sử dụng làm chế phẩm probiotic (Balasingham et al., 2017) Nghiên cứu sự ảnh hưởng của VK probiotic L reuteri ZJ625, L reuteri VB4, L salivarius ZJ614 và Streptococcus salivarius

NBRC13956 trong chăn nuôi lợn Kết quả cho thấy khi sử dụng các chủng VK

này đã làm giảm hiệu chứng tiêu chảy của lợn sau cai sữa (Dlamini et al., 2017)

1.1.3 Một số đặc điểm của thức ăn thô xanh lên men dạng lỏng

Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của thức ăn lỏng lên men Các yếu

tố ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm cuối cùng bao gồm các loại VSV ban đầu, số lượng và chất lượng cơ chất cũng như các thông số lên men khác nhau

Số lượng vi khuẩn lactic (LAB) có mặt thực tế trong thức ăn chăn nuôi hoặc số lượng LAB được thêm vào quyết định đến mức độ sản sinh axit lactic Số lượng LAB nhiều sẽ làm sự sản sinh vi khuẩn lactic diễn ra nhanh hơn so với quá trình

sản sinh các vi khuẩn gây bệnh như Salmonella hoặc E coli (Missotten et al.,

2010, Missotten et al., 2015) Thành phần các loài vi khuẩn trong lên men thức

ăn chăn nuôi dạng lỏng thay đổi trong suốt quá trình lên men, họ chỉ ra rằng

Pediococus pentosaceus có mật độ chủ yếu khi bắt đầu xảy ra sự lên men, nhưng sau 3 ngày, LactoBacillus plantarum trở thành loài có mật độ chủ yếu (Olstorpe et al., 2008)

Sự phân bố và có mặt của nấm men cũng làm ảnh hưởng đến chất lượng của thức ăn lên men cả tích cực và tiêu cực Nấm men có khả năng gắn kết các

vi khuẩn có trong ruột trên bề mặt của chúng, bằng cách gây trở ngại trong gắn kết các vi khuẩn này với biểu mô ruột Do đó, nồng độ nấm men cao trong thức

ăn chăn nuôi lên men dạng lỏng sẽ làm giảm các bệnh về đường tiêu hóa

Các thông số khác như nhiệt độ lên men, pH, tỷ lệ nước trong thức ăn cũng có thể ảnh hưởng đến các đặc điểm của thức ăn chăn nuôi lên men dạng lỏng Một số nghiên cứu báo cáo rằng nên lên men thức ăn chăn nuôi ở nhiệt độ

ít nhất là 20°C với pH < 4.5 vì các nguồn bệnh từ ruột như E coli và Salmonella

không chịu được giá trị pH < 4.5 (Jensen 1998) Trong nghiên cứu về ảnh hưởng

của nhiệt độ lên men đến sự loại trừ Salmonella, kết quả cho thấy thời gian yêu

cầu để hạn chế các vi khuẩn này ở 30oC ngắn hơn nhiều so với ở 20oC Do đó,

dù nhiệt độ tối thiểu được lựa chọn tối ưu cho lên men thức ăn chăn nuôi dạng lỏng là 20oC thì ở nhiệt độ 30oC vẫn thích hợp hơn cho phép sản sinh axit lactic nhanh hơn và sự loại trừ các nguồn bệnh liên quan đến ruột cũng diễn ra nhanh hơn (Jensen 1998)

Lượng nước trong quá trình ủ men cũng ảnh hưởng đến chất lượng thức

ăn lên men Tỷ lệ nước trong thức ăn thường được sử dụng cho sản xuất thức ăn dạng lỏng hoặc lên men thức ăn dạng lỏng có thể dao động giữa 1:1,5 và 1:4,0

(Missotten et al., 2010, Missotten et al., 2015)

1.2 ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ NHÓM VI SINH

VẬT SỬ DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG

1.2.1 Vi sinh vật lên men lactic

Trong quá trình lên men, VK lactic sinh ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic

và ức chế sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm

pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm ngưng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với axit lactic, loại trừ những VSV gây hại trong đường ruột

Chẳng hạn như các VSV gây bệnh như E coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella Typhimurium, Salmonella cholerasuis (gây sốt thương

hàn),… (Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo 1996, Kiều Hữu Ảnh 1999)

1.2.2 Vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào

Đối với vi sinh vật phân giải chất xơ, vi khuẩn thuộc chi Bacillus có hoạt tính phân giải chất xơ, giàu enzyme thủy phân và có hoạt tính probiotic (Gori et al., 2011) là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus Nhiều loài VK cũng có

khả năng này nhưng số lượng và thành phần các loại enzyme không đầy đủ, chủ

yếu chỉ sinh endoglucanase Riêng Bacillus là chi sinh cellulose khá cao, chúng

chủ yếu được phân lập từ đất vườn nơi có nguồn xác bã hữu cơ (rơm, rạ, mụn

dừa, ) dồi dào Ví dụ như, cellulase từ B subtilis (Gori et al., 2011) … Đặc biệt

là đối với một số vật nuôi ăn thực vật thì hệ vi khuẩn đường ruột như Bacillus, PaeniBacillus… có khả năng phân hủy cellulose rất tốt (Schwarz et al., 2001)

Rút ngắn thời gian phân hủy thức ăn thô xanh

Các chủng Bacillus spp., có vai trò quan trọng nhờ khả năng tổng hợp

nhiều sản phẩm thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và đặc

biệt là enzyme, (Smith et al., 2000) Bacillus có thể tiết ra hoạt tính cao của nhiều loại enzyme như protease, lipase, amylase và cellulase Ví dụ, B amyloliquefaciens là chủng vi khuẩn có lợi, tiềm năng quan trọng đã được thấy

tiết ra cellulase và được áp dụng cho nhiều loại thức ăn của động vật có vú để cải thiện môi trường vi khuẩn đường ruột của chúng Trong số các VSV sinh α-

amylase, Bacillus gần như có số loài lớn nhất Hầu như các loài thuộc chi này đều có thể tìm thấy các chủng sinh α-amylase, ví dụ như B subtilis , B stearothermophilus, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B circulans, B coagulan, B caldoliticus, B acidocodaricus, B megaterium…, trong đó B subtilis, B stearothermophilus, B licheniformis và B amyloliquefaciens, được

biết đến là những loài sản xuất amylase tốt và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thương mại cho các ứng dụng khác nhau (Sundarram, Murthy 2014) Ngoài

ra, trong quá trình sinh trưởng, chi Bacillus còn sinh các loại enzyme ngoại bào

khác như alkaline phosphatase, galactosidase, chitinase, isomerase, glucanase,

urease đây là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus (Priest 1977)

Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng, Bacillus có khả năng kiểm soát một số

vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên lợn, điều này có thể là do khả năng sinh một

số enzyme ngoại bào của chúng Một số chế phẩm vi sinh có Bacillus được bổ

sung vào khẩu phần của lợn như Toyocerin® đã làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh tiêu chảy, giảm tỷ lệ mắc bệnh ở lợn con trong thử nghiệm với vi

khuẩn gây bệnh đường ruột E coli (Williams et al., 2009) Rotease và cellulase

cũng ức chế sự tăng trưởng của một số vi sinh vật gây bệnh vì thành tế bào của

chủng VSV gây bệnh đó có thành phần là cellulose, protein, điển hình là B licheniformis, B subtilis, B amyloliquefaciens, và B majovensis (Son, Kim

2002)

Nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm vi khuẩn Bacillus có thể chuyển

hóa các chất như cellulose, tinh bột, protein thành các axit amin và glucose dễ hấp thụ, góp phần cải thiện dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật nuôi tăng trọng nhanh, đặc biệt là lợn con ở giai đoạn sau cai sữa Do vậy, có thể nói khả năng sinh enzyme thủy phân các hợp chất hữu cơ là một đặc tính rất cần

thiết trong việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo chế phẩm probiotic tiềm

năng trong chăn nuôi

1.2.3 Nấm men tích lũy protein đơn bào

Sinh khối nấm men được sử dụng rộng rãi như nguồn cung cấp protein cho người và động vật trong thức ăn chăn nuôi hoặc các sản phẩm bổ sung cho

con người Nhiều nghiên cứu đã sử dụng chủng nấm men S cerevisiae để sản xuất protein đơn bào, glucan, carotenoid (Mata-Gómez et al., 2014) Nhiều phế

phụ phẩm công-nông nghiệp đã được sử dụng làm nguồn cơ chất để sản xuất sinh khối nấm men trên quy mô công nghiệp, đặc biệt là rỉ đường Hiện nay,

Saccharomyces cerevisiae là chủng nấm men không chỉ được ứng dụng rộng rãi

trong ngành lên men đồ uống và sản xuất protein đơn bào mà còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Thuật ngữ protein đơn bào mới hình hành trong giới khoa học từ những năm 50 của thế kỷ trước Thực tế loài người đã biết sử dụng loại protein này và các chất có trong tế bào VSV từ rất lâu Protein đơn bào (SPC-Single cell protein) là thuật ngữ chỉ một loại chất dinh dưỡng có trong tế bào và chỉ sản xuất từ VSV, được sử dụng làm thức ăn cho người và động vật Thuật ngữ này không chỉ đơn giản là protein từ tế bào của cơ thể đơn bào, vì rất nhiều VSV không phải là cơ thể đơn bào mà người ta vẫn khai thác chúng Do đó, thuật ngữ này nên hiểu là nguồn dinh dưỡng chứa nhiều protein từ VSV khác nhau, cả đơn bào lẫn đa bào (từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tảo) (Nasseri, Khaviari 2011) Được sử dụng trước hết là nguồn protein trong dinh dưỡng động vật, chủ yếu là trong chăn nuôi

Protein đơn bào là tế bào khô của vi sinh vật, được sử dụng làm chất bổ sung protein trong thức ăn của con người hoặc thức ăn chăn nuôi Các vi sinh vật như tảo, nấm, nấm men và vi khuẩn, sử dụng nguyên liệu và chất thải không tốn kém như nguồn carbon và năng lượng để tăng trưởng để sản xuất sinh khối, protein cô đặc hoặc axit amin Vì protein chiếm một phần quan trọng về số lượng của các tế bào vi sinh vật, các vi sinh vật này, còn được gọi là protein đơn bào như là tập trung protein tự nhiên Với sự tiêu tốn về thức ăn chăn nuôi công nghiệp, việc sử dụng sinh khối vi sinh vật như thức ăn được quan tâm hơn (Suarez, Guevara 2018) Một số loài chủ yếu sử dụng trong quá trình lên men

thức ăn thô xanh là Saccharomyces cerevisiae, S boulardii, S unisporus (Bhattacharya et al., 2014)

1.2.4 Yêu cầu về an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong chăn nuôi

Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của Cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học vi sinh vật được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong

đó chỉ các VSV ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất Các loài thuộc

Bacillus bài tiết các enzyme thủy phân có khả năng phá vỡ vách tế bào, sinh tổng hợp một loạt các loại thuốc kháng sinh như iturin, surfactin (Tsuge et al., 2001), fengycin (Phister et al., 2004), bacillomycin và mycosubtilin (Ramarathnam et al., 2007) Về tính an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong

chăn nôi: Các chủng probiotic sử dụng cho động vật thủy sản được sử dụng hiện

nay chủ yếu là các chủng L acidophilus, B subtilis, S cerevisiae, dùng bổ sung

vào thức ăn Vi khuẩn lactic được xem là vi sinh vật an toàn (Generally Recognized as Safe, GRAS) và được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp

thực phẩm, dược phẩm và y tế, LactoBacillus plantarum là một trong những

loài LAB phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực

phẩm, chăn nuôi (Saboda et al., 2014)

1.2.5 Một số đặc tính sinh học của nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn chăn nuôi

Đặc tính ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Bacteriocin, được sinh tổng hợp bởi LAB, là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng hợp theo con đường ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Bacteriocin không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người Do tính an toàn và những đặc tính đặc biệt nên không những chỉ vi khuẩn LAB mà còn cả

bacteriocin do vi khuẩn này sinh tổng hợp ra được nghiên cứu rộng rãi

(Bromberg et al., 2004) Sinh enzyme ngoại bào: trong quá trình sống, các nhóm

vi sinh vật thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học cần thiết để thích

ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện MT sống Ngoài cellulase chúng còn có khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như protease, amylase, alkaline phosohatase, glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose, isomerase,

glucanase, lipase, urease đây một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus Trong

đó, Bacillus là một trong số các VSV có khả năng sinh protease nhiều nhất, đặc

biệt là protease kiềm tính Đặc biệt, so với amylase lấy từ động vật và vi nấm thì

amylase từ Bacillus bền hơn trong môi trường axit của dạ dày (Gupta, Westney

2003) Sự cạnh tranh sinh học Trong môi trường tự nhiên luôn có sẵn hệ vi sinh vật ở trạng thái cân bằng tạo nên hệ sinh thái đặc trưng bản địa để duy trì sự sống Trong ruột động vật có hơn 500 loài vi sinh vật cộng sinh có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, cung cấp chất dinh dưỡng và điều biến miễn dịch Sự mất cân bằng

hệ sinh thái đường ruột xảy ra khi vi khuẩn gây bệnh có điều kiện phát triển mạnh hơn

Khả năng chịu pH axit và muối mật (0,3%) là một trong những tiêu chí quan trọng cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn cho lên men thức ăn vì đây là những yếu tố chính quyết định khả năng sống sót của vi khuẩn trong dạ dày

(Saarela et al., 2000) Chủng L plantarum ZlP001 phân lập từ ruột lợn cho thấy

khả năng sống sót tới 85,3;61,4 và 9,4% khi tiếp xúc với 0,1;0,3 và 0,5% muối

mật trong môi trường nuôi cấy (Wang et al., 2012) Các chủng L plantarum 03,

L plantarum 06, L plantarum 21, L plantarum 28 và L plantarum 30 đã chịu đựng muối mật với hàm lượng lên tới 0,3% (Dowarah et al., 2018) Một số tác giả cũng đưa ra khả năng chịu pH thấp của hai chủng L reuteri BFE1058 và L johnsonii BFE1061 phân lập từ phân lợn có thể phát triển ở pH thấp 3,0 và 4,0 trong 6 giờ ở 37°C (Du Toit et al., 1998) Các chủng L lactis và Enterococcus faecium cho thấy khả năng chịu đựng pH axit tốt hơn L casei và P acidilactici (Guerra et al., 2007) Chủng Lacp29 có khả năng sống sót ở pH axit nhưng không thể tồn tại ở môi trường chứa 0,3% muối mật (Dowarah et al., 2018) B racemilacticus và B coagulans có thể chịu đựng được nồng độ muối mật trên 0,3% (Dowarah et al., 2018); một vài chủng khác như B pasteurii, B seohaeanensis, B pantothenticus,… có thể ST ở nồng độ NaCl 10% Đặc biệt, nhờ khả năng sinh bào tử mà rất nhiều loài Bacillus có khả năng sinh trưởng và sống sót trong MT axit cũng như trong MT kiềm Ví dụ như chủng B

laevolacticus DSM 6475 có thể phát triển ở pH 2-3 Còn B alcalophilus và B pasteurii có thể ST tốt ở pH 8-11 (Dowarah et al., 2018) Chính nhờ những đặc

tính ưu việt nêu trên cùng với khả năng dễ bảo quản ở điều kiện thường,

Bacillus, LAB được đánh giá là một trong những đối tượng giàu tiềm năng khai

thác trong lĩnh vực sản xuất chế phẩm vi sinh ứng dụng trong chăn nuôi

1.3 HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN THỨC ĂN

THÔ XANH DẠNG LỎNG

Một số nghiên cứu cũng cho rằng, thức ăn lên men dạng lỏng là một trong những cách làm cho lợn ăn hiệu quả nhất để thay thế việc sử dụng các chất kích thích tăng trưởng kháng sinh Tác dụng có lợi đã được quan sát ở lơn sữa, lợn cai sữa và lợn đang trưởng thành Sự cải thiện đáng kể này là liên quan đến tỷ lệ mầm bệnh có trong dạ dày và ruột lợn (Kil, Stein 2010)

Lợn con mới sinh có đường ruột sạch, ít vi sinh, hệ sinh vật rất đặc trưng

nhờ tiếp xúc với mẹ và môi trường (Konstantinov et al., 2006) Giai đoạn ngay

sau khi sinh là quan trọng nhất để thiết lập hệ vi khuẩn có lợi, có thể dẫn đến 1

hệ vi sinh ổn định, lâu dài Vì vậy, chế độ ăn của lợn nái rất ảnh hưởng đến quần

thể vi khuẩn trong ruột của con non (Kenny et al., 2011) Lợn con có lợn mẹ được cho ăn thức ăn lên men dạng lỏng có số lượng VK Coliform trong phân

thấp hơn so với lợn con từ lợn mẹ chỉ được cho ăn thức ăn lỏng không lên men hoặc chế độ ăn khô Ngoài ra, số lượng LAB cao hơn trong phân của lợn con cũng từ lợn mẹ được cho ăn thức ăn lên men lỏng so với các Lợn con khác Đây

có thể là một dấu hiệu cho thấy việc sử dụng đúng chủng vi khuẩn sinh học để sản xuất thức ăn lên men dạng lỏng có thể dẫn đến việc hình thành hệ vi sinh của lợn con trong suốt chu kỳ sống

Hiệu quả sử dụng thức ăn lên men dạng lỏng cho lợn đang phát triển và lợn cai sữa là khác nhau Các tác giả Jensen và Mikkelsen đã tóm tắt kết quả của

9 thử nghiệm in vivo, kết quả cho thấy, sự cải thiện về hiệu suất ở lợn trưởng

thành không cao bằng lợn cai sữa, nhưng có một số lợi ích về chất lượng thân thịt (Jensen 1998, Mikkelsen, Jensen 1998) Sự có mặt của thức ăn lên men dạng lỏng đã được chứng minh là làm thay đổi sự chuyển đổi của tryptophan trong ruột thành dạng indole thay vì skatole, dẫn đến nồng độ skatole giảm trong mỡ lưng của lợn đực và do đó làm giảm chất béo của lợn đực (Kjeldsen 1993)

Những cải thiện đáng kể về khả năng tiêu hóa các chất hữu cơ, nitơ và canxi đã được báo cáo Một số giả thuyết cho rằng, sự caỉ thiện này là việc cho

ăn thức ăn lên men dạng lỏng đã làm thay đổi hình thái của đường tiêu hóa Scholten và cộng sự đã báo cáo rằng lợn được cho ăn thức ăn lỏng lên men có chiều dài lông nhung lớn hơn đáng kể và tỷ lệ lông/diện tích lớn hơn, cả hai đặc điểm đều có liên quan đến khả năng tiêu hóa Quá trình lên men của thức ăn đã được chứng minh là cần phốt pho, vì vậy photpho được lấy từ phytate bằng cách kích hoạt phytase nội sinh, kết quả trong nghiên cứu của Lyberg báo cáo tỷ lệ tiêu hóa ở lợn được cho ăn thức ăn lên men dạng lỏng cao hơn so với thức ăn

khô (30 so với 48%) (Scholten et al., 2002)

Một ưu điểm khác của thức ăn lên men lỏng là khả năng làm giảm hàm lượng các yếu tố kháng dinh dưỡng khác nhau có trong thức ăn, theo báo cáo của chế độ ăn lên men dựa trên hạt cải dầu đã báo cáo là giảm 17% isothiocyanates sau 1 ngày lên men và giảm 68% sau 3 ngày lên men Lên men đậu trong 96 giờ làm giảm nồng độ các yếu tố chống dinh dưỡng như α

galactoside, phytate, chất ức chế trypsin, tannin và saponin (Chiang et al., 2009)

Điều này cũng được thấy trong nghiên cứu của cho quá trình lên men của đậu đũa và đậu tương Tuy nhiên, trong quá trình lên men đậu nành, chất ức chế có trypsin tăng nhẹ (Egounlety, Aworh 2003)

Ngoài ra, việc lượng bụi được giảm trong chuồng lợn trong quá trình xử

lý và cho ăn thức ăn dạng lỏng đã được ghi nhận Việc giảm như vậy không chỉ cải thiện môi trường cho lợn và con người mà còn có thể giúp làm giảm tác động của các bệnh về đường hô hấp của lợn

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM VI SINH

TRONG LÊN MEN THỨC ĂN CHO LỢN VIỆT NAM

Tại Việt Nam, đa số chế phẩm sinh học áp dụng thành công đều chứa đa enzyme, probiotics, nấm men có khả năng thủy phân và phân giải tinh bột, xơ (xylanase, amylase, protease, glucanase, phytase, pectinase, cellulase, mannase)

Sử dụng chế phẩm sinh học để lên men thức ăn chăn nuôi đều cho hiệu quả kinh

tế cao: tăng trọng lượng trung bình của động vật lên 5-10%, giảm thức ăn trên một kg trọng lượng, tăng năng suất đẻ trứng, tăng năng suất sữa, tăng khả năng hấp thụ protein và giảm ô nhiễm môi trường Năm 2004, Trần Thạnh Phong (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ-TP HCM) đã thực hiện đề tài

“Khảo sát khả năng sinh tổng hợp xylanase từ Trichoderma reesei và A niger

trên môi trường lên men bán rắn” Kết quả nghiên cứu đã đã tạo chế phẩm sinh

học từ bã mía dùng bảo quản cỏ xanh làm thức ăn cho gia súc, tận dụng nguồn phế liệu bã mía kết hợp với cám mì, dùng phương pháp công nghệ sinh học (lên men bán rắn) để tổng hợp thành chế phẩm sinh học chủ yếu là xylanase Chế phẩm này kết hợp với chế phẩm VEM (chứa nhóm vi khuẩn lactic và nấm men) dùng vào việc ủ cỏ xanh (hoặc các phế phẩm nông nghiệp khác như bắp, đậu) có tác dụng duy trì giá trị dinh dưỡng của cỏ như lúc mới thu hoạch trong thời gian dài Giải pháp này đã thiết thực đáp ứng cho vấn đề bảo quản dự trữ nguồn thức

ăn cho gia súc Năm 2007- 2010, PGS TS Quyền Đình Thi đã thực hiện đề tài

cấp Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzym có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Nhóm nghiên cứu đã sàng lọc được

một số chủng tự nhiên và tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các xylanase, protease, glucanase và mannanasecao Từ đó đã xây dựng được các quy trình tạo chế phẩm đa enzyme từ chủng tái tổ hợp bổ sung vào thức ăn chăn nuôi (Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên 2007-2010) Tuy nhiên chế phẩm này vẫn đang tiếp tục được phát triển nhằm ứng dụng vào thị trường thức ăn trong chăn nuôi trong nước

Năm 2006-2009, Trần Quốc Việt và cs đã thực hiện đề tài "Nghiên cứu sản xuất probiotic và emzym tiêu hoá dùng trong chăn nuôi", trong đó đã phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích, bước đầu các xác định điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vậttuyển chọn và tạo tổ hợp các chủng vi khuẩn hữu ích có các đặc tính probiotic Chế phẩm probiotic đa chủng dạng bột có thành phần chính gồm 6 chủng vi khuẩn có ích (04 chủng vi

khuẩn lactic, 01 chủng vi khuẩn Bacillus và 01 chủng nấm men) Sử dụng chế

phẩm vi sinh vật bổ sung trực tiếp vào thức ăn chăn nuôi đã cải thiệntốc độ sinh trưởng ở lợn và gà từ 5-16%, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở lợn 32% Ngoài ra, đề tài đã sản xuất chế phẩm đa enzyme dạng bột có thành phần chính gồm amylase (2210 IU/g); protease (110IU/g); cellulase (1116 IU/g); beta-glucanase (200 IU/g) và xylanase (1000 IU/g) giúp cải thiệntốc độ sinh trưởng ở lợn và gà từ 6-11%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn ở lợn và gà từ 5-9% (Trần Quốc Việt 2008)

Năm 2012-2013, TS Lê Văn Ty thực hiện đề tài cấp Sở khoa học tỉnh

Sơn La “Nghiên cứu lên men lõi ngô với nấm mốc Aspergillus, sản xuất chế phẩm đa enzyme, bổ sung làm gia tăng mức tiêu hóa hấp thu, giảm tiêu tốn thức

ăn trong chăn nuôi gia cầm và gia súc” Trong đề tài nhóm tác giả đã tạo ra được quy trình sản xuất chế phẩm Sonlazyme từ chủng A oryzae VTCC F0187

có chứa 4 loại xylanase, protease, glucanase và mannanase hoạt lực cao bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Nhìn chung, cho đến nay chưa có đề tài nghiên cứu nào khai thác tạo chế phẩm sinh học giúp chuyển hóa thức ăn thô xanh thành thức ăn có chất lượng đáp ứng yêu cầu phát triển chăn nuôi lợn hữu cơ thâm canh

Trong thời gian vừa qua, nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ sinh học kết hợp với Đại học Bách khoa Hà Nội đã bước đầu nghiên cứu sàng lọc các chủng vi sinh vật chức năng theo các đặc tính trên để xử lý thức ăn thô xanh kết hợp với nguồn nitơ từ vỏ đỗ, nitơ vô cơ cùng các thảo dược ức chế vi sinh vật tạp nhiễm Thức ăn dạng lỏng bước đầu khảo sát trên đàn lợn quy mô 5 con/mô hình tại Công ty CP Chăn nuôi T&T 159 cho kết quả khả quan về hiệu quả sản xuất thức ăn (giá thành <5.000 đồng/kg thức ăn khô; tỷ lệ tăng trọng tương đương với mô hình sử dụng thức ăn công nghiệp (giá thành >10 nghìn/kg thức

ăn khô) Ngoài ra, khi sử dụng FLF, doanh nghiệp đánh giá hiệu quả về kinh tế, không sử dụng kháng sinh và chất bảo quản độc hại, chất lượng thịt của đàn lợn tương đương với sử dụng thức ăn công nghiệp Đặc biệt, công nghệ nuôi giảm mùi hôi trong chất thải và nước thải chăn nuôi do có thể do các vi sinh vật probiotics còn tồn tại trong chất thải Theo đánh giá chung, quy trình tạo chế phẩm vi sinh vật và FLF từ nguồn thức ăn thô xanh cần nghiên cứu thêm đáp ứng nhu cầu sản xuất tập trung và mở rộng ứng dụng

Xuất phát từ các luận điểm trên, việc thực hiện đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh phù hợp và quy trình áp dụng xử lý thức ăn thô xanh thành thức ăn lỏng cho chăn nuôi có ý nghĩa thực tế, đáp ứng yêu cầu thực tế của doanh nghiệp và các hộ chăn nuôi

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thức ăn xanh: Cỏ voi, rau lang được trồng và thu hoạch tại Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Các chủng vi khuẩn kiểm định: Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 (Salmonella Typhimurium ATCC 14028), Escherichia coli ATCC 11105, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 nhận

từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất: Cao nấm men (Himedia, Ấn Độ); (Chameleon, Nhật Bản); Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol (Trung Quốc), Isoamylalcohol (Trung Quốc), Glycerol (Trung Quốc), Ethanol (Trung Quốc), Chloroform (Trung Quốc), Agarose (Merck, Đức); Thạch (Việt Nam) và một số hóa chất khác

Thiết bị nghiên cứu: tủ nuôi (Biotek, Mỹ), máy ly tâm (Eppendorf, Đức),

lò vi sóng (Sam Sung, Hàn Quốc), máy lắc ổn nhiệt (CPT inc, Hàn Quốc), máy chạy điện di (Mupid, Nhật Bản), máy PCR (Applied biosystems, Mỹ), máy đo

OD (S-300 nano, Optima, Nhật Bản), máy đọc Elisa (Biotek, Mỹ), nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản); Máy đo pH (Nhật Bản); Tủ sấy (Mỹ) và một

số thiết bị nghiên cứu khác

2.1.3 Môi trường nghiên cứu

Các môi trường được sử dụng trong tuyển chọn chủng nuôi cấy, đánh giá khả năng kháng VSV kiểm định và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng VSV (Phụ lục 1)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân tích hóa sinh

3) Xác định hoạt tính các enzyme ngoại bào

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa môi trường khoáng MK có bổ sung các cơ chất tương ứng trong thời gian 1 - 3 ngày ở 37oC như sau: Bổ sung

1 % (w/v) casein để kiểm tra hoạt tính protease; bổ sung 1% CMC (cacboxyl metyl cellulose) để kiểm tra hoạt tính cellulase; bổ sung 1 % (w/v) xylan để xác định hoạt tính xylanase (Brooks 2003) Hoạt tính enzyme được xác định bằng chỉ số D-d (mm) sau 1 - 3 ngày nuôi cấy (D là đường kính vòng phân giải, d –

độ lớn của các khuẩn lạc vi khuẩn phát triển) (Gusils et al., 2002)

4) Xác định hoạt tính cellulase

Hoạt độ cellulase trong dịch nuôi cấy được xác định bằng phương pháp axit dinitrosalicyclic (DNS) (Miller 1959) Một đơn vị hoạt độ enzyme được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân cơ chất giải phóng ra 1 μM

glucose trong một phút dưới điều kiện phản ứng (Gusils et al., 2002)

5) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic

a) Xác định khả năng sinh axit tổng số bằng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường có bổ sung CaCO3 (Chiang et al., 2015)

b) Định tính khả năng sinh axit lactic bằng thuốc thử Uphenmen

Chủng giống được nuôi trong môi trường MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men Cho

50 µl dịch lên men vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Uphenmen, ống đối chứng: 2 ml thuốc thử Uphenmen Quan sát và ghi nhận sự chuyển màu của thuốc thử: Màu vàng tạo thành càng đậm chứng tỏ lactic axit được tạo ra càng nhiều (Trần Thị Ái Liên 2011)

c) Định lượng axit lactic bằng phương pháp quang phổ

* Cơ sở của phương pháp là dựa vào sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của phản ứng giữa sắt (III) clorua và dung dịch axit lactic dẫn đến sự hình thành sắt (III) lactat màu vàng, được hấp phụ cực đại ở bước sóng 390 nm Hàm lượng axit lactic được xác định thông qua đường chuẩn axit lactic

(Borshchevskaya et al., 2016)

Hình 2.1 Đường chuẩn axit lactic

* Xác định hàm lượng axit lactic của chủng vi khuẩn

Nuôi lắc các chủng VK trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men Tiến hành phản ứng: 50 µl dịch lên men + 2 ml FeCl3 (0,2%); trộn đều Sau đó hỗn hợp được đo

độ hấp phụ quang phổ ở bước sóng 390 nm Hàm lượng axit lactic của chủng VSV được tính theo công thức sau:

Y (mg/ml) = (12,253 X ∆ - 0,3215) X D

Trong đó: ∆: giá trị hấp phụ cực đại ở bước sóng 390 nm

D: hệ số pha loãng

6)Xác định lượng sinh khối khô

Các chủng nấm men được nuôi trong ống nghiệm Hansen lỏng (10 ml) ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút Sau 48 giờ, li tâm thu sinh khối và xác định lượng sinh khối khô bằng cách sấy 80ºC và cân đến khối lượng không đổi (Rajashree, Muthukumar 2013)

y = 12,253x - 0,3215 R² = 0,9991

0 2 4 6 8 10 12

7) Xác định hàm lượng protein thô trong tế bào

Để sàng lọc các chủng nấm men tạo ra hàm lượng protein cao, mỗi chủng được nuôi cấy trong 10 ml Hansen lỏng và được ủ ở 30ºC trong 48 giờ Các tế bào nấm men được thu thập bằng cách ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút trong

10 phút Các tế bào được rửa bằng nước cất ba lần và được tái huyền phù trong dung dịch đệm ly giải Sau đó, huyền phù tế bào được ủ trong 20 phút trong điều kiện lắc ở nhiệt độ phòng để tách tế bào Sau khi ủ, mẫu được siêu âm trong 5 phút với đệm đồng nhất (Cole-Parmer Dụng cụ, Vernon Hills, Illinois, Hoa Kỳ)

để tăng phá tế bào và giải phóng protein Hàm lượng protein sau đó được xác định bằng phương pháp nhuộm Bradford (Shi, Li 2012)

8) Tuyển chọn các chủng có hoạt tính probiotic

a) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

* Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy

VK vào môi trường thạch, hoạt tính ức chế dịch nuôi VK là tạo vòng vô khuẩn

quanh lỗ đục (Damayanti et al., 2014)

* Cách tiến hành

Nuôi lắc các chủng lactic trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ và Bacillus

trên MPA lỏng ở 37oC trong 24 giờ Ly tâm 5000 vòng/phút (2 phút) để loại bỏ

sinh khối, thu dịch lên men của chủng VK lactic và chủng Bacillus Cấy trang

VSV kiểm định lên môi trường MPA Dùng khoan nút chai vô trùng (đường kính d= 6 mm) khoan lỗ ở giữa đĩa chứa VSV kiểm định Bổ sung dịch lên men

của chủng VK lactic, Bacillus nghiên cứu vào lỗ khoan Đặt mẫu trong tủ lạnh

từ 4 – 8 giờ để dịch từ các lỗ khoan khuếch tán ra môi trường nuôi cấy VSV Sau đó để tủ nuôi 24 giờ Quan sát vòng kháng khuẩn Hoạt tính đối kháng được xác định bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn theo công thức D – d (mm)

Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (mm)

b) Khả năng kháng kháng sinh

* Nguyên tắc: Các chất kháng sinh có thể khuếch tán trên môi trường thạch, ức chế các VSV mẫn cảm với chúng và tạo ra vòng vô khuẩn Những

VSV nào có khả năng kháng với chất kháng sinh thì có thể sinh trưởng và phát

triển (Damayanti et al., 2014)

* Cách tiến hành:

Giống khảo sát được hoạt hóa trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ và

Bacillus trên MPA lỏng ở 30oC trong 24 giờ Trang 5 µl dịch nuôi cấy VK lên đĩa chứa môi trường thạch MRS và trên môi trường thạch MPA Đặt các khoanh giấy đã được tẩm kháng sinh lên mặt thạch và để tủ lạnh trong 4 giờ Sau đó để

tủ nuôi 37oC và 30oC Quan sát kết quả sau 48 giờ nuôi cấy đối với VK lactic và

24 giờ đối với Bacillus Độ nhạy kháng sinh được xác định bằng cách đo đường

kính vùng ức chế D – d (mm) như mô tả trước đó (Williams 1989) Chủng VK được coi là nhạy cảm (S) với kháng sinh khi D – d > 10 mm, trung gian (I) khi 5,0 < D – d < 9,9 mm hoặc kháng (R) khi D – d < 4,9 mm

c) Khả năng chịu muối mật

* Nguyên tắc: muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh Do vậy, VSV probiotic khi qua ruột non chịu tác động của muối mật Ở ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2% Khả năng sống sót sau tác dụng của muối mật là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của VSV

probiotic

* Cách tiến hành: Tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật với các nồng độ muối mật 0,3%; 0,5%; 1%; 2%; 3% ở những thời điểm 0; 6; 12; 24 giờ

đối với VK lactic và những thời điểm 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ đối với VK Bacillus

Chuẩn bị giống: LAB được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS lỏng, VK

Bacillus được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường MPA lỏng Chuẩn bị môi

trường MRS lỏng và MPA lỏng có bổ sung mật lợn (Becton, Dickinson and Company, USA) ở các nồng độ 0% (đối chứng); 0,3%; 0,5%; 1%, 2% Dùng pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107 – 108 tế bào/ml môi trường) vào môi trường MRS lỏng và MPA lỏng có bổ sung mật lợn ở các nồng độ 0,3; 0,5; 1; 2

và đối chứng 0% (không chứa mật lợn) Nuôi ở nhiệt độ 37oC và 30oC Tiến hành đo OD ở bước sóng 630 nm ở các thời điểm 0; 6; 12; 24 giờ đối với VK

lactic và 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ đối với VK Bacillus Ghi nhận kết quả Tính tỷ lệ

tế bào sống sót thông qua mối tương quan giữa giá trị OD với mật độ tế bào tại

mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm (Menconi et al., 2014)

d) Khả năng chịu pH axit

* Nguyên tắc: dựa vào khả năng chịu pH axit (1 - 3) của các chủng probiotic Do vậy, chúng tôi khảo sát khả năng chịu đựng pH axit ở pH 1; 2; 3 tại các thời điểm từ 0; 6; 12; 24 giờ đối với VK lactic và 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ

đối với VK Bacillus

* Cách tiến hành: VK lactic được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS

lỏng và VK Bacillus được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường MPA lỏng Chuẩn

bị môi trường MRS lỏng và MPA lỏng với pH 1; 2; 3 và mẫu đối chứng (pH 7) Dùng pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107– 108 tế bào /ml môi trường) vào các môi trường đã chuẩn bị Nuôi ở nhiệt độ 37oC và 30oC Tiến hành đo OD ở bước sóng 630 nm ở các thời điểm từ 0; 6; 12; 24 giờ Ghi nhận kết quả Tính tỷ

lệ tế bào sống sót thông qua mối tương quan giữa giá trị OD với mật độ tế bào

tại mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm (Menconi et al., 2014)

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử

a) Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc

(vi khuẩn trêm môi trường MPA và nấm men trên môi trường Hansen), vi khuẩn lactic trên môi trường MRS (37oC) Hình thái khuẩn lạc và khả năng phát triển

của chủng được quan sát sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy (Dowarah et al., 2018)

b) Quan sát hình thái tế bào

Chủng VSV được nuôi trong môi trường lỏng MPA, MRS, Hansen ở nhiệt độ 30oC, 37oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 18 - 20 giờ Tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lactic trong dịch nuôi cấy được nhuộm Gram

và quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học Olympus BH2 (Dowarah et al., 2018)

c) Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon, nito

Khả năng sử dụng nguồn carbon của chủng vi khuẩn nghiên cứu được xác định trên môi trường thạch MK trong các ống nghiệm có bổ sung 1% (w/v) các nguồn đường/ nguồn nito khác nhau Khử trùng các ống nghiệm chứa môi trường thạch theo phương pháp Pasteur Tiếp đó, cấy vi khuẩn vào các ống thạch nghiêng và nuôi 1 - 3 ngày ở nhiệt độ 30oC (đối với vi khuẩn, nấm men),

37oC (đối với vi khuẩn lactic) Môi trường khoáng MK được lựa chọn làm đối chứng âm Quan sát khả năng phát triển trên các môi trường để xác định khả

năng sử dụng các nguồn carbon, nito khác nhau của các chủng VSV (Bayane et al., 2006)

d) Xác định khả năng chịu muối và dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn

Để xác định khả năng phát triển của VSV ở các nồng độ muối khác nhau, VSV được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA (đối với vi khuẩn), MRS (đối với vi khuẩn lactic) và Hansen (đối với nấm men) Các môi trường có bổ sung NaCl nồng độ tăng dần từ 1 - 10% ở 25oC (đối với nấm men), 37oC (đối với vi khuẩn và vi khuẩn lactic) Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy

Để xác định dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn, chủng vsv được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA (đối với vi khuẩn), MRS (đối với vi khuẩn lactic) và Hansen (đối với nấm men) ở các nhiệt độ khác nhau (10, 20, 30, 37, 40, 45 và 50oC) và dải pH khác nhau (từ pH 2,0 – pH 12,0) Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy

(Menconi et al., 2014)

e) Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật được tuyển chọn dựa trên phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA (đối với vi khuẩn) và vùng ITS rDNA (đối với nấm men)

DNA tổng số của vi khuẩn được tách theo phương pháp của Dowarah et

al (2018) DNA tổng số của nấm men được tách chiết theo phương pháp (Souza Liberal et al., 2005) Gen mã hóa 16S rDNA của VK được khuếch đại bằng

phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’)

và 1429R (5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’) DNA tổng số của nấm men tuyển chọn được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen mã hóa cho vùng ITS bằng

(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) Phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 50 µL có chứa 1 µL mẫu DNA của bộ gen (10 ng/µL), 5 µL của 10 x Taq buffer, 1 µL dNTP (200 µM), 1 µL mồi xuôi và mồi ngược (0,5 µM) và Taq DNA polymerase (0,05 U/µL) (MBI, Fermentas, Lithuania)

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình

tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam Trình tự gen 16S rDNA và vùng ITS và 28S rDNA được so sánh với các trình tự gen tương ứng của các chủng vi khuẩn và nấm men trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)

2.2.3 Lên men vi sinh vật tạo chế phẩm và phối trộn thức ăn thô xanh lên men

1) Lên men, thu hồi sinh khối

a) Nhân giống vi sinh vật

Từ ống giống các chủng B subtilis VTX16, B licheniformis VTX18, L plantarum LTX28 và S cerevisiae MTX14 được giữ trong glycerin -80ºC, giống

được lấy ra cho vào hộp đá (30 phút) để cho ống giống rã đông từ từ Dùng que

cấy chuyển một vài mẫu giống sang ống nghiệm môi trường MPA lỏng (B subtilis VTX16, B licheniformis VTX18), MRS lỏng (L plantarum LTX28) và môi trường Hansen lỏng (S cerevisiae MTX14) Các ống môi trường được cấy

giống được nuôi ở lắc 200 vòng/phút ở 30°C (vi khuẩn, nấm men) và 37oC (VK lactic) trong 18-20 giờ (vi khuẩn, VK lactic) và 48 giờ (nấm men) Các ống giống cho thấy sự phát triển mạnh, thuần khiết (kiểm tra bằng phương pháp soi kính hiển vi) được lựa chọn để cấy chuyển giống Giống được chuyển với tỷ lệ

là 5% sang bình tam giác 500 ml chứa 150 ml môi trường lỏng đã chuẩn bị trước

đó Các bình đã cấy chuyển giống được nuôi trên máy lắc: 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC/37oC trong 18-20 giờ/48 giờ Theo dõi, quan sát quá trình nhân giống Kiểm tra khả năng sinh trưởng và độ thuần khiết (soi kính hiển vi) Loại

bỏ những bình bị nhiễm, chết và thoái hóa, những bình giống thể hiện sự phát triển chậm hay dịch môi trường đục bất thường Giống sinh trưởng tốt và không nhiễm được sử dụng để tiếp giống cho bình lên men

b) Lên men các chủng tuyển chọn

Các chủng B subtilis VTX16 và B licheniformis VTX18 lên men trên môi trường MTB3 Chủng L plantarum LTX28 lên men trên môi trường MRS

Chủng S cerevisiae MTX14 lên men trên môi trường Hansen Điều kiện lên

men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New Brunswick Scientific-Mỹ)

của các chủng B subtilis VTX16, B licheniformis VTX18, độ pH ban đầu 6,5 –

7,0; nhiệt độ 37ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48 giờ

Điều kiện lên men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New

Brunswick Scientific-Mỹ) của chủng L plantarum LTX28, độ pH ban đầu 6,0 –

6,5; nhiệt độ 37ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48 giờ

Điều kiện lên men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New

Brunswick Scientific-Mỹ) của chủng S Cerevisiae MTX14, độ pH ban đầu 6,0

– 6,5; nhiệt độ 25ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48 giờ

c) Thu hồi sinh khối vi sinh vật

Từ 4 bình lên men của 4 chủng sẽ thu được sinh khối riêng rẽ của 4

chủng: B subtilis VTX16, B licheniformis VTX18, L plantarum LTX28, và S cerevisiae MTX14 Sau quá trình lên men, thu toàn bộ dịch lên men và ly tâm

với tốc độ 7000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ dịch trong, thu sinh khối, sinh khối được rửa loại bỏ các thành phần môi trường với dung dịch NaCl 0,85%, sau đó ly tâm với tốc độ 7000 vòng/phút, loại bỏ dịch trong, thu sinh khối Sinh khối của 4 chủng được trộn với glycerol 15% để bảo quản các mô sinh học bị đông Sinh khối của từng chủng dược cho vào từng khay được cho vào máy sấy đông khô Phương pháp giữu giống lạnh đông dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi sinh bằng cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu ở -25°C đến -70°C

2) Phối trộn, lên men thức ăn thô xanh và đánh giá thành phần dinh dưỡng

a) Phối trộn khẩu phần

+ Phương pháp phối hợp khẩu phần: Đề tài lựa chọn tiêu chuẩn ăn của

Việt Nam (Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1547:1994 về thức ăn hỗn hợp cho lợn)

cho đối tượng lợn lai để phối hợp khẩu phần ăn Chúng tôi sử dụng phần mềm Pig diet Formulation để tiến hành phối hợp khẩu phần ăn cho lợn

Thành phần dinh dưỡng của các nguyên liệu thức ăn được sử dụng để phối hợp khẩu phần được trình bày tại (Bảng 2.1, Bảng 2.2)

Bảng 2.1 Thành phần hóa hóa học của các nguyên liệu thức ăn

Cỏ voi 30 ngày 17,91 2077 13,29 2,37 34,72 65,82 36,38 12,87 Rau muống 13,82 2445 26,79 1,32 20,42 30,07 19,72 11,95

Bảng 2.2 Thành phần nguyên liệu thí nghiệm lên men thức ăn thô xanh kết hợp

với một số nguồn dinh dưỡng khác

b) Sử dụng vi sinh lên men thức ăn thô xanh

Thức ăn xanh (rau muống, cỏ voi 30 ngày) được lấy về, rửa sạch và nghiền nát bằng máy nghiền thức ăn 3A Trong quá trình nghiền đồng thời thêm bột ngô, cám gạo, khô đậu tương, bột cá, NaCl, premix, chế phẩm vi sinh bao

gồm các chủng B subtilis VTX16, B licheniformis VTX18, L plantarum LTX28, S cerevisiae MTX14 và nước Các nguyên liệu đều được nghiền nát và

trộn đều Mỗi công thức thức ăn được thử ở ba mức bổ sung khác nhau (0,5%; 1,0% và 1,5%) chế phẩm tính theo vật chất khô Thức ăn lên men được chứa trong thùng có nắp đậy kín xung quanh để đảm bảo cho quá trình lên men yếm khí

Thức ăn lên men được chứa trong bình 5 kg có nắp đậy kín xung quanh để đảm bảo cho quá trình lên men yếm khí Mỗi công thức thức ăn sẽ được ủ với số lượng như sau: 1 công thức x 3 lần lặp x 2 mốc thời gian (0h, 120h) = 6 bình Sau các khoảng thời gian 0h, 120h, các thức ăn ủ được lấy mẫu để phân tích thành phấn hóa học đánh giá chất lượng thức ăn và xác định tỷ lệ men bổ sung thích hợp

c) Lấy mẫu và phân tích chất khô

Phương pháp lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam năm 2007 (TCVN 4325 – 2007) Lấy mẫu tại thời điểm 0 và 72, 120 giờ sau khi lên men (6 mẫu/thời điểm: 3 mẫu để xác định thành phần dinh dưỡng, 3 mẫu để xác định tỷ lệ tiêu

hóa in vitro) Thức ăn được khuấy đều trong các thùng lên men, sau đó lấy mẫu đại

diện và tiến hành phân tích chất khô theo TCVN-4326-2001 Thức ăn đã sấy khô được bảo quản trong bao bóng buộc kín, sau đó mang mẫu tới phòng thí nghiệm để tiến hành xác định và thành phần và giá trị dinh dưỡng của mẫu thức ăn Thức

ăn đã sấy khô được bảo quản trong bao bóng buộc kín và gửi phân tích tại Phòng thí nghiệm VILAS 929 – VIMCERTS 171 và Phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

d) Đánh giá các chỉ tiêu dinh dưỡng của thức ăn

Mẫu thức ăn cho ăn, mẫu thức ăn thừa được phân tích chất khô (DM), chất hữu cơ (OM), protein thô (CP), xơ thô (CF), mỡ thô (EE) và tro (Ash) được phân tích theo các tiêu chuẩn tương ứng TCVN-4326-2001, TCVN-4328-2007, TCVN-4329-2007, TCVN-4331-2001 và TCVN-4327-2007 Các thành phần xơ

xơ trung tính NDF và xơ axit ADF được xác định theo phương pháp của (Van

Soest et al., 1991) Giá trị GE, DE và ME được ước tính theo NRC (1998)(GE =

4,143 + (56*%EE) + (15*%CP) - (44*%Ash), R2 = 0,98; DE = 949+(0,789*GE)-(43*%Ash)-(41*%NDF), R2 = 0,91; ME = DE*(1,012-(0,0019*%CP), R2 = 0,91)

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức: