Hoàn thiện công nghệ và thiết bị sản xuất rượu vang chất lượng cao

Hoàn thiện công nghệ và thiết bị sản xuất rượu vang chất lượng cao

B.KH&CN VCNTP Bộ khoa học công nghệ Viện Công nghiệp thực phẩm 301 Nguyễn TrÃi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết Khoa học kỹ thuật Đề tài Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme chế biến số nông sản thực phẩm Mà số: KC 04-07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc: PGS TS Ngô Tiến Hiển Đề tài nhánh Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme galactosidase có hiệu suất cao Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống sinh tổng hợp enzyme collagenase ứng dụng thực phẩm Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nớc: TS Trơng Nam Hải Viện Công nghệ sinh học ViƯn Khoa häc vµ kü tht ViƯt Nam 18 Hoµng Quốc Việt Cầu Giấy Hà Nội Hà Nội, 10 2004 Bản quyền: Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Viện trởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Bộ khoa học công nghệ Viện Công nghiệp thực phẩm 301 Nguyễn TrÃi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết Khoa học kỹ thuật Đề tài cấp Nhà nớc Nghiên cøu øng dơng c«ng nghƯ enzyme chÕ biÕn mét số nông sản thực phẩm Mà số: KC 04-07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc: PGS TS Ngô Tiến Hiển Đề tài nhánh cấp Nhà nớc Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme galactosidase có hiệu suất cao Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống sinh tổng hợp enzyme collagenase ứng dụng thực phẩm Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nớc: TS Trơng Nam Hải Viện Công nghệ sinh học – ViƯn Khoa häc vµ kü tht ViƯt Nam 18 Hoàng Quốc Việt Cầu Giấy Hà Nội Hà Nội, 10 2004 Bản thảo viết xong tháng 2004 Tài liệu đợc chuẩn bị sở kết thực đề tài cấp Nhà nớc, Mà số: KC 04-07 Danh sách ngời thực đề tài TS Trơng Nam Hải Viện Công nghệ sinh học CN Trần Minh Trí Viện Công nghệ sinh häc CN Ngun Thanh Thủ ViƯn C«ng nghƯ sinh học ThS Đỗ Thị Huyền Viện Công nghệ sinh học CN Nguyễn Thanh Lịch Viện Công nghệ sinh học CN Lê Thị Thu Hồng Viện Công nghệ sinh học Bài tóm tắt Beta-galactosidaza enzym đợc sử dụng rộng rÃi không nghiên cứu mà đợc sử dụng công nghiệp thực phẩm, y dợc Điển hình trình lên men bơ sữa, beta-galactosidaza đợc bổ sung để tránh khả kết tinh lactoza làm tăng độ sản phẩm, công nghiệp dợc, chúng đợc sử dụng làm thuốc trợ tiêu hoá cho ngời thiếu khả hấp thụ lactoza số bệnh khác Enzyme phổ biến nhiều vi sinh vật đà đợc sản xuất mức độ công nghiệp để ứng dụng Tuy nhiên, việc lên men chủng vi sinh vật để thu enzim gặp khó khăn chủng khả tổng hợp enzim mức độ cao, chế để điều khiển biểu gen mà hoá cho enzim, việc tinh enzim gặp nhiều trở ngại enzim bị lẫn nhiỊu protein cđa vi sinh vËt chđ Tõ nh÷ng khã khăn nêu trên, đà đặt mục đích tạo chủng E coli tái tổ hợp có khả tổng hợp lợng lớn enzim beta-galactosidaza dới điều khiển phiên mà T7promotơ enzim đợc tạo từ chủng tái tổ hợp đợc tinh dễ dàng nhờ cột sắc ký lực Gen mà hoá cho beta-galactosidaza từ E coli ATCC11105 đợc nhân lên PCR đợc đa vào vectơ biểu pET22b(+) sau đợc biến nạp vào chủng E coli BL21 Các dòng biến nạp đợc chọn lọc trực tiếp môi trờng chứa chất Xgal Chúng đà tối u hoá việc tổng hợp enzim từ chủng E coli tái tổ hợp thu đợc lợng lớn enzim beta-galactosidaza Việc tổng hợp enzim đợc kiểm soát chặt chẽ dới cảm ứng IPTG Enzim đợc tổng hợp từ chủng tái tổ hợp có chứa thêm axit amin Histidin Đây trình tự cho phép enzim đợc tinh cách dễ dàng nhờ dùng cột lực gắn đặc hiệu với Histidin Kết đà tạo đợc chế phẩm enzim tái tổ hợp tinh mức độ phòng thí nghiệm Ngợc lại với beta-galactosidaza, enzim collagenaza chØ cã mỈt ë mét sè vi sinh vËt động vật Enzim có nhiều ứng dụng y học nhờ khả phân cắt sợi collagen mô da bị hỏng Tuy nhiên việc tinh enzim từ chủng vi sinh vật mô động vật để ứng dụng gặp nhiều khó khăn Bên cạnh đó, gen mà hoá cho collagenaza từ vi sinh vật cha đợc nghiên cứu nhiều Vì để sản xuất lợng lớn enzim từ chủng tái tổ hợp, điều cần thiết trớc tiên phải phân lập đợc gen mà hoá cho enzim Chủng Bacillus subtilis FS-2 đợc biết có khả tổng hợp collagenza Để phân lập đợc gen, đà tạo ngân hàng hệ gen chủng Bacillus vectơ pUC18 Từ ngân hàng hệ gen đà sàng lọc để chọn dòng plasmid có chứa gen mà hoá cho collagenaza cách cấy trải môi trờng có chứa collagen Kết quả, khoảng gần 10 000 dòng biến nạp đà chọn đợc dòng có khả thuỷ phân collagen Đoạn gen vectơ pUC18 có kích thớc 3Kb đà đợc đọc trình tự so sánh ngân hàng gen quốc tế để tìm khung đọc gen mà hoá collagenaza I Mục lục Mở đầu 1.1 Tỉng quan tµi liƯu 1.1.1 Đại cơng -galactosidase 1.1.2 β-Galactosidaza cña E coli 1.1.3 øng dông cña β-galactosidaza 1.2 phơng pháp 1.2.1 T¸ch chiÕt ADN hƯ gen cđa vi khn E coli ATCC 11105 1.2.2 Nhân gien LacZ mà hoá -galactosidaza b»ng kü thuËt PCR .6 1.2.3 §−a gien LacZ vào vectơ pET-22b(+) .6 1.2.4 Biến nạp ADN plasmit vào tế bào E coli BL21 xung điện 1.2.5 Tách chiết ADN plasmit tõ vi khuÈn E coli 1.2.6 Xö lý ADN plasmit b»ng hai enzym hạn chế Nco I Xho I 1.2.7 Định tính biểu gien môi trờng ®Ỉc 1.2.8 BiĨu hiƯn β-galactosidaza m«i tr−êng láng .8 1.2.9 Tinh prôtêin cột sắc kí lực [8] 1.2.10 Xác định hoạt tÝnh enzym 1.3 Kết thảo luận 1.3.1 ThiÕt kÕ cặp mồi nhân đoạn gen LacZ 1.3.2 Nhân đoạn gen lacZ phơng ph¸p PCRError! Bookmark not defined.0 1.3.3 ThiÕt kÕ vecter biĨu hiƯn pET-22blacZError! Bookmark not defined.0 1.3.4 BiĨu hiƯn gien LacZ E coli BL21Error! Bookmark not defined.3 1.3.5 Tinh s¹ch -Galactosidase phơng pháp sắc ký lựcError! Bookmark not defi 1.3.6 Hoạt tính -Galactosidase tái tổ hợpError! Bookmark not defined 1.4 KÕt luËn 18 TµI LIƯU THAM KH¶O 18 PhÇn 21 với đề tài: Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống sinh tổng hợp enzyme collagenase øng dơng thùc phÈm”.Error! Bookmark not defined 2.1: Tỉng quan Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đại cơng collagenase .Error! Bookmark not defined 2.1.2 Nh÷ng øng dơng cđa collagenase Error! Bookmark not defined 2.2 Vật Liệu phơng pháp nghiên cøu 27 2.2.1 VËt liÖu 27 2.2.2 Phơng pháp 27 2.3 kÕt qu¶ thảo luận .29 2.3.1 T¸ch chiÕt ADN hƯ gien cđa chđng B subtilis 29 2.3.2 ThiÕt lập ngân hàng gien B subtilis FS 2Error! Bookmark not defined 2.3.3 Sàng lọc gien mà hoá Collagenase từ ngân hàng gienError! Bookmark not defined 2.3.4 Nghiên cứu đoạn gen chứa gen mà hoá Collagenase pUCColError! Bookmark n 2.4 KÕt luËn 37 Tµi liƯu tham kh¶o .38 Bảng chữ viết tắt ADN axit deoxiribonucleotit Amp ampixilin ARN axit ribonucleotit bp base pair dNTPs doexiribonucleotide 5’-triphosphates E coli Escherichia coli EDTA etylen diamin tetra acetic acid EtBr ethidium bromide IPTG isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside kb kilo base LB luria-betani medium PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris-Acetate-EDTA TE Tris-EDTA SDS Sodium dodecyl sulphate Mở đầu Ngày nay, với tiến khoa học kỹ thuật, công nghệ ADN tái tổ hợp đạt đợc nhiều thành tựu Việc sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp tạo chủng vi sinh có khả tổng hợp mạnh enzyme để dùng làm giống khởi động mét h−íng chđ u cđa c«ng nghƯ sinh häc hiƯn đại -Galactosidase enzyme đợc nghiên cứu từ năm 50 kỷ trớc Enzyme đợc nghiên cứu kỹ sau Jacob Monod đa mô hình điều khiển operon Lac -Galactosidase đợc tìm thấy nhiều loài động vật, thực vật, nấm vi khuẩn -Galactosidase đợc gọi lactaza chúng có khả phân giải lactoza thành glucoza galactoza Nhờ khả mà -galactosidase đợc sử dụng nhiều ngành công nghiệp nh công nghiệp thực phẩm, y dợc Trong công nghiệp thực phẩm, -galactosidase đợc bổ sung vào trình lên men bơ sữa để tránh kết tinh lactoza tăng độ sản phẩm Trong y dợc, chúng đợc sử dụng làm thuốc trợ tiêu hoá cho ngời thiếu khả hấp thụ lactoza bổ sung cho ngời bị bệnh GM1-gangliosidosis bệnh Morquio típ B suy giảm hoạt tính -galactosidase tế bào Ngoài -galactosidase đóng vai trò làm dấu chuẩn để tách chọn dòng phân tử kỹ thuật ADN tái tổ hợp -Galactosidase đợc ứng dụng kỹ thuật ELISA chúng hoạt động với nhiều chất sinh màu tổng hợp nh ONPG, PNPG, X-gal Ngợc lại, collagenase có số giới hạn sinh vật chủ yếu mô động vật có xơng sống Collagenase đợc nhà khoa học giới đặc biệt quan tâm nghiên cứu ứng dụng rộng rÃi y học nh để chữa vết bỏng, vùng mô bị thoái hoá, Tuy nhiên việc tinh enzyme cho việc ứng dụng gặp nhiều khó khăn đòi hỏi chi phí tốn Từ trở ngại vấn đề đặt cho nhà khoa học làm để thu đợc lợng lớn enzyme cách dễ dàng enzyme có độ tinh cao Bằng kỹ thuật di truyền tái tổ hợp gien, đà tiến hành đề tài Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme - galactosidase có hiệu suất cao Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống sinh tổng hợp enzyme collagenase ứng dụng thực phẩm Đề tài gồm phần sau: (1) nhận đợc gien mà hoá -galactosidase từ chủng vi khuẩn E coli ATCC11105; (2) tạo đợc chủng E coli BL21 tái tổ hợp có khả tổng hợp lợng lớn enzyme -galactosidase , enzyme đợc tinh cách dễ dàng; (3) Nhận đợc ngân hàng gien chủng Bacillus subtilis FS-2, chủng có khả tổng hợp collagenase Đề tài đợc thực Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh học Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chđng gièng b»ng kü tht di trun ®Ĩ sinh tỉng hỵp enzyme β- galactosidase cã hiƯu st cao 1.1 Tỉng quan tài liệu 1.1.1 Đại cơng -galactosidase -Galactosidase (-D-galactoside galactohydrolase E.C 3.2.1.23) enzyme có khả xúc tác cho hai kiĨu ph¶n øng: ph¶n øng chun gèc galactozyl phản ứng thuỷ phân Nhờ khả chuyển gốc galactozyl cđa β-galactosidase mµ lactoza cã thĨ chun thµnh allolactoza, chất cảm ứng tự nhiên operon Lac Phản ứng thuỷ phân -galactosidase thuỷ phân đờng đôi lactoza thành hai đờng đơn glucoza galactoza Ngoài ra, xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết -D-galactosit từ đầu không khử hợp chất hydrocacbon, glycoprotein, galactolipit [5], [6], [11], [15] -Galactosidase từ loài nấm men có nét ®Ỉc tr−ng vỊ mỈt cÊu tróc cịng nh− vỊ khèi lợng phân tử Ví dụ; -Galactosidase Saccharomyces lactis có tiểu đơn vị với khối lợng phân tử 124 kDa, hoạt động đợc 4oC Nhờ mà galactosidase đợc sử dụng công nghiệp thực phẩm chế biến sản phẩm bơ sữa điều kiện lạnh nhằm ức chế sinh trởng loại vi khuẩn -Galactosidase S fragilis có hai tiểu đơn vị, có khối lợng phân tử tơng øng lµ 90 vµ 120 kDa, vµ chøa mét sè ion kim lo¹i nh− Na+, K+ β-Galactosidase cđa S lactis cã häat tÝnh cao nhÊt nång ®é cđa Na+ hay K+ 40-100 mM nồng độ Mn++ 0,1-1mM Hiện nay, ngời ta đà tiến hành tách dòng biểu gien mà hoá -galactosidase nấm men nhằm tạo chủng có khả tổng hợp -galactosidase mạnh đà đạt đợc số kết định [5], [6] -Galactosidase vi khuẩn loại enzyme ngoại bào Sau đợc tổng hợp, đợc tiết môi trờng đợc tiết vào khoang chu chất Đây enzyme thích ứng điển hình, đợc tổng hợp môi trờng có đờng lactoza hay c¸c chÊt cã ... Hải Viện Công nghệ sinh học CN Trần Minh Trí Viện C«ng nghƯ sinh häc CN Ngun Thanh Thủ ViƯn Công nghệ sinh học ThS Đỗ Thị Huyền Viện Công nghệ sinh học CN Nguyễn Thanh Lịch Viện Công nghệ sinh... khoa học công nghệ Viện Công nghiệp thực phẩm 301 Nguyễn TrÃi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết Khoa học kỹ thuật Đề tài cấp Nhà nớc Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme chế biến số nông sản thực... thuật, công nghệ ADN tái tổ hợp đạt đợc nhiều thành tựu Việc sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp tạo chủng vi sinh có khả tổng hợp mạnh enzyme để dùng làm giống khởi động hớng chủ yếu công nghệ sinh