Luận văn tốt nghiệp môn Công nghệ Sinh học
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà SVTH: Nguyễn Quỳnh Trang LOGO Lớp: KS.CNSH 07-01 NỘI DUNG I.TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tiểu đường Dự kiến đến 2030 tăng lên đến 472 triệu người 1.2 Tác hại bệnh tiểu đường 1.3 Thuốc chữa bệnh tiểu đường Thuốc ức chế α-glucosidase ere Meglitimide … Sulphonylurea Metformin 1.4 Cơ chế tác dụng AGIs điều trị tiểu đường Maltose AGIs Starch α-glucosidase Glucose Glucose Blood Glucose AGIs II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu 2.2 Phương pháp nghiên cứu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập Bacillus từ tương Nam Đàn Chủng T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn nhăn thành vịng trịn, mép bờ cưa Màu trắng ngà, bề mặt trơn, mép bờ khơng trịn Màu trắng đục, viền ngồi màu trắng ngà, bề mặt trơn, mép bờ cưa Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn nhăn thành vịng tròn, mép bờ tròn Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn thành vịng trịn giống nhân, mép bờ cưa Màu trắng ngà, bề mặt váng, nhân lồi, mép bờ khơng trịn đều, cưa Màu trắng đục, bề mặt váng, mép bờ khơng trịn đều,hơi cưa Màu trắng ngà, hình hoa tuyết, mép bờ tia hình cây, bề mặt nhăn, gợn Màu trắng trong, phát triển lan theo bề mặt, hình cây, mép bờ tia hình Màu trắng đục, khuẩn lạc tròn, bề mặt gợn, mép bờ cưa Màu trắng đục ngả vàng, viền màu trắng ngà, bề mặt lồi, mép bờ nhăn Kích thước (mm) 7–8 13 – 14 3–4 13 – 14 – T12 Màu trắng đục, bề mặt nhăn, mép bờ khơng trịn 5–6 T13 Màu trắng ngà, bề mặt có váng, mép bờ cưa 3–4 3.6 Tối ưu điều kiện pH 3.7.Tối ưu nồng độ chất Lựa chọn chất Thành phần môi trường Thành phần Khối lượng Hàm lượng Nitơ tổng Cơ chất Hàm luợng Nitơ tổng Cao nấm men 5g Peptone 10g NaCl 5g Agar Nước cất Đậu xanh 32% Đậu đen 28% Đậu tương 34% 15 – 20g Peptone 14% 1000ml Cao nấm men 74% Lựa chọn chất Khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase sử dụng chất đậu tương IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Phân lập 13 chủng từ tương Nam Đàn - Chủng T13 có đường kính vịng thủy phân nhỏ 12mm - Chủng Natto có khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase cao 70,61% - Chủng Natto có khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase cao 40oC (82,23%), pH (83, 73%), sử dụng chất đậu tương với hàm lượng Nitơ 5% (85,75%) 4.2 Kiến nghị - Khảo sát ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh trưởng phát triển khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy chủng Natto - Thu, tách tinh chất kìm hãm để ứng dụng điều trị bệnh tiểu đường Khảo sát định tính khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase Dựa phương pháp đo đường kính vịng thủy phân tạo thành sau cho α-glucosidase thủy phân tinh bột tan đồng thời bổ sung canh trường ni cấy vi khuẩn có chứa chất ức chế enzyme α-glucosidase *Cách tiến hành Môi trường thạch bổ sung tinh bột tan Bổ sung 10 µl enzym αglucosidase vào lỗ Đục lỗ thạch 0,5 cm Bổ sung 10 µl canh trường vi khuẩn ly tâm vào lỗ Đĩa thạch nuôi ủ 300C 24h Lấy nhuộm Lugol Khảo sát định lượng khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase Dựa phương pháp xác định hàm lượng đường glucose tạo thành sau cho α-glucosidase thủy phân tinh bột tan cho thêm canh trường nuôi cấy vi sinh vật chứa chất ức chế α-glucosidase Hàm lượng glucose xác định phương pháp DNS Khi lượng glucose tạo thành giá trị hấp thụ màu phản ứng DNS bước sóng 540nm thấp Hoạt tính ức chê α-glucosidase dựa độ giảm khả hấp thụ màu hỗn hợp * Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase: Hoạt tính ức chế α-glucosidase xác định theo công thức: % ức chế = [Α – (B – C)]/Α.100 (%) (1) Trong đó: A: hàm lượng glucose tạo thành αglucosidase bị thủy phân B: hàm lượng glucose tạo thành sau cho thêm canh trường nuôi cấy vi khuẩn C: hàm lượng đường glucose có sẵn canh trường nuôi vi khuẩn Phương pháp nhuộm bào tử * Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm tế bào vi sinh vật trình hấp phụ Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững Thuốc nhuộm thường dùng chất aminlin (chủ yếu loại kiềm trung tính) Vì thành phần tế bào vi sinh vật khác nên khả bắt màu khác * Cách tiến hành: Trước nhuộm bào tử, tiến hành sốc nhiệt (70oC 10 phút) để lạnh tủ lạnh 2oC ngày, nhằm kích thích vi khuẩn tạo bào tử Sau tiến hành làm tiêu để nhuộm bào tử Làm vết bôi cố định vết bôi cách hơ lửa đèn cồn Nhuộm xanh metylen theo loffler: Nhỏ giọt xanh metylen, hơ nóng đến sơi nhẹ giữ 15 − 20 giây Rửa nước cất, nhuộm lại fucshin giữ khoảng 30 giây Sau rửa nước cất, hơ khô Nhỏ giọt dầu soi quan sát vật kính dầu 100X Kết quả: tế bào bắt màu hồng, bào tử bắt màu xanh Phương pháp nhuộm Gram * Cách tiến hành: Làm vết bôi cố định vết bôi cách hơ lửa đèn cồn Nhỏ giọt tím gential lên vết bôi, giữ khoảng − phút, rửa nước cất, thấm khô Nhỏ dung dịch lugol lên vết bôi, giữ phút rửa cồn, thấm khô (hơ nhẹ lửa đèn cồn) Nhỏ giọt fucshin lên vết bôi, giữ 12 phút Sau rửa nước, thấm khơ Nhỏ giọt dầu soi quan sát vật kính dầu 100X Kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt tím, vi khuẩn Gram (−) bắt màu hồng IC50: The half maximal inhibitory concentration DNJ : 1-deoxynojrimycin α-glucosidase (enzyme EC 3.2.1.20) Trung tâm hoạt động α-glucosidase họ GH13 ... 14% 1000ml Cao nấm men 74% Lựa chọn chất Khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase sử dụng chất đậu tương IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Phân lập 13 chủng từ tương Nam Đàn - Chủng... thuốc nhuộm tế bào vi sinh vật trình hấp phụ Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững Thuốc nhuộm thường dùng chất aminlin (chủ yếu loại kiềm trung tính) Vì thành phần tế bào vi sinh vật khác nên khả... với hàm lượng Nitơ 5% (85,75%) 4.2 Kiến nghị - Khảo sát ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh trưởng phát triển khả sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy chủng Natto - Thu,