Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm

Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………… CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc tồn chitin - chitosan tự nhiên 1.2 Cấu trúc hố học, tính chất lý hoá chitin 1.2.1 Cấu trúc hoá học chitin 1.2.2 Tính chất lý hố chitin 1.3 Cấu trúc hố học, tính chất lý hố sinh độc tính chitosan 1.3.1 Cấu trúc hố học chitosan 1.3.2 Tính chất lý hố chitosan 10 1.3.3 Tính chất sinh học chitosan 11 1.3.4 Độc tính chitosan 11 1.4 Một số ứng dụng chitin chitosan 12 1.5 Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa glucosamin 15 1.6 Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý số muối glucosamin 17 1.6.1 Glucosamin hydroclorua 17 1.6.2 Glucosamin sulfat 17 1.6.3 Acetyl glucosamin 18 1.7 Dược lý dược động học glucosamin muối 18 1.8 Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan 21 1.8.1 Trên giới 21 1.8.2 Tại Việt Nam 23 1.9 Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 25 1.9.1 Quy trình sản xuất glu.HCl Trần Thị Luyến 25 1.9.2 Quy trình sản xuất glu.HCl Đỗ Đình Rãng 25 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29 3.1 Quy trình điều chế chitin, chitosan glucosamin hydroclorua 29 Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm 3.2 Điều chế chitin từ vỏ tôm 30 3.3 Điều chế chitosan cách deacetyl chitin 31 3.4 Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 32 3.4.1 Điều chế glu.HCl từ chitin 32 3.4.2 Điều chế glu.HCl từ chitosan 33 3.4.3 Tinh chế glu.HCl 34 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin 39 3.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin 39 3.7 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin 40 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 4.1 Điều chế chitin từ vỏ tôm 41 4.1.1 Quá trình khử khoáng 41 4.1.2 Quá trình loại bỏ protein………………………………………………………….41 4.1.3 Quá trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin) 42 4.2 Điều chế chitosan 43 4.3 Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 43 4.3.1 Điều chế glu.HCl từ chitin 44 4.3.2 Điều chế glu.HCl từ chitosan 46 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm ĐẶT VẤN ĐỀ Giáp xác nguồn nguyên liệu thủy sản dồi chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cấu mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất chế biến Hàng năm nhà máy chế biến thải bỏ lượng phế liệu giáp xác lớn khoảng 70.000 tấn/năm [3] Nguồn phế liệu nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin 1, chitosan 2, glucosamin sản phẩm có giá trị khác Do việc nghiên cứu phát triển sản xuất sản phẩm từ vỏ tôm quan trọng, để nâng cao giá trị sử dụng phế liệu làm mơi trường Sản phẩm chitin - chitosan có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng thực tế Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo nguyên liệu trung gian cho chất quan trọng chitosan, glucosamin chất có giá trị khác Chitosan có nhiều ứng dụng ngành cơng nghiệp, nơng nghiệp, y dược bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường…Với khả ứng dụng rộng rãi chitin – chitosan mà nhiều nước giới Việt Nam nghiên cứu sản xuất sản phẩm Glucosamin hoạt chất quý sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian chitin chitosan Glucosamin chủ yếu sử dụng y học chữa bệnh thoái hoá khớp Ở người già, chức cấu tạo khớp có nhiều thay đổi, tế bào khớp thoái hoá, trở nên linh động Gân dây chằng phân đoạn, đóng vơi, khơ cằn, trở nên bền bỉ, co dãn, không chịu căng lực dễ bị tổn thương Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khơ nước, rạn nứt với nhiều tinh thể canxi làm khớp đau Khớp co duỗi khó khăn màng hoạt dịch mỏng khô dần [1] Trước đây, điều trị bệnh thối hóa khớp người ta thường dùng thuốc thuộc nhóm corticoid nhóm kháng viêm giảm đau khơng steroid NSAID (Non - Steroidal Anti - Inflammatory Drugs), thuốc thuộc Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tơm nhóm điều trị triệu chứng có nhiều tác dụng phụ Với thuốc thuộc nhóm corticoid thường gây nên tác dụng phụ: loãng xương, viêm loét dày, giảm miễn dịch… Đối với NSAID gây viêm loét dày…[12] Từ thập kỷ 90 người ta phát glucosamin phục hồi sụn khớp, tức chữa nguyên bệnh viêm, thoái hố khớp [2] Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu với nhiều thử nghiệm lâm sàng chứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp glucosamin, dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên Trên thực tế glucosamin thường sử dụng dạng: glucosamin hydroclorua 4, glucosamin sulfat 5, N - Acetyl glucosamin Hiện thuốc chứa glucosamin lưu hành 70 quốc gia Tại Việt Nam, glucosamin thành phẩm từ glucosamin chủ yếu nhập xu sử dụng ngày nhiều Trong nguồn nguyên liệu (vỏ giáp xác) chủ yếu để điều chế glucosamin dồi Để tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh thoái hoá khớp nguyên liệu cho việc nghiên cứu ứng dụng khác glucosamin đặt vấn đề tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm” Mục tiêu đề tài nhằm giải vấn đề sau : Phân lập chitin – chitosan từ vỏ tôm phế thải Điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin chitosan Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Chương I: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc tồn chitin - chitosan tự nhiên Chitin - chitosan polysacharit tồn tự nhiên với sản lượng lớn (đứng thứ hai sau xellulose) Trong tự nhiên chitin tồn động vật thực vật Trong động vật, chitin thành phần cấu trúc quan trọng vỏ số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun tròn Trong động vật bậc cao monome chitin thành phần chủ yếu mô da giúp cho tái tạo gắn liền vết thương da Trong thực vật chitin có thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc, số loại tảo [13] Chitin - chitosan polysacharit có đạm khơng độc, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc chitin tập hợp monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamin) liên kết với cầu nối glucozit hình thành mạng sợi có tổ chức Hơn chitin tồn trạng thái tự luôn nối cầu nối đẳng trị (coralent) với protein, CaCO hợp chất hữu khác Hình : Chitin vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tơm Trong lồi thủy sản đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm cao dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khơ [5] Vì vỏ tơm, cua, ghẹ nguồn nguyên liệu để sản xuất chitin - chitosan Về mặt lịch sử, chitin Braconnot phát vào năm 1821, cặn dịch chiết từ loại nấm Ông đặt tên cho chất “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc Năm 1823 Odier phân lập chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa vỏ giáp, ơng khơng phát có mặt nitơ Cuối Odier Braconnot đến kết luận chitin có dạng cơng thức giống với xellulose 1) O OH 2) O 3) O OH H×nh 2: 1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose 1.2 Cấu trúc hố học, tính chất lý hoá chitin 1.2.1 Cấu trúc hoá học chitin Chitin có cấu trúc tinh thể chặt chẽ đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta chứng minh chitin tồn ba dạng cấu hình :α, β, γ - chitin [15] Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Các dạng chitin xếp khác hướng mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) mạch Có thể biểu diễn mắt xích mũi tên cho phần đầu mũi tên nhóm –CH2OH, phần nhóm –NHCOCH 3, cấu trúc α, β, γchitin mô tả sau: α - Chitin β - Chitin γ - Chitin α - chitin có cấu trúc mạch xếp ngược chiều đặn, nên liên kết hydro lớp hệ chuỗi, cịn có liên kết hydro lớp chuỗi thuộc lớp kề nên bền vững Do mắt xích xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi mặt không gian lượng Đây dạng phổ biến tự nhiên β, γ - chitin mắt xích ghép với theo kiểu song song (β - chitin) hai song song ngược chiều (γ - chitin), lớp khơng có loại liên kết hydro Dạng β - chitin chuyển sang dạng α - chitin nhờ q trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững Qua nghiên cứu thủy phân chitin enzym hay axit HCl đậm đặc người ta thấy chitin có cấu trúc polyme tạo thành từ đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamin liên kết với liên kết β-(1-4) glucozit Công thức cấu tạo chitin: OH O O HO NHCCH3 O Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Tên gọi : Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose; Poly(1-4)-2acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose Công thức phân tử: [C8H13O5N]n Phân tử lượng : Mchitin = (203,09)n 1.2.2 Tính chất lý hố chitin [3] Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy dạng bột, không mùi, không vị, không tan nước, mơi trường kiềm, axit lỗng dung môi hữu ete, rượu …Nhưng tan dung dịch đặc nóng muối thioxianat liti (LiSCN) thioxianat canxi (Ca(SCN) 2) tạo thành dung dịch keo, tan hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan hexafluoroisopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [16] Chitin ổn định với chất oxy hố mạnh thuốc tím (KMnO 4); oxy già (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất mà người ta sử dụng chất oxy hoá để khử màu cho chitin Khi đun nóng dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), nhiệt độ cao chitin bị gốc acetyl tạo thành chitosan: Chitn CH2 OH NHC Khi đun nóng axit HCl đậm đặc, nhiệt độ cao chitin bị cắt mạch thu glucosamin: CH Chitn OH NH Phản ứng este hóa : - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat - Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric pyridin, dioxan N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Bảng 3.6 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng: 0 T ( C) Chitin(g) Glu.HCl(g) Hiệu suất (%) - : không xác định 3.7 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin Tiến hành phản ứng mục 3.4.1, làm bình cầu 250ml (3 lần) với lần 5g chitin, thời gian phản ứng 4giờ, nhiệt độ phản ứng 90 - 95 C thực điều kiện nồng độ axit hydrocloric khác nhau: • Lần 1: Nồng độ axit HCl 10% • Lần 2: Nồng độ axit HCl 20% • Lần 3: Nồng độ axit HCl 36% Kết thu được trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7.Ảnh hưởng nồng độ axit HCl đến hiệu suất phản ứng HCl (%) Chitin (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%) - : không xác định Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 40 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Chương IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Điều chế chitin từ vỏ tơm 4.1.1 Q trình khử khống Trong vỏ tơm, thành phần khống chủ yếu muối CaCO 3, MgCO3 Ca3(PO4)2 Nên người ta thường dùng loại axit HCl, H 2SO4… để khử khống Khi khử khống, dùng HCl cho hiệu cao Nếu dùng H2SO4 tạo muối khó tan nên sử dụng MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4 - Trong trình rửa muối Cl tạo thành rửa trơi, nồng độ axit HCl có ảnh hưởng lớn đến chất lượng chitosan thành phẩm, đồng thời ảnh hưởng lớn tới thời gian hiệu khử khoáng Nếu nồng độ HCl cao rút ngắn thời gian khử khoáng làm cắt mạch có tượng thủy phân liên kết β-(1-4) glucozit để tạo polyme có trọng lượng phân tử trung bình thấp, có bị thủy phân triệt để đến glucosamin Ngược lại nồng độ HCl q thấp q trình khử khống khơng triệt để thời gian xử lý kéo dài ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm Tỷ lệ nguyên liệu lượng axit HCl ảnh hưởng tới hiệu khử khống Vì vậy, chúng tơi chọn dung dịch HCl 10% với tỷ lệ chitin/HCl w/v = 1/5 thời gian khử khoáng 12 (qua đêm) để đảm bảo q trình khử khống xảy hồn tồn Sau khử khống chúng tơi tiến hành rửa trung tính, cơng đoạn có tác dụng rửa trôi hết muối, axit dư tan nước Quá trình rửa kết thúc dịch rửa cho pH=7 4.1.2 Q trình loại bỏ protein Sau có vỏ tơm loại khống, chúng tơi tiến hành loại bỏ hồn toàn protein dung dịch NaOH 3%, protein bị kiềm thủy phân thành amin tự Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược Hoá Chất BVTV K47 41 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tơm tan loại theo quy trình rửa trôi Lượng NaOH 3% cho vào đến ngập tồn vỏ tơm kiểm tra pH = 11 - 12, để đảm bảo việc loại bỏ protein hoàn toàn Đun nhiệt độ 90 - 95 C khoảng 3,5 - (trong trình đun lưu ý vấn đề trào dung môi tạo bọt nhiều mùi bay khó chịu) Sản phẩm sau đun rửa nước thường nước cất đến pH = Tiếp chúng tơi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục đích rửa trơi hết muối natri, amin tự NaOH dư Sấy khô 60 C, thu chitin thơ 4.1.3 Q trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin) Chitin thơ thu có màu hồng nhạt cịn sắc tố astaxanthin Do chitin ổn định với chất oxy hố thuốc tím (KMnO 4), oxy già (H2O2), nước javen (NaOCl+NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3,…cho nên sử dụng KMnO4, H2O2 để khử màu cho chitin • Cách 1: Dùng hỗn hợp KMnO4 1% + C2H2O4 1% để tẩy màu Trước tiên cho chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tơm) vào cốc thuỷ tinh, sau cho dung dịch KMnO4 1% (10ml) vào, khuấy đảo cho toàn chitin ngấm dung dịch KMnO4 1%, để nhiệt độ phòng thời gian Hỗn hợp rửa sạch, sản phẩm chitin lúc có màu tím KMnO Để loại màu tím sử dụng 50ml axit oxalic 1% ((COOH)2), để tăng nhanh khả tẩy màu đun nóng hỗn hợp dung dịch nhiệt độ 50 - 60 C đến chitin có màu trắng hồn tồn 2+ Theo cách số tác giả sản phẩm phản ứng có tạo Mn , mà chitin - chitosan có nhóm –NHCOCH nhóm –NH2, nhóm 2+ tạo phức với Mn gây tượng khâu mạch làm ảnh hưởng đến phản ứng chuyển hố • Cách 2: Dùng H2O2 1% để tẩy màu Chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tôm) cho vào cốc thuỷ tinh, sau cho 60ml dung dịch H 2O2 1% vào ngập toàn chitin, để qua đêm nhiệt độ phịng Chitin thu có màu trắng phớt hồng Chúng dùng H2O2 với nồng độ