Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - NGÔ MINH KHOA NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CHIẾT XUẤT FLAVONOID TỪ VỎ CỦ HÀNH TA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - NGÔ MINH KHOA Mã sinh viên: 1501247 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CHIẾT XUẤT FLAVONOID TỪ VỎ CỦ HÀNH TA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thu Hằng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo PGS TS NGUYỄN THU HẰNG, Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội Cô người thay đổi nhận thức dược liệu, người truyền cho tinh thần khoa học lửa đam mê nghiên cứu cháy bỏng Với tôi, cô không người thầy tận tâm truyền đạt bảo tri thức, cịn người thân ln tận tình đồng cảm, lo lắng động viên tơi trước khó khăn thử thách sống Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Văn Phương, người ln đồng hành, dìu dắt tơi từ ngày suốt thời gian may mắn tham gia nghiên cứu khoa học môn Dược liệu Không người cho lời khuyên q trình thực nghiệm khoa học, anh cịn người anh trai sẵn sàng chia sẻ vấn đề dù nhỏ Tôi xin cảm ơn hướng dẫn tận tình GS TS Phan Kế Lộc ThS Nguyễn Anh Đức, thầy giúp đỡ nhiều công việc giám định tên khoa học lưu tiêu mẫu Để hoàn thành khóa luận này, tơi xin cảm ơn thầy cô công tác môn Dược liệu thầy cô Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập nghiên cứu trường Tôi xin chân thành cảm ơn đến anh chị sinh viên khóa 69 bạn sinh viên khóa 70 làm đề tài mơn chia sẻ kinh nghiệm quý báu giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến bố mẹ, anh chị, người bạn ln động viên, khích lệ để tơi đạt kết Hà Nội, tháng năm 2020 Sinh viên, Ngô Minh Khoa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan củ hành ta 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố thứ Allium cepa var aggregatum G.Don 1.1.2 Thành phần hóa học củ hành ta 1.1.3 Tác dụng sinh học củ hành ta 1.1.4 Công dụng 10 1.1.5 Các nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ củ hành ta 10 1.2 Tổng quan phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất dược liệu 11 1.2.1 Phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) 11 1.2.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Hóa chất, thiết bị, phần mềm 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ củ hành ta 20 2.3.2 Phương pháp chiết xuất 20 2.3.3 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta 21 2.3.3.1 Các yếu tố khảo sát thông số đánh giá 21 2.3.3.2 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 22 2.3.4 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro cao chiết vỏ củ hành ta 24 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ củ hành ta 26 3.2 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) 28 3.3 Kết tối ưu hóa q trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 36 3.3.1 Kết thiết kế thí nghiệm tiến hành thực nghiệm 36 3.3.2 Kết tối ưu hóa q trình chiết xuất 37 3.4 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mẫu cao vỏ củ hành ta chiết xuất điều kiện tối ưu 48 3.5 Kết nâng cấp quy mô chiết xuất 48 3.6 Bàn luận 49 3.6.1 Về nguyên liệu vỏ củ hành ta 49 3.6.2 Về kết tối ưu hóa q trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta 50 3.6.3 Về tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro cao chiết vỏ củ hành ta 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT IC50 Nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym A Chênh lệch độ hấp thụ mẫu thử mẫu trắng UV-Vis Quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến OFAT Phương pháp khảo sát thay đổi yếu tố DoE Phương pháp thiết kế thí nghiệm RSM Phương pháp bề mặt đáp ứng CCD Mơ hình phức hợp trung tâm ANOVA Phương pháp phân tích phương sai XO Xanthin oxidase LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MLR Hồi quy tuyến tính đa biến ANN Mạng neuron nhân tạo Y1 Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết (mg/g) Y2 Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu (%kl/kl) X1 Nhiệt độ chiết xuất X2 Thời gian chiết xuất X3 Dung môi chiết xuất MLR1 Mơ hình biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ ethanol đến Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết xây dựng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến MLR2 Mơ hình biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ ethanol đến Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu xây dựng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến ANN1 Mơ hình biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ ethanol đến Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết xây dựng phương pháp mạng neuron nhân tạo ANN2 Mơ hình biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ ethanol đến Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu xây dựng phương pháp mạng neuron nhân tạo DANH MỤC CÁC BẢNG STT Kí hiệu Tên bảng Trang 1.1 Cấu trúc hợp chất flavonoid củ hành ta 2.1 Cách bố trí hỗn hợp phản ứng giếng 25 Tóm tắt kết thẩm định phương pháp phương pháp xác 3.1 định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ củ 25 hành ta 3.2 Ma trận thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 36 3.3 Kết đánh giá mơ hình MLR1 MLR2 ANOVA 39 3.4 Kết phân tích thống kê hai mơ hình MLR1 MLR2 39 3.5 Kết đánh giá độ phù hợp dự đoán thực nghiệm mơ hình MLR1 MLR2 41 3.6 3.7 10 3.8 11 3.9 Điều kiện tối ưu biến đầu vào 46 12 3.10 Kết kiểm định thực nghiệm 47 13 3.11 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mẫu cao chiết xuất điều kiện tối ưu 48 14 3.19 Kết nâng cấp quy mô chiết xuất 49 Kết đánh giá mơ hình xây dựng phương pháp ANN Kết đánh giá độ phù hợp dự đốn thực nghiệm mơ hình ANN1 ANN2 Kết so sánh mơ hình xây dựng hai phương pháp MLR ANN 43 44 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ STT Kí hiệu Tên hình Sơ đồ bước tối ưu hóa q trình chiết xuất sử dụng Trang 1.1 1.2 Mơ hình Box-Behnken cho biến đầu vào 15 1.3 Mơ hình phức hợp trung tâm CCD cho biến đầu vào 15 2.1 Ảnh chụp hành ta 18 2.2 Ảnh chụp củ hành ta 18 2.3 Ảnh chụp lớp vỏ củ hành ta 18 2.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất vỏ củ hành ta 21 3.1 3.2 Kết khảo sát kích thước dược liệu 29 10 3.3 Kết khảo sát lượng dung môi 30 11 3.4 Kết khảo sát số lần chiết 31 12 3.5 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 32 13 3.6 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 33 14 3.7 Kết khảo sát dung môi chiết xuất 34 15 3.8 16 3.9 phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Hình ảnh phổ UV-Vis quercetin (tạo phức màu với nhôm clorid) Mơ hình MLR1 MLR2 biểu diễn dạng đồ thị 3D Mơ hình ANN1 ANN2 biểu diễn dạng đồ thị 3D 13 27 38 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Hành ta (Allium cepa var aggregatum G.Don) loại thực phẩm gia vị sử dụng phổ biến Việt Nam Nhờ điều kiện khí hậu thuận lợi nhu cầu sử dụng lớn, hành ta trồng lấy củ với sản lượng lớn nhiều vùng nước Không loại trồng mang lại giá trị kinh tế cho người dân, củ hành ta đối tượng quan tâm nhà nghiên cứu dược liệu với tác dụng hạ đường huyết, hạ lipid máu, chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, [22], [27], [30] Thành phần hóa học củ hành ta flavonoid - nhóm polyphenol tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh [15] Flavonoid củ hành tập trung chủ yếu lớp vỏ ngoài, phần lớn quercetin dẫn chất [48] Quercetin đánh giá flavonoid có hoạt tính mạnh với tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch, chống viêm, chống dị ứng đáng ý hoạt tính ức chế mạnh rõ rệt xanthin oxidase - enzym chìa khóa bệnh gút [7], [12], [57] Với tác dụng trên, số sản phẩm từ quercetin phát triển giới sử dụng hỗ trợ phòng điều trị bệnh gút Mặc dù lớp vỏ củ hành ta giàu quercetin dẫn chất chưa có nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng dịch chiết vỏ ngồi củ hành ta hoạt tính enzym xanthin oxidase [48] Do đó, nhóm nghiên cứu Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội tiến hành khảo sát ảnh hưởng dịch chiết lớp vỏ ngoài, phần ruột toàn củ hành ta hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro Kết bước đầu cho thấy cao chiết methanol vỏ củ hành ta thể tác dụng ức chế xanthin oxidase mạnh vượt trội so với phần ruột toàn củ (giá trị IC50 cao chiết lớp vỏ ngồi đạt 21,09 µg/ml phần ruột tồn củ có giá trị IC50 lớn 300 µg/ml) Từ gợi ý nghiên cứu vỏ củ hành ta theo định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase để phát triển sản phẩm phòng điều trị bệnh gút hướng triển vọng Tuy nhiên, trình nghiên cứu phát triển thuốc thảo dược q trình phức tạp, chiết xuất dược liệu giai đoạn có ảnh hưởng định đến thành phần, chất lượng tác dụng điều trị sản phẩm cuối Vậy nên, để thực hóa việc phát triển sản phẩm phịng điều trị bệnh gút từ vỏ củ hành ta, việc nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ dược liệu bước thiết yếu cần tiến hành Mặc dù vậy, giới chưa có nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta Vì lý trên, đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta” thực với ba mục tiêu: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mẫu cao vỏ củ hành ta chiết xuất điều kiện tối ưu Nâng cấp quy mô chiết xuất lên 20 lần đánh giá độ ổn định quy trình 57 Zhang, C et al (2018), “Mechanistic insights into the inhibition of quercetin on xanthine oxidase”, Int J Biol Macromol., vol 112, pp 405–412 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hợp chất hữu chứa lưu huỳnh tinh dầu củ hành ta Phụ lục 2: Các saponin củ hành ta Phụ lục 3: Các thuật ngữ thường sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Phụ lục 4: Kết thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ củ hành ta Phụ lục 5: Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) Phụ lục 6: Biên giám định tên khoa học PHỤ LỤC Các hợp chất hữu chứa lưu huỳnh tinh dầu củ hành ta Ký hiệu Tên hợp chất Cấu trúc hóa học TLTK 10 3,4-dimethylthiophen [45] 11 Methyl propyl disulfid [31], [45] 12 Methyl 1-propenyl disulfid [45] 13 14 15 16 17 18 (cis)-2-ethyl-3methyltetrahydrothiophen (trans)-2-ethyl-3methyltetrahydrothiophen (cis) 1-propenyl propyl disulfid (trans) 1-propenyl propyl disulfid Dipropyl disulfid 3-ethyl-3,4-dihydro-1,2dithiin [45] [45] [10], [11] [10], [11] [31], [45] [45] 19 20 21 22 3-ethyl-3,6-dihydro-1,2dithiin (cis) 3,5-dimethyl-1,2,4trithiolan (trans) 3,5-dimethyl-1,2,4trithiolan (trans) 1-propenyl ethyl trisulfid [45] [45] [45] [45] 23 (cis) 1-propenyl ethyl trisulfid [45] 24 Dipropyl trisulfid [31], [45] 25 Methyl propyl trisulfid [31] 26 (cis) 3,5-diethyl-1,2,4trithiolan [45] PHỤ LỤC Các saponin củ hành ta Ký hiệu Tên hợp chất, cấu trúc hóa học TLTK 26 Ascalonicosid A1 [15] 27 Ascalonicosid A2 [15] 28 Ascalonicosid B [15] 29 Ascalonicosid C [23] 30 Ascalonicosid D [23] 31 Dichotomin [23] 32 Parisaponin I [23] PHỤ LỤC Các thuật ngữ thường sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) - Biến đầu vào (hay biến độc lập, yếu tố): Là thơng số q trình điều kiện tiến hành có tác động đến đáp ứng q trình, kiểm sốt người tiến hành nghiên cứu Ví dụ: nhiệt độ chiết xuất, thời gian phản ứng,… - Biến đầu (hay biến phụ thuộc, đáp ứng): Là kết thí nghiệm đặc tính chất lượng sản phẩm tương ứng với giá trị biến đầu vào Ví dụ: hiệu suất chiết xuất, hàm lượng hoạt chất,… - Bề mặt đáp ứng: Là đồ thị 3D biểu diễn thay đổi đáp ứng theo yếu tố đầu vào - Mơ hình: Là phương trình biểu diễn mối quan hệ biến đầu với nhiều biến đầu vào Trong phương pháp RSM, phụ thuộc biến đầu với biến đầu vào biểu diễn nhiều dạng mơ hình khác nhau, phổ biến mơ hình tuyến tính hay mơ hình bậc (linear or first-order model); mơ hình tương tác (first-order model with interaction) mơ hình bậc hai (second-order model) - Tối ưu hóa: Tối ưu hóa q trình việc xác định giá trị biến đầu vào cho đáp ứng q trình đạt giá trị tốt theo mục tiêu mong muốn người thực nghiên cứu - Hàm mục tiêu (hàm kỳ vọng): Là hàm số lập sở mục tiêu tối ưu lựa chọn Hàm mục tiêu hàm thể kết mà người thực nghiên cứu cần đạt - Mức yếu tố: Là mức giá trị biến đầu vào tương ứng thiết kế thí nghiệm PHỤ LỤC Kết thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ củ hành ta Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống đánh giá khả hoạt động quy trình phân tích bao gồm thiết bị, dụng cụ, mẫu thử phương pháp thử [20] Độ phù hợp hệ thống đánh giá cách đo mật độ quang dung dịch thử lần Bảng Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống phương pháp Phép thử Độ hấp thụ Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0,565 0,566 0,567 0,568 0,567 0,570 Trung bình 0,5672 Độ lệch chuẩn (SD) 0,0017 Độ lệch chuẩn tương đối 0,30% (RSD) Nhận xét: Phương pháp định lượng đảm bảo độ phù hợp hệ thống với giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giá trị lần đo đạt 0,30% nằm giới hạn yêu cầu (