GI{Í THIỆU HỆ ENZYME AMYLASE

6 1.GIỚI THIỆU HỆ ENZYME AMYLASE Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lónh vực kinh tế quốc dân khác. Đặc biệt là trong các ngành công nghiệp thực phẩm. Những nghiên cứu thực nghiệm về enzyme nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học Nga - Viện só K.S Kirhof, ông đã nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dòch chiết đại mạch nẩy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Mười chín năm sau, tức là vào năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột từ đại mạch nẩy mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dòch chiết malt và thu được enzyme ở dạng bột, đồng thời đặt tên là diaslase (xuất phát từ chữ Hi Lạp có nghóa là phân giải). Sau này theo đề nghò của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dòch tiêu hoá của người và động vật, trong hạt nẩy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Bây giờ, người ta thu nhận chúng chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm sợi và một số loài nấm men. Ở các nước phương đông, nhất là Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam nhân dân đã biết sử dụng amylase từ vi sinh vật hàng ngàn năm nay. Amylase có thể thuỷ phân hạt tinh bột chưa qua hồ hoá cũng như hạt tinh bột đã hồ hoá. Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α- amylase, β- amylase, γ- amylase (hay glucoamylase) thuỷ phân các liên kết α- 1,4 –glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide đồng loại. Các amylase còn lại dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase (dextrinase) thuỷ phân các liên kết α- 1,6 – glucoside . Sáu loại enzyme này được xếp thành hai nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase: gồm có α- amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia làm hai loại: loại khử trực tiếp là pullulanase (hay dextrin-6- glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và 7 amylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thuỷ phân các liên kết bên trong chuỗi polysaccharide. Exoamylase: gồm có β- amylase và γ- amylase. Đây là những enzyme thuỷ phân tinh bột từ đầu không khử của chuổi polysaccharide. Các dạng amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn đònh với nhiệt. Tốc độ phản ứng của amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và mức độ polymer hoá của cơ chất. Các enzyme amylase từ các nguồn khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân khác nhau. Amylase từ các nguồn khác nhau sẽ có thành phần, tinh chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thuỷ phân khác nhau. Những nghiên cứu về amylase đã đặt nền móng cho việc sản xuất các chế phẩm enzyme này và là cơ sở khoa học để sử dụng chúng trong sản xuất và đời sống. Những nghiên cứu cơ bản và ứng dụng này ngày càng được xúc tiến mạnh mẽ hơn và đang mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn hơn với việc ứng dụng amylase trong các ngành kinh tế quốc dân. Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng tích luỹ một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác đònh. Từ lâu người ta đã biết sử dụng các loại enzyme từ hạt nẩy mầm để sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia), … hoặc sản xuất các hỗn hợp bột enzyme gồm amylase và protease để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho trẻ em, người già, những người bò suy tiêu hoá. Hạt ngũ cốc được cho nẩy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp để giữ nguyên hoạt tính của enzyme được gọi là malt. Malt có thể được sản xuất từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại mạch, lúa, ngô, đậu … Amylase được thu nhận từ hạt nẩy mầm, nấm mốc, mấn men, vi khuẩn. Trong đó amylase được thu nhận từ malt với lượng nhiều nhất, chủ yếu 8 dùng trong sản xuất bia. Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme amylase. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi vì các loài khác nhau và thậm chí các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzyme khác nhau. Chẳng hạn trong số 278 loài Aspergillus được tiến hành thử nghiệm thì chỉ có 34 loài tạo α- amylase và maltase với lượng đáng kể. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẫn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus. Nhiều loại thuộc các giống này (Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. usamii, Asp. awamori, Asp.batatae; Rh. delamar, Rh. lonnesis, Rh. neveus, Rh. japonicum, Rh.fokinensis, Rh.lopninensis) và một số loài của Neurospora và Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ không chỉ α- amylase mà cả glucoamylase. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces. Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylase. Đặc biệt là người ta đã tuyển chọn được chủng Endomycopsis species 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ glucoamylase, α- amylase, glucoziltransferase và invertase. Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như Bac. polymyxa, Phytomonas destructans, Bact. Cassavanum, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila, …Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh 4 – 6 lần vi khuẩn ưa ẩm và phát triển tốt ở nhiệt độ khá cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bò nhiễm vi sinh vật khác. Những vi khuẩn ưa nhiệt tạo nhiều amylase đáng chu ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermophilus, Bac. coagulans, Bac. circulans. Đặc biệt, Bac. circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65 – 70 0 C và tạo amylase mạnh nhất ở 50 0 C. Trong số vi khuẩn ưa ẩm tạo amylase mạnh, thì Bac. subtilis được nghiên cứu chu đáo hơn cả và được sử dụng rộng rãi nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bac. subtilis là 37 0 C. Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng 9 có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ α- amylase hoạt động ở 65 0 C cùng với protease và các enzyme khác. 2. TÍNH CHẤT CỦA HỆ ENZYME AMYLASE 2.1 Hoạt lực của các enzyme amylase Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của nó. Các chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa một loại enzyme amylase. Vì vậy hoạt lực tổng hợp của chúng phản ánh tác dụng của tất cả các amylase có trong chế phẩm. Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào cơ chất và phương pháp xác đònh mà người ta có thể biết được sự có mặt của một enzyme nhất đònh nào trong chế phẩm bằng cách gián tiếp. Cần nhớ rằng, mọi hoạt độ của chế phẩm enzyme đều không phải là một đại lượng tuyệt đối, mà chỉ là cách biều thò qui ước của hoạt lực xúc tác thu được trong những điều kiện thực nghiệm đã cho mà thôi. Do tính đa dạng của enzyme, đặc tính của cơ chất sử dụng, nên phương pháp xác đònh hoạt độ của enzyme cũng rất khác nhau. Chẳng hạn như ta biết, α- amylase dễ dàng thuỷ phân tinh bột thành các dextrin không cho màu với iode, còn glucoamylase lại phân giải tinh bột tới glucose và làm thay đổi màu với iode chậm, vì lẽ trong dung dòch luôn có một lượng nhỏ dextrin phân tử lớn. Do vậy mà người ta đánh giá sự có mặt của α- amylase trong chế phẩm (hoặc canh trường vi sinh vật) bằng sự thay đổi màu với iode, còn đánh giá sự có mặt của glucoamylase bằng sự tích tụ glucose. mặc dù rõ ràng là hiện diện đồng thời của cả hai enzyme này đã làm tăng hiệu quả phân giải. Hoạt độ thật của từng enzyme một thấp hơn so với số liệu thu được. Cho nên, nếu như ta làm việc với một chế phẩm phức hợp thì phải luôn luôn xác đònh hiệu lực tác dụng tổng hợp của mọi amylase lên cơ chất và nghóa là chỉ thu được đặc tính của chế phẩm một cách gián tiếp qua hoạt độ tuyệt đối của nó. Để xác đònh hoạt độ của các enzyme amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau: -Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dòch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bò cắt ngắn, độ nhớt dung dòch 10 giảm dần. -Đo mật độ quang của dung dòch sau khi thực hiện phản ứng màu với iode. Khi có amylase tác dụng thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau đối với iode. -Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất. Đáng chú ý hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau: +Hoạt độ amylase (HĐA) đặc trưng cho khả năng thuỷ phân tinh bột bởi các enzyme amylase (chủ yếu là của α- amylase) tới dextrin cho màu với iode khác với màu của tinh bột ban đầu. Hiện nay phương pháp so màu quang điện của Rukliadeva và Goriatreva (1985) được xem là phương pháp xác đònh hoạt độ amylase tiêu chuẩn. Theo phương pháp này, đơn vò HĐA là lượng enzyme xúc tác thuỷ phân 1g tinh bột tan ở 300C, trong một giờ với pH xác đònh ( đối với chế phẩm enzyme của nấm mốc, của vi khuẩn thì pH = 4.7 còn đối với α- amylase của malt hay thóc mầm thì pH = 4.8 – 4.9) mức độ thuỷ phân cơ chất xấp xỉ 30%. +Hoạt độ glucoamylase (HĐGl) đặc trưng cho khả năng của chế phẩm thuỷ phân tinh bột đến glucose. Muốn xác đònh HĐGL cần đo được lượng glucose tạo thành. Glucose trong hỗn hợp các đường thường được xác đònh bằng các phương pháp đặc hiệu như phương pháp Zikhetar – Bleyer hoặc phương pháp dùng glucooxydase. Đơn vò hoạt độ glucoamylase là lu7ọng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở 300C và pH tối thích trong một giờ tạo ra 1mg glucose (xác đònh bằng phương pháp Zikhetar – Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải phóng được 1micromol glucose (xác đònh bằng phương pháp glucooxydase). +Hoạt độ đường hoá (HĐĐH) phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hoá tinh bột đến các đường khử. Đơn vò hoạt độ đường hoá là lượng chế phẩm enzyme trong một giờ ở 300C và pH thích hợp làm phân giải được 1g tinh bột thành đường khử khi mức độ thuỷ phân cơ chất không vượt quá 30%. +Hoạt độ maltase (HĐM) đặc trưng cho khả năng thuỷ phân maltose tới glucose của chế phẩm enzyme. Đơn vò hoạt độ maltose là lượng chế phẩm enzyme 11 phân giải được 1g maltose tới glucose trong vòng 1 giờ ở 300C, độ thuỷ phân maltose trong phản ứng này không vượt quá 30%. +Hoạt độ dextrinase (HĐDEX) đặc trưng cho khả năng thuỷ phân các dextrin tới hạn tới đường khử của chế phẩm enzyme. Đơn vò hoạt độ dextrinase là lượng mg cơ chất (phospho-dextrin tới hạn) bởi thuỷ phân 1g hay 1 mol chế phẩm enzyme trong một giờ ở 300C. Hiện nay người ta không dùng hoạt độ này để đánh giá các chế phẩm enzyme nữa. 2.2 CƠ CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen a. Tinh bột Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì, … trong các loại ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylose và amylopectin. Các loại tinh bột đều có 20 – 30% amylose và 70 – 80% amylose. Trong thực vật, tinh bột được xem như là chất dự trữ năng lượng quan trọng. Ví dụ, tinh bột có trong củ và hạt quả được xem như là chất dự trữ năng lượng cho quá trình nẩy mầm, tinh bột củ được xem như chất dự trữ cho cây khi gặp khó khăn và cho cả quá trình nẩy mầm (củ khoai tây, khoai mì, khoai lang …) Amylose có trong lượng phân tử 50.000 – 160.000, được cấu tạo từ 200 – 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylopectin có trong lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu, được cấu tạo từ 600 đến 6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α- 1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn hợp dòch tinh bột bò đun 12 nóng (60 – 850C) thì tinh bột sẽ bò hồ hoá và được gọi là hồ tinh bột. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bò thuỷ phân do các liên kết glucoside bò phân cắt. Sự thuỷ phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai mức độ dòch hoá và đường hoá. Kết quả của sự dòch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bò đường hoá thì sản phẩm sẽ là maltose và glucose. Carbohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã đưuọc chuyển hoá thành disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột b. Glycogen Glycogen là một loại carbohydrate được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hoá để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hoá glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4 glucoside. Ở các vò trí phân nhánh glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Glycogen có mạch nhánh nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu – 3 triệu. glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hoá chúng thành chất béo để dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan. 2.3 ĐẶC TÍNH VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG a. α-Amylase (1,4 - α-glucan 4-glucanhydrolase)(EC 3.2.1.1) b. β-Amylase (1,4 - α-glucan-maltohydrolase)(EC 3.2.1.2) c. Glucoamylase (α-1,4-glucan-glucohydrolase)(EC 3.2.1.3) d. Dextrinase e. Maltase f. Pullulanase g. Transglucosyldase . 6 1.GIỚI THIỆU HỆ ENZYME AMYLASE Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công. glucoside . Sáu loại enzyme này được xếp thành hai nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase: gồm có α- amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh