Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase

Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng trichoderma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***OOO***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE

TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA

NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002-2006

SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NHƯ HIẾN

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 8/2006

LỜI CẢM TẠ

Em xin chân thành cảm tạ:

 Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

 Ths Vương thị Việt Hoa đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Cô Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận và thực hiện đề tài

 Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

 Ban chủ nhiệm, Thầy Cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm

 Các Anh Chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập tốt nghiệp

 Các bạn bè của lớp công nghệ sinh học khóa 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

 Các bạn bè ngoài lớp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp

Sinh viên thực hiện Nguyễn như Hiến

 Đề tài được thực hiện trên đối tượng vi nấm Trichoderm sp gồm 3 chủng D13,

D14, D16 Chúng là vi nấm phân bố rộng rãi trong đất, có nhiều hệ enzyme

(cellulase, amylase…) Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá hoạt lực hệ enzyme amylase của các chủng này (được cung cấp bởi phòng thí nghiệm

trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên), để từ đó bổ sung vào các ứng dụng: công nghệ thực phẩm, công nghệ dệt, xử lý môi trường…đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào trong thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học

 Những kết quả đạt được

Chọn ra được chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải

cao

Khảo sát được các yếu tố ảnh hưởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi

trường nuôi cấy (thời gian, nhiệt độ, pH)

II Tổng quan tài liệu 10

2.1 Giới thiệu về tinh bột 10

2.2 Quá trình thuỷ phân tinh bột 10

2.3 Giới thiệu về nấm Trichoderma 17

2.3.1 Phân loại-Đặc điểm về hình thái 17

2.3.2 Đặc điểm về sinh lý, sinh hoá 18

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

3.2.3 Phương pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase 22

3.2.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đối vối enzyme amylase 23

3.2.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối vối enzyme amylase 24 3.2.6 Phương phàp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase.( Phương pháp Heinkel ) 24

IV KẾT QUẢ 28 4.1 Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 28

4.2 Kết quả định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc bậc 3 của Enzyme Amylase 14

Hình 2.2 Quá trình thủy phân Amylose 15

Hình 2.3 Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen 16

Hình 2.4 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma 18

Hình 2.5 Trichoderma harzianum KRL – AG2 phát triển trên môi trường PGA 18

Bảng 3.5 Các dung dịch của đồ thị tiêu chuẩn 27

Bảng 4.1 Kết quả đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 28

Bảng 4.2 Kết quả đo đường kính vòng phân giải sau 66 giờ 29

Bảng 4.3 Kết quả đo đường kính vòng phân giải sau 84 giờ 30

Bảng 4.4 Kết quả đo OD của đồ thị tiêu chuẩn 31

Bảng 4.5 Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy 32

Bảng 4.6 Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy 34

Bảng 4.7 Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy 36

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13 39

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13 41

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1 Kết quả đo đường kính vòng phân giải sau 66 giờ 29

Đồ thị 4.2 Kết quả đo đường kính vòng phân giải sau 84 giờ 30

Đồ thị 4.3 Đường chuẩn 31

Đồ thị 4.4 Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy 33

Đồ thị 4.5 Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy 35

Đồ thị 4.6 Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy 37

Đồ thị 4.7 Hoạt độ Enzyme Amylase của 3 chủng D13, D14, D16 38

Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13 40

Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13 42

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Do áp lực kinh tế, việc tận dụng hiệu quả hơn nguồn thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng thấp cho gia cầm ngày càng gia tăng Mặt khác, các quy định trong sản xuất thức ăn gia súc không cho phép sử dụng bất kỳ hoá chất hay thuốc khích thích nhằm tăng trưởng gia súc, nâng cao năng suất vật nuôi Một phương pháp phổ biến đang được khuyến khích sử dụng rộng rãi để giải quyết vấn đề này là bổ sung các hệ

enzyme thủy phân vào thức ăn gia súc nhằm tăng cường sự tiêu hoá và hấp thu các

chất dinh dưỡng khó tiêu, hoặc loại bỏ các nhân tố kháng dinh dưỡng

Một trong những nguồn enzyme đáng chú ý là hệ enzyme từ vi nấm

Trichoderma sp vi nấm này có nguồn enzyme phong phú, có hoạt lực mạnh và được

sử dụng nhiều mục đích khác nhau, chúng được ứng dụng trong các lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, xử lý môi trường… đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học

Enzyme amylase là một enzym thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác thủy giải liên kết glucosid trong tinh bột Enzyme amylase cũng đã được nghiên cứu và khảo sát

một cách có hệ thống về các đặc điểm và cũng được phân lập và tách chiết từ nhiều nguồn khác

nhau như: từ thực vật ( từ mầm mạch, mầm đậu tương …), từ vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm Aspegillus oryzae …)

Góp phần vào định hướng nêu trên, được sự ủng hộ của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và khoa Công Nghệ Thực Phẩm chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng nấm Trichoderma sp”

1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

1 Chọn chủng Trichoderma sp có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao 2 Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase tách chiết từ môi trường nuôi cấy Trichoderma

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về tinh bột

Tinh bột là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quan trọng tích lũy trong cũ, quả, hạt( lúa: 60-80%; ngô: 65-75%; khoai tây: 12-20% …)

Trong thực vật tinh bột tồn tại dưới dạng hạt tinh bột, đường kính 0,002-0,15 mm Các loại thực vật khác nhau chứa các hạt tinh bột có hình dạng và kích thước khác nhau

 Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đường đơn nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside và α -1,6 glycoside Amylopectin cho màu tím đỏ với Iod Trọng lượng phân tử thường là vài triệu

Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15 - 25% Amylose và 75 - 85% Amylopectin

2.2 Quá trình thủy phân tinh bột 2.2.1 Giới thiệu về enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein Nó cho phép các phản ứng cần thiết cho sự sống và sự sinh sản của tế bào diễn ra với tốc độ cao và với tính chất đặc thù là không tạo ra các sản phẩm phụ như ở các phản ứng thông thường Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật, không chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào( invitro)

a) Tính chất hóa - lý do enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng có những tính chất như các protein

 Khi hòa tan trong nước, enzyme cho một dung dịch keo với những tính chất đặc trưng như khuếch tán kém, áp suất thẩn thấu thấp, độ nhớt cao…  Enzyme có tính lưỡng cực

 Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện tại điểm này, chúng có độ hòa tan thấp nhất

 Enzyme không chịu được nhiệt độ cao, dễ bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác

 Enzyme cũng bị phá hủy bởi các tác nhân phá hủy protein như các

enzyme tiêu hóa( pepsin, tripsin…)

b) Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme

 Vận tốc ban đầu của phản ứng

Nếu khảo sát lượng cơ chất được biến đổi theo thời gian, người ta nhận thấy rằng đường cong biểu diễn ban đầu là một đoạn thẳng với độ dốc không đổi, sau đó đường biểu diễn bị uốn cong cho thấy lượng cơ chất bị biến đổi giảm đi, nghĩa là tốc độ phản ứng giảm đi và cuối cùng bị triệt tiêu khi tất cả các chất đều được biến đổi

Vo = tgαo

Trong đó: Vo là vận tốc ban đầu

αo là góc hợp bởi đường biểu diễn và đường nằm ngang ở thời điểm to

Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng hai hiện tượng khác nhau + Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40oC), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng (do nhiệt cung cấp năng lượng cho phản ứng)

+ Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme), vận tốc phản ứng giảm

xuống do sự biến tính của protein Đa số các enzyme mất hoạt tính

+ Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptide của enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức enzyme – cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptide của enzyme

+ Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự tạo thành phức enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở dưới dạng ion

Như vậy, hoạt tính của enzyme thay đổi theo pH của môi trường và người ta có xác định giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một enzyme Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng và thông thường ngoài giới hạn pH tối ưu khoảng hai đơn vị thì vận tốc phản ứng không đáng kể (thấp hơn ít nhất 100 lần)

 Tác nhân ức chế enzyme (inhibitor) - Ức chế thuận nghịch:

+ Ức chế cạnh tranh (compertitive inhibitor) tâm xúc tác enzyme với cơ chất Chất ức chế cạnh tranh có hình dạng giống cơ chất do vậy dễ dàng tạo phức EI ngăn cản tạo phức ES

Cách khắc phục: tăng nồng độ cơ chất + Ức chế không cạnh tranh:

Ức chế không cạnh tranh chung (noncompertitive inhibitor) Chất ức chế gắn lên vị trí sát tâm hoạt động enzyme, không ngăn cản cơ chất gắn lên tâm hoạt động

Ức chế cạnh tranh riêng (uncompertitive inhibitor) Chất ức chế gắn lên vị trí tâm hoạt động enzyme trong phức ES tạo thành, mà không gắn lên enzyme tự do

- Ức chế không thuận nghịch: xảy ra khi chất ức chế tạo liên kết hóa trị khá bền vững với enzyme Ngoài ra trong nhóm này còn có một số chất ức chế khá đặc biệt, bình thường chúng không hoạt động và chỉ hoạt động khi được gắn hóa trị với tâm hoạt động và làm mất hoàn toàn hoạt tính enzyme do đó chúng được gọi là chất ức chế tự sát (suicide inhibitor)

2.2.2 Giới thiệu về Enzyme amylase

Enzyme amylase là nhóm enzyme phân giải tinh bột (carbohydrate)

Enzyme amylase bao gồm: α-amylase, β- amylase, R-Enzyme (α-1,6-glycosidase), Amyloglycosidase…

Tùy theo nguồn gốc mà mỗi loại enzyme có trọng lượng phân tử, hoạt tính, điều kiện phản ứng khác nhau

var amylosacchariticus)

MW : 49000 Da ( theo Fisher và Stein – 1960) Hoạt tính: 4x105 SKB/g protein enzyme Điều kiện phản ứng:

 α –amylase từ mầm mạch

MW: 42000-54000 Da Điều kiện phản ứng:

Top: 70oC

pHop: 5,5

(đơn vị SKB là lượng amylase thủy phân 1g dextrin giới hạn dạng β đến điểm mất

màu với Iod trong thời gian 1 giờ, điều kiện chuẩn)

Hình 2.1: cấu trúc bậc 3 của α - amylase 2.2.3 Quá trình thủy phân tinh bột

Enzyme Amylase cắt tinh bột tạo Dextrin và đường

 α –amylase cắt các liên kết glycoside nằm bên trong phân tử tinh bột  β- amylase cắt từng cặp đường đôi (maltose) từ phía đầu của mạch

carbohydrate

 R-Enzime còn gọi là α-1,6-glycosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại

điểm xuất pháp mạch nhánh

 Ngoài ra Enzyme Amyloglycosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đường

đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate

Hình 2.2: Quá trình thủy phân Amylose

Hình 2.3 Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen

2.3 Giới thiệu về Trichoderma

Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma như sau:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma

Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva (1968 ), Trichoderma thuộc

họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; các loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm:

Trichoderma Longibrachiatum Saturnisporum Pachybasium Hypocreanum

Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea; nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum

không tìm thấy hình thức teleomorph

xanh, lục xỉn đến lục đậm Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh,

chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20OC

Hình 2.4: Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma

2.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid

Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất

kiềm nếu như ở đó có sự tập trung một lượng CO2 và bicarbonat

Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbonhydrat,

amino acid đến ammonia

Hình 2.5 Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát

triển trên môi trường PDA (Vùng màu xanhchứa bào tử)

Hình 2.4 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của

Trichoderma

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006

Địa điểm thí nghiệm tại Phòng Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại Học Nông Lâm

3.1.2 Đối tượng thí nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện trên 3 chủng nấm Trichoderma : D13, D14, D16 được cung

cấp từ phòng thí nghiệm trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

3.1.3 Dụng cụ và hóa chất 3.1.3.1 Dụng cụ

-Ống nghiệm : 100 ống -Đĩa Petri: 15 cái

-Becher: 1000 ml, 500 ml, 250 ml, 100 ml -Phễu thủy tinh:

-Pipet bầu : 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml -Pipet thẳng: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml -Bình định mức : 100 ml

-Buret: 1 cái

-Erlen: 100 ml ,250 ml -Nồi hấp

-Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

3.1.3.2 Hóa chất – Môi trường

 Môi trường PGA ( môi trường phân lập nấm mốc Trichoderma)

Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 20 g Nước cất 1lit

Hấp khử trùng ở 121 oC trong 30 phút, pH=6,8

 Môi trường Zapeck ( môi trường cảm ứng tổng hợp enzym amylase)

NaNO3 2 g K2HPO4 1g MgSO4 0,5g

FeSO4 0,01g Agar 20 g Nước cất 1000 ml Tinh bột 10 g hấp khử trùng 121 0

 Chuẩn bị các môi trường cảm ứng của các hệ enzym cần định hoạt tính và sơ bộ định lượng

+Chuẩn bị môi trường Zapeck (0,5% tinh bột) cho 20 đĩa petri (400ml) NaNO3 0,8 g

K2HPO4 0,4 g MgSO4 0,2 g

FeSO4 0,004 g Agar 8 g Nước cất 400 ml Tinh bột 2 g

hấp khử trùng 121 0 C , 30 phút, pH 5.0 -5.5

 Cho vào ống nghiệm 20 ml môi trường, hấp khử trùng 1210 C trong 30 phút

 Sử dụng đĩa petri vô trùng, kích thước bằng nhau Cho 20 ml môi trường trên từ ống nghiệm vào

 Cấy chấm mỗi chủng Trichoderma vào giữa đĩa Petri

 Ủ nhiệt độ phòng ( 25-30 0

C ) trong 3 ngày  Cho thuốc thử và đo đường kính vòng phân giải

Thuốc thử Lugol: 0,5g I2 và 5g KI trong nước thành 200 ml

3.2.2 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết các hệ enzyme amylase từ môi

trường nuôi cấy

- Chuẩn bị môi trường

Trichoderma được nuôi cấy trong môi trường bán rắn theo phương pháp nuôi cấy

được cho vào các khay nhựa với hàm lượng 100 gam môi trường/khay Hấp khử trùng nhiệt độ 121 0 C, 1atm trong 40 -45 phút

- Chuẩn bị nguồn giống

Tạo huyền phù bào tử trong 10 ml nước cất vô trùng, tiến hành đếm bào tử

Trichoderma bằng phòng đếm hồng cầu , sao cho vào khay một thể tích dịch huyền phù

đạt mật độ là 1 -1.5X105

bào tử /g môi trường

- Nuôi cấy

Ủ nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp, sau đó, enzym được tách chiết bằng cách:

 Cân 10g canh trường cho vào Erlen Cho vào 100ml nước cất và để trên máy lắc trong 1 giờ

 Sau 1 giờ, tiến hành lọc qua vải lọc

 Dịch lọc được đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút

 Thu lấy dịch ly tâm, định mức tới 100ml, sử dụng như dịch enzyme thô

3.2.3 Phương pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase:

 Sử dụng chủng Trichoderma có hoạt tính cao, tiến hành nuôi cấy trong môi trường bán

rắn

 Khảo sát sự biến đổi hoạt tính của hệ enzyme amylase thủy phân chủ yếu theo thời gian

nuôi cấy : 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h Tại mỗi thời điểm nuôi cấy, cho khoảng 10 g môi trường hoà tan trong 100ml nước cất, đem lọc thu dịch lọc Dịch chiết được đem xác

định họat tính hệ enzym amylase

3.2.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính của enzyme

 Chuẩn bị các dung dịch đệm ở các pH khác nhau

Dung dịch đệm Mc Hvaine ( pH 2,2-8)

A - Dung dịch acid citric 0,1M: 21,008 g acid citric trong 1 lit dung dịch B - Dung dịch Na2HPO4 0,2M: 35,62 g Na2HPO4.2H2O (hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O) trong 1 lit dung dịch

 Chuẩn bị canh trường nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ưu đã

3.2.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme

 Chuẩn bị canh trường nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ưu đã

được xác định

 Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme : cân 10g canh trường, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH tối ưu đã được xác định

 Xác định hoạt tính của enzyme ở các nhiệt độ : 30 oC, 40 oC, 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80oC  Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với nhiệt độ nuôi cấy, suy ra

nhiệt độ tối ưu ( top ) của enzyme.

3.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính của hệ enzym amylase

Phương pháp HEINKEL (1956) 3.2.6.1 Nguyên tắc

 Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod

 Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30oC

3.2.6.2 Hóa chất

-Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1g NaCl trong nước thành 100ml

-Dung dịch Sulfosalicylic acid 20%: hòa tan 20g Sulfosalicylic acid trong nước thành 100ml -Dung dịch Iod (I2): hòa tan 1g Iod vào 5ml dung dịch có chứa 2g KI, thêm nước cất đến 100ml Khi dùng pha loãng dung dịch này 450 lần

-Dung dịch NaH2PO4 0,05M: hòa tan 1,9502 g NaH2PO4.2H2O trong nước thành 250ml -Dung dịch Na2HPO4 0,05M: hòa tan 0,8962 g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 50ml -Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0: trộn chung 87,7 ml dung dịch NaH2PO4 0,05M, 12,3 ml dung dịch Na2HPO4 0,05M và 100 ml nước cất

-Dung dịch tinh bột 1%: hòa tan 1g tinh bột trong dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0 thành 100 ml

-Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%: hòa tan 1g tinh bột trong nước cất thành 100 ml Từ dung dịch này , chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8, và 10 mg tinh bột trong 1 ml

+ Lập đồ thị tiêu chuẩn: lấy 0,1 ml dung dịch đã chuẩn bị như trên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1%, 0,2 ml dung dịch đệm phosphate, 0,1 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch Sulfosalicylic acid 20%, lắc đều rồi thêm 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng 450 lần So màu ở bước sóng 560 nm

+ Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trên trục hoành ghi số mg tinh bột , trục tung ghi hiệu số đọc được của mẫu có tinh bột so với mẫu không có tinh bột

3.2.6.3 Cách tiến hành

 Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1% và 2 sml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0 Lắc đều, để ở 30o

C trong 15 – 20 phút để dung dịch đạt đến 30oC, thêm vào hỗn hợp 1ml dung dịch enzyme đã đạt đến 30oC Lắc đều và tiếp tục giữ ở 30oC trong 30 phút Lấy ống nghiệm ra khỏi và cho ngay vào 5ml dung dịch Sulfosalicylic acid 20% để làm ngừng phản ứng

 Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như trên nhưng cho dung dịch Sulfosalicylic acid 20% vào trước, rồi mới cho enzyme vào sau