XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA a BẰNG kỹ THUẬT MICROSATELLITE DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐỖ THỊ HIẾN XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐỖ THỊ HIẾN XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số:60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Vân Khánh HÀ NỘI – 2016 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đặc điểm bệnh Hemophilia A .3 1.1.1 Những đặc điểm chung .3 1.1.2 Chẩn đoán bệnh Hemophilia A 1.1.3 Điều trị bệnh Hemophilia A 1.1.4 Cơ chế phân tử bệnh Hemophilia A 10 1.2 Người lành mang gen bệnh Hemophilia A .20 1.2.1 Đặc điểm chung 20 1.2.2 Đặc điểm chảy máu người lành mang gen bệnh Hemophilia A 21 1.2.3 Quản lý điều trị dự phòng cho người lành mang gen bệnh Hemophilia A 23 1.2.4 Vai trò việc xác định người lành mang gen bệnh .23 1.3 Các phương pháp phát người lành mang gen bệnh HA 23 1.3.1 Dựa vào hoạt tính yếu tố VIII 23 1.3.2 Dựa vào phân tích phả hệ 24 1.3.3 Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử 25 1.4 Tình hình nghiên cứu người lành mang gen bệnh HA Việt Nam 35 Chương 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng nghiên cứu 38 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất sử dụng nghiên cứu 38 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 38 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 38 2.2.3 Hóa chất nghiên cứu 39 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang 40 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 41 2.3.3 Địa điểm nghiên cứu 41 2.3.4 Quy trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 41 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 50 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 51 3.2 Xây dựng quy trình xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA 51 3.2 Xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA thành viên gia đình người bệnh 52 CHƯƠNG 4:BÀN LUẬN 53 DỰ KIẾN KẾT LUẬN .54 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đánh giá tỉ số alen marker .32 Bảng 2.1 Trình tự đoạn STR dùng cho kỹ thuật Micrisatellite HA .39 Bảng 2.2 Bảng hiệu tên cặp mồi đặc để khuếch đại STR gen FVIII 49 Bảng2.3 Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại STR 49 Bảng 3.1 tóm tắt tình trạng mang gen FVIII bị đột biến gia đình 52 Bảng 3.2 Kết phát người lành mang gen yếu tố VIII đột biến 52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các hình ảnh biểu bệnh Hemophilia A Hình 1.2 Sơ đồ đơng máu theo đường nội ngoại sinh 12 Hình 1.3 Cấu trúc gen protein yếu tố VIII 13 Hình 1.4 Phả hệ di truyền bệnh hemophilia A thành viên Hoàng gia Anh 25 Hình 1.5 Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 DNA người mẹ DNA chị gái bệnh nhân bị đột biến del2605C Mũi tên thẳng đứng vị trí đột biến, chữ số mũi tên vị trí nucleotid acid amin thay đổi 26 Hình 1.6 Cơ chế đột biến gen F8 đảo đođảobiến gen F 28 Hình 1.7 Cơ chế đột biến gen F8 đảo đođảobiến ge1 .29 Hình 1.8 Ứng dụng Microsatellite DNA phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A .34 Hình 2.1 Các đoạn DNA đóng vịng sau nối T4 ligate .47 ĐẶT VẤN ĐỀ Hemophilia A (HA) bệnhdi truyền lặn nhiễm sắc thể giới tính X, gây nên đột biến gen FVIII.Gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X khơng có allele tương ứng nhiễm sắc thể Y, người mẹ mang gen bệnh truyền bệnh cho 50% trai truyền gen bệnh cho 50% gái họ[1],[2] Bệnh di truyền qua nhiều hệ có nhiều người mắc bệnh gia đình Tại Việt Nam ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh Hemophilia [3],và khoảng 30.000 người mang gen bệnh Hemophilia A Mặc dù thời gian qua, cơng tác chăm sóc bệnh nhân Hemophilia A Việt Nam có nhiều tiến bộ, số lượng người bệnh chẩn đốn quản lí tăng lên đáng kể, nhiên chiếm chưa tới 30%, đa số người mang gen bệnh chưa chẩn đốn quản lí[4].Chẩn đốn xác điều trị sớm bệnh có ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu giảm thiểu khả bệnh nhân trở thành tàn tật,giảm bớt ánh nặng cho gia đình xã hội Người phụ nữ mang gen bệnh người có hoạt tính yếu tố VIII máu giảm nhiên nhiều trường hợp hoạt tính yếu tố VIII khơng giảm giảm Có thể khẳng định chắn người phụ nữ mang gen bệnh, người có bố có trai bị Hemophilia A Người phụ nữ có nguy cao mang gen bệnh người có trai bị bệnh Hemophilia A gái người mẹ mang gen bệnh; chị em dì với người bị bệnh Hemophilia A[2] Việc phát người lành mang gen bệnh sở khoa học cho công tác tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh chẩn đoán tiền làm tổ (PGD), giúp ngăn ngừa sinh đứa trẻ bị bệnh HA[5], tăng hiệu tác phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Ở Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh Hemophilia A nghiên cứu đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng, tần suất mắc bệnh đánh giá hiệu điều trị bệnh chế phẩm thay thế[6],[7],[2],nghiên cứu phát người lành mang gen bệnh phân tích số yếu tố đông máu; nghiên cứu phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử Cho đến nay, khoảng 1000 đột biến gen F8 báo cáo Với nhiều loại đột biến khác như: đột biến điểm, đột biến xoá đoạn, đột biến đảo đoạn…[8].Việc phát người lành mang gen bệnh thường thực kỹ thuật phát đột biến trực tiếp gen F8 dựa vào đột biến điểm người bệnh Tuy nhiên cấu trúc gen FVIII lớn nên số trường hợp không phát việc phát đột biến điểm gặp khó khăn, kỹ thuật phân tích gián tiếp lại phát người lành mang gen dựa vào xác định allele đột biến Kỹ thuật Microsatellite DNA kỹ thuật phát gián tiếp phát triển dựa kỹ thuật PCR cổ điển, việc sử dụng cặp mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn STR (short tandem repeat), sản phẩm PCR điện di hệ thống máy giải trình tự gen để phát allele đột biến Hiện Việt Nam, phát người lành mang gen bệnh hemophilia A phương pháp gián tiếp sử dụng kỹ thuật Microsatellite DNA chưa triển khai Xuất phát từ thực tế đóđề tài: “Xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA” tiến hành với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA Xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA thành viên gia đình người bệnh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm bệnh Hemophilia A 1.1.1 Những đặc điểm chung 1.1.1.1 Định nghĩa Bệnh máu khó đơng(Hemophilia) bệnh di truyền thiếu hụt bất thường chức yếu tố đông máu huyết tương: thiếu hụt yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A; thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B; thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh hemophilia C Bệnh hemophilia A bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất[9],[10] 1.1.1.2 Lịch sử nghiên cứu  Từ thời kỳ cổ đại lồi người biết đến bệnh máu khó đơng, nhiên khơng có tên gọi thức cho nó.Hemophilia đựợc ghi nhận lần từ kỉ thứ giáo sĩ Do thái cắt bao qui đầu cho trẻ em nhận thấy có số trẻ trai bị chảy máu lâu cầm Bác sỹ người Ả rập- Albucasis miêu tả đứa trẻ bị chết chảy máu vết thương nhỏ.Từ năm 1803 1837các nhà khoa học phát chế di truyền lặn, liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính X nhận thấy có nam giới mắc bệnh khơng có khả truyền bệnh cho trai, người mẹ mang gen bệnh truyền bệnh cho trai  Bệnh hemoliphia cịn biết đến bệnh hồng gia nữ hồng Anh Victoria (1838-1901) mang gen bệnh truyền bệnh cho nhiều Hồng Gia khác[11]  1872: William Leg mơ tả chi tiết đặc điểm lâm sàng bệnh Hemophilia  1893: Xác định thời gian đông máu kéo dài bệnh nhân Hemophilia  1937: Thiếu hụt yếu tố VIII xác định nguyên nhân bệnh Hemophila  Năm 1944, Pavlosky nghiên cứu Buenos Aires cho thấy máu bệnh nhân Hemophilia A điều trị triệu chứng rối loạn đông máu bệnh nhân Hemophilia khác ngược lại, tình cờ ông gặp hai bệnh nhân bị thiếu hụt hai protein khác - yếu tố VIII yếu tố IX[12]  1952: Yếu tố IX xác định, phân biệt loại Hemophilia A B  1971: Hemophilia phân biệt với bệnh von Willebrand  1982: Trình tự gen yếu tố VIII xác định  1984: Gen yếu tố IX giải mã Những phát cho phép chẩn đốn xác xây dựng sở khoa học cho việc điều trị bệnh rối loạn đông máu di truyền 1.1.1.3 Dịch tễ học bệnh Hemophilia A Theo thống kê tổ chức Hemophilia giới (WFH), có khoảng 250.000 người bệnh mắc bệnh Hemophilia có khoảng 50.000 điều trị đặc hiệu[13] Tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia A gần giống vùng địa lý, nước, chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30100/1.000.000 dân[14] Tần suất mắc bệnh Hemophilia A 1/4000  1/5.000 trẻ trai[15],[16] Tại Việt Nam, theo thống kê không đầy đủ có khoảng 6000 người bệnh Hemophilia có khoảng 20-30% phát điều trị Số liệu điều tra năm 19941996 tình hình bệnh Hemophilia miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh Hemophilia 2560/1.000.000 dân[15] Hiện tồn quốc có khoảng 2.200 (chiếm gần 40%) người bệnh phát chăm sóc thường xuyên Như vậy, tỷ lệ người bệnh chưa chẩn đoán điều trị mức cao[17] Tại Trung tâm Hemophilia , Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương quản lý điều trị khoảng 1.200 47 int22h1 int22h2/3 DNA người bình thường đóng vịng 21,5kb DNA bệnh nhân đảo đoạn đóng vịng 20,0kb BclI BclI 460 27 IU 487 bp BclI 460 99 ID IU 559 bp BclI ED Hình 2.1 Các đoạn DNA đóng vịng sau nối T4 ligate Ở người bình thường, mồi IU bắt cặp với mồi ED tạo DNA đóng vịng kích thước 21,5kb; chứa đoạn int22h-1 vùng BX842559 GeneBank, có vị trí enzym cắt giới hạn BclI: base 36204 mồi IU base 14595 mồi ID (hình 2.3.A) Khi khuếch đại phản ứng multiplex PCR cho đoạn DNA có kích thước 487bp Khi tượng đảo đoạn xảy ra, đoạn int22h-1 nằm gen F8 thay đoạn int22h-2 int22h-3 nằm gen F8 cách đầu telomere 500kb, DNA vịng có kích thước 20kb (hình 2.3.B) Lúc mồi IU bắt cặp với mồi ED (mồi ED thiết kế nằm cạnh int22h-2 intron 22h-3 có chứa trình tự enzym cắt giới hạn BclI) So sánh trình tự mồi ED Genbank vùng BX 276110 thấy vị trí BclI int22h-3 base 14703 vùng BX 683327 có vị trí BclI int22h-2 base 15265 Đột biến đảo đoạn khuyếch đại đoạn DNA có kích thước 559bp 48 * Phân tích kết quả: Sản phẩm sau khuếch đại điện di gel agarose 1,5% với Marker 100bp nhuộm ethidium bromid để kiểm tra đột biến đảo đoạn: DNA người bình thường có băng kích thước tương ứng 487 bp DNA bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn intron 22 có băng kích thước tương ứng 559 bp DNA người mẹ thành viên nữ gia đình bệnh nhân người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử có vạch kích thước tương ứng 487 (1 alen bình thường) 559 bp (1 alen đột biến) 2.3.4.4 Kỹ thuật Microsatellite-DNA Quy trình phản ứng PCR DNA tổng số sau tách chiết từ mẫu máu sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại STR: STT Tên Marker 10 11 12 13 14 FXS8061 FXS8087 FXS9796 FXS7501 FXS7153 FXS1073 FXS7532 FXS1108 DXS9897 DXS1073 F8INT13 F8INT22 DXS9901 FXS52 Kích thước Bảng 2.2 Bảng hiệu tên cặp mồi đặc để khuếch đại STR gen FVIII * Chuẩn bị pre-mix cho phản ứng PCR theo dẫn cụ thể tương ứng với loại 49 đột biến gây bệnh HA Tính tốn nồng độ chất phản ứng.Thực phản ứng PCR khuếch đại gen với chu kỳ nhiệt nghiên cứu: Thành phần Thể tích (µl) Khn DNA (20-50 ng/µl) Ex Taq buffer 10X dNTP 2.5mM Ex Taq polymerase 0,1 Mồi ngược (2,5 pmol/µl) 0,5 Mồi xi (2,5 pmol/µl) 0,5 Nước cất lần 13,4 Tổng thể tích 20 Điều kiện phản ứng Biến tính: 94 oC phút Lặp lại 35 chu kỳ gồm bước sau: Biến tính: 94 oC 30 giây Gắn mồi: 59oC 30 giây Tổng hợp:72 oC 30 giây Sau 35 chu kỳ, tổng hợp lần cuối 72 oC phút Giữ 15 oC Bảng2.3 Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại STR * Phản ứng thực máy máy sequencingcủa hãng Beckman coulter Kết phân tích phần mềm GeneMapper v3.2 software Để xác định microsatellite, phương pháp áp dụng dựa nguyên tắc phản ứng PCR phương pháp điện di gel polyacrylamide Do khác số lượng nucleotide đơn vị lặp lại số lần lặp lại mà đa hình độ dài microsatellite khuếch đại phân tách gel điện di có độ phân giải cao gel polyacrylamide - Ghi trả kết xét nghiệm đối tượng nghiên cứu 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu - Việc thực nghiên cứu thông qua Hội đồng đạo đức y học trường Đại học Y Hà Nội - Các đối tượng tham gia nghiên cứu hồn tồn tự nguyện có quyền rút khỏi nghiên cứu không muốn tham gia nghiên cứu - Các thông tin liên quan đến đối tượng tham gia nghiên cứu đảm bảo bí mật 50 - Các kỹ thuật, thao tác thực nghiên cứu bảo đảm chuyên môn - Đối tượng nghiên cứu thông báo kết xét nghiệm - Đề tài nghiên cứu thực hồn tồn mục đích khoa học khơng mục đích khác CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu a Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi b Phân bố đối tượng nghiên cứu theo quan hệ với bệnh nhân 3.2 Xây dựng quy trình xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA * Gia đình bệnh nhân mã số HA01: - Phả hệ gia đình:(Trước phân tích gen) - Kết phát người lành mang gen F8 bị đột biến kỹ thuật giải trình tự gen: - Kết phát người lành mang gen F8 bị đột biến điểm kỹ thuật Microsatellite-DNA: 51 - Phả hệ gia đình:(Sau phân tích gen) *Gia đình bệnh nhân mã số HA 02: - Phả hệ gia đình:(Trước phân tích gen) - Kết phát người lành mang gen F8 bị đột biến đảo đoạn kỹ thuật Multiplex PCR - Kết phát người lành mang gen F8 bị đột biến kỹ thuật Microsatellite DNA - Phả hệ gia đình:(Sau phân tích gen) *Gia đình bệnh nhân mã số HA 03: - Phả hệ gia đình:(Trước phân tích gen) - Kết phát người lành mang gen F8 bị đột biến xóa đoạn kỹ thuật giải trình tự gen - Kết phát người lành mang gen F8 bị đột biến xóa đoạn kỹ thuật Microsatellite DNA - Phả hệ gia đình:(Sau phân tích gen) Như kỹ thuật trực tiếp hay gián tiếp ta thu kết giống STT Gia đình Các thành viên nữ Dạng đột biến Mẹ bệnh nhân gia đình bệnh nhân Bảng 3.1 tóm tắt tình trạng mang gen FVIII bị đột biến gia đình 3.2 Xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA thành viên gia đình người bệnh Tương tự trên, sử dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA để xác định tình trạng mang gen gia đình HA lại, kết cho bảng tổng hợp: 52 Bảng 3.2 Kết phát người lành mang gen yếu tố VIII đột biến STT gia đình 10 Mẹ bệnh nhân Thành viên nữ gia đình bệnh nhân CHƯƠNG BÀN LUẬN - Bàn luận theo mục tiêu nghiên cứu dựa theo kết thu được, phân tích so sánh với nghiên cứu tác giả khác nước nước 53 DỰ KIẾN KẾT LUẬN DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Gill Swallow ( 2013) Guideline for the Obstetric Management of Carriers of Haemophilia A and B,NHS Nottingham University Hospitals Cookie Disclaime Trần Thị Liên Trần Thị Thanh Hương (2014 ) Di truyền đơn gen,Di truyền y học, Nhà xuất giáo dục, 146-149, Nguyễn Anh Trí Mai N T (2009) Quản lí, chẩn đốn điều trị hemophilia Việt Nam: Quá khứ - Hiện – Tương lai Y học Việt Nam, , 3-12, Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Nữ cộng (2012 ) Nghiên cứu phát Hemophilia dựa vào phả hệ gia đình bệnh nhân chẩn đoán viện Huyết học – Truyền máu Trung ương Báo cáo Hội nghị nghiên cứu sinh Trường đại học Y Hà Nội lần thứ XVIII, 156-162, Dương Hải (2014) 6000 Người Việt mắc bệnh “hoàng gia” http://suckhoedoisong.vn, xem 15/6/2014, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Băng Sương, Nguyễn Hoàng Việt cộng (2009) Khảo sát tần suất người mẹ mang gen dystropin bị đột biến đoạn Việt Nam Tạp chí nghiên cứu Y học X, 62 (3), 105-112., Rochelle Winikoff, Maureen Brownlow Patricia Stewart (2010) All about carriers A guide for families, 14, 1-26, Azza A.G Tantawy (2010) Molecular genetics of hemophilia A: Clinical perspectives The Egyptian Journal of Medical Human Genetics 11, 105–114, Marshall A Lichtman, Ernest Buitler, Uri Seligsohn cộng Williams hematology 7th edition MrGraw-Hill medical chapter 115, 10 Phạm Quang Vinh (2006) Bệnh Hemophilia Bài giảng Huyết học- truyền máu (Sau đại học), NXB Y học, 270-279 11 McKusick VA (1965) The Royal Hemophilia Scient Am, 213, 88-95, 12 Quế N T H (2008) Nghiên cứu tác dụng không mong muốn bệnh nhân Hemophilia A truyền chế phẩm máu viện huyết học truyền máu trung ương giai đoạn 2004-2008 Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Y Hà Nội, 13 Klein I, Andrikovics H, A B cộng (2001) A hemophilia A and B moleculergenetic diagnostic programme in Hungary: a highly informative and cost-effective strategy Hemophilia, 7, 306-312, 14 Barbara A Konkle, MD, Neil C Josephson cộng (1993-2014) Hemophilia A Synonyms: Classic Hemophilia, Factor VIII Deficiency GeneReviews, Xem ngày 10/5/2014., 15 Cung Thị Tý và cộng (1997) Tình hình Hemophilia số địa phương miền Bắc Việt Nam Đề tài nghiên cứu cấp nghiệm thu, 16 Centers for Disease Control (1989) Contribution of birth defects to infant mortality MMWR 38, pp 633-5, 17 Hải Dương (2014) 6000 người Việt mắc bệnh " hoàng gia" http://suckhoedoisong.vn, xem 15/6/2014, 18 Nguyễn Minh Hiệp và cộng (2001) Đặc điểm lâm sàng phân loại bệnh Hemophilia trẻ em Viện nhi khoa Luận văn tốt nghiệp bác sĩ chuyên khoa cấp II, Trường Đại học Y Hà Nội, 19 Vũ Thị Minh Châu (2001) Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng bệnh Hemophilia A gặp viện Huyết học - truyền máu Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa II, Trường Đại học Y Hà Nội, 20 Joan C.G Jay E M Robert R M (1995) Preparation and clinical use of plasma and plasma fractions William hematology 5th edit: pp 1649 - 659, 21 Rusel L (2001) Transfusion of cryoprecipitate - Between risk and benefit Transfusion - Clinique Biologique Vol 8(Suppl): pp 525 - 530, 22 Schutgens RE, Mannucci PM E M.-B E (2009) How I treat agerelated morbidities in elderly persons with hemophilia Blood, 5256-5263, 23 Katherine A (2012) The gene therapy journey for hemophilia: are we there yet Blood, 120, 375-381, 24 Edgington TS Zimmerman IS (1973) Factor VIII coagulant activity and factor VIlI-like antigen: Independent molecular entities Med, 138, 1015-1020, 25 Brockway WI, Olson ID, Fass DN cộng (1977) Purification of porcine and human ristocetin-Willebrand factor LabClin Med 89, 1278-1294, 26 Trabold NC, Tuddenham GD, Collins IA cộng (1979) The properties of factor VIII coagulant activity prepared by immunoadsorbent chromatography J Lab Clin Med 93, 40-53., 27 Weiss H Sussman (1978) Dissociation of factor VIII in the presence of proteolytic inhibitors Thromb Haemostas, 40, 316-325, 28 Laffan M A Bradshaw A E (1995) Investigation of haemostasis, in Practical Haematology (Dacie J V., Lewis S M., editors , eds) pp 297– 315, Churchill Livingstone, New York, 29 Oldenburg J Ananyeva N.M et Saenko E.L (2004) Molecular basic of Heamophilia A Heamophilia 10;133-139, 30 Vehar G.A, Keyt B Eaton D (1984) “Structure of human factor VIII”, Nature 321, 312-337, 31 Kemball-Cook G, Tuddenham EGD Wacey AI (1998) “The factor VIII structure and mutation resource site: HAMSTeRS v4” Nucleic Acids Res, 26:216–9., 32 Ye Jee Shim Kun Soo Lee (2010) (2010) Genetic Risk Factors of Hemophilia A J Genet Med 7(1), p.1-8, 33 Graw J, Brackmann HH al O J e (2005) Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies Nat Rev Genet, 6(6), 488-501, 34 Liu ML, Shen BW Nakaya S (2000) Hemophilic factor VIII C1- and C2-domain missense mutations and their modeling to the 1.5-angstrom human C2-domain crystal structure Blood 96, 979–87, 35 Ngo JC, Huang M, Roth DA cộng (2008) Crystal Structure of Human Factor VIII: Implications for the Formation of the Factor IXaFactor VIIIa Complex Structure 16, 597–606, 36 Jaquemin M, Lavend’home R Benhida A (2000) A novel cause of mild/moderate hemophilia A:mutation scattered in the factor VIII C1 domain reduce factor VIII binding to von Willebrand factor Blood 96, 958-965, 37 Keeney S, Mitchell M Goodeve A (2005) The molecular analysis of haemophilia A: a guideline from the UK haemophilia centre doctors' organization haemophilia genetics laboratory network Haemophilia, 11, 387–97, 38 Goodeve AC Peake I (2003) The molecular basic of hemophilia A: genotype-phenotype relationships and inhibitor development Semin Thromb Hemost, 29(1), 23-30, 39 Shima M, Ware J, Yoshioka A cộng (1989) An arginine to cysteine amino acid substitution at a critical thrombin cleavage site in a dysfunctional factor VIII molecule Bloood, 74, 1612-17, 40 Bagnall RD, Giannelli F Green PM (2006) Int22h-related inversions causing hemophilia A: a novel insight into their origin and a new more discriminant PCR test for their detection J Thromb Haemost 4, 591–8, 41 Tizzano EF, Cornet M Baiget M (2003) Inversion of intron of the factor VIII gene for direct molecular diagnosis of hemophilia A Haematologica, 88, 118 - 120, 42 Andrikovics H, Klein I, Bors A cộng (2003) Analysis of large structural changes of the factor VIII gene, involving intron and 22, in severe hemophilia A Haematologica, 88, 778–84, 43 David D, Ventura C, Moreira I cộng (2006) The spectrum of mutations and molecular pathogenesis of hemophilia A in 181 Portuguese patients Haematologica, 91(6), 840-43, 44 Kaufman RJ Powell JS (2013) Molecular approaches for improved clotting factors for hemophilia American Society of Hematology 122, 30-36, 45 Thompson AR Structure and function of the factor VIII gene and protein Semin Thromb Hemost, 29, 11–22, 46 Leuer M, Oldenburg J Lavergne JM (2001) Somatic mosaicism in hemophilia A: a fairly common event Am J Hum Genet (2001) Jul; 69(1), 75-87 Epub 2001 Jun 14 47 World Federation of Hemophilia (2012) Carriers and women with hemophilia WFH 50 years of advancing treatment for all 48 Ljung R Tedgård U (2003) Genetic counseling of hemophilia carriers Semin Thromb Hemost 29(1), 31-6, 49 Elizabeth C, Michael W Janet B (2010) Guideline on the management of haemophilia in the fetus and neonate, British Committee for Standards in Haematology 1-19, 50 Goodeve AC (1998) Advances in carrier detection in haemophilia Haemophilia, 4(4), 358-64, 51 Plug I, Mauser-Bunschoten EP, Brocker-Vriends AH cộng (2006) Bleeding in carriers of hemophilia Blood, 108, 52–6, 52 Rodeghiero F, Ruiz-Saez A, Bolton-Maggs PH cộng (2008) Laboratory issues in bleeding disorders Haemophilia, 14(Suppl 3), 93–103, 53 Shetty S, Ghosh K, Bhide A cộng (2001) Carrier detection and prenatal ldiagnosis in families with hemophilia NatMedJInd 14, 81–83, 54 Chen YC, Hu SH, Cheng SN cộng (2010) Genetic analysis of haemophilia A in Taiwan Haemophilia, 16(3), 538–44, 55 Bagnall R, Waseem NH, Green PM cộng (1999) Start of UK confidential haemophilia A database: analysis of 142 patients by solid phase fluorescent chemical cleavage of mismatch Thromb Haemost, 8, 900-905, 56 Oelmueller U, Rainen L Jurgensen S (2002) Stabilization of mRNA expression in whole blood samples Clin Chem, 48, 1883-1890, 57 Anne Goodeve (2008) Molecular Genetic Testing of Hemophilia A Thrombosis and hemostasis 34(6), 491-501, 58 Kazazian HH, Jr Lakich D, Antonarakis SE cộng (1993) Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A Nat Genet, 5, 236-241, 59 Nozari G, Liu Q Sommer S (1998) Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in haemophilia A Blood, 92, 1458–1459, 60 Radic CP, Rossetti LC, Larripa IB cộng (2005) Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR Clin Chem 51, 154-158, 61 Mauser EP, Vlot AJ, Zarkova AG cộng (2000) The half-life of infused factor VIII is shorter in hemophiliac patients with blood group O than in those with blood group A Thromb Haemost 83(1), 65-69, 62 MRC-Holland MRC-Holland MLPA homepage (2008) Available at ttp://www.mlpa.com/pages/indexpag.html Accessed February 26., 63 Ngô Thị Hường (2012) Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học lâm sàng bệnh Hemophilia A hiệu sử dụng Hemofil M điều trị bệnh Hemophilia A Luận văn tốt nghiệp bác sỹ nội trú, Trường Đại học Y Hà Nội, 64 Lưu Vũ Dũng (2009) Tạo dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa yếu tố VIII người Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Y Hà Nội, 65 Dũng L V (2014) Nghiên cứu xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A Đề tài tiến sĩ, Đại học Y Hà nội, 66 Lê Nhật Minh và cs (2004) Sử dụng phương pháp ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định cá thể mang gen bệnh máu khó đơng hemophilia A Tạp chí Di truyền học, 1, 10-14 67 Trần Thị Phương Túy và cộng (2007) Tìm hiểu tính chất gia đình bệnh nhân Hemophilia A điều trị Bệnh viện Trung ương Huế Tạp chí nghiên cứu Y học, 51(54), 20-24 68 Bùi Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn cộng (2013) Nghiên cứu phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A Tạp chí nghiên cứu Y học, 83- 3, 1-8, ... trình xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA 51 3.2 Xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA thành viên gia đình người. .. định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA Xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite DNA thành viên gia đình người bệnh 3 Chương TỔNG QUAN... gọi người lành mang gen bệnh bắt buộc (obligate carrier) Bà ngoại cháu trai bị bệnh Hemophilia A, gái người mẹ mang gen bệnh Hemophilia A, dì em gái người bệnh Hemophilia A người có nguy cao mang