Đang tải... (xem toàn văn)
Nâng cao giá trị dinh dưỡng phụ phẩm từ ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành bằng công nghệ sinh học để sử dụng làm thức ăn chăn nuôi đang được chú trọng mạnh. Việc nghiên cứu tạo ra sản phẩm nâng cao dinh dưỡng thành dạng dễ hấp thu còn nhiều hạn chế, đặc biệt đối với nguyên liệu làm thức ăn cho thủy sản.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II NÂNG CAO GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG BÃ SỮA ĐẬU NÀNH BẰNG THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN KẾT HỢP ENZYME CELLULASE VÀ VI KHUẨN Bacillus subtilis B3 Trần Văn Khanh1*, Nguyễn Văn Nguyện1, Lê Hoàng1, Nguyễn Xuân Hai1, Nguyễn Thành Trung1, Trần Thị Lệ Trinh1, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh1 TÓM TẮT Nâng cao giá trị dinh dưỡng phụ phẩm từ ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành công nghệ sinh học để sử dụng làm thức ăn chăn nuôi trọng mạnh Việc nghiên cứu tạo sản phẩm nâng cao dinh dưỡng thành dạng dễ hấp thu nhiều hạn chế, đặc biệt nguyên liệu làm thức ăn cho thủy sản Thí nghiệm tiến hành thủy phân bã sữa đậu nành enzyme cellulase đồng thời lên men bán rắn bã sữa đậu nành bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis B3 Tiến hành khảo sát điều kiện lên men tối ưu thời gian từ 24 đến 96 giờ, lấy mẫu đánh giá mật độ vi khuẩn Đánh giá chất lượng sản phẩm thơng qua tiêu thành phần hóa học, mức độ thủy phân protein phương pháp Lowry protein kháng dinh dưỡng phương pháp điện di mức độ phá vỡ vách tế bào cellulose bã sữa kính hiển vi Kết nghiên cứu cho thấy, điều kiện tối ưu cho việc thủy phân lên men bán rắn bã sữa đậu nành với enzyme cellulase vi khuẩn Bacillus subtilis B3 xác định nhiệt độ 37oC pH 6,5 vi khuẩn đạt mật độ cao sau 48 Thành phần dinh dưỡng bã sữa đậu nành lên men cải thiện với hàm lượng xơ giảm 12,54%, hàm lượng protein tan tăng protein kháng dinh dưỡng thủy phân hồn tồn (< 20 KDa) Do đó, nguyên liệu sau lên men bán rắn vi khuẩn Bacillus subtilis B3 kết hợp với thủy phân enzyme cellulase có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng để làm nguyên liệu cho thức ăn thủy sản Từ khóa: Bacillus subtilis B3, bã sữa đậu nành, lên men bán rắn I GIỚI THIỆU Hiện với nhu cầu phát triển thực phẩm từ nông nghiệp, phụ phẩm dư thừa đáng kể Trong đó, bã sữa đậu nành (BSĐN) phần lại đậu nành từ công nghiệp chế biến sữa Khoảng 1,1 kg bã sữa đậu nành tươi sản xuất từ kg đậu nành chế biến đậu hũ sữa đậu nành (Khare ctv., 1995) Hàng năm khoảng 500 triệu lít sữa đậu nành sản xuất, ước tính khoảng 20.000 phụ phẩm từ bã sữa từ nhà máy Vinasoy (Bùi Thị Thùy Dương, 2019) Protein BSĐN gồm hai protein 7S globulin 11S globulin (Singh ctv., 2015), hai protein có phân mảnh β-conglycinin glycinin, hai kháng protein đậu nành (Feng ctv., 2007; Shiu ctv., 2015) Protein đậu nành chứng minh có ảnh hưởng đến tiêu hóa pepsin, mật đường ruột cá hồi cá cam Nhật (Heikkinen ctv., 2006; Matsunari ctv., 2010; Nguyen Thanh Trung ctv., 2016) Việc sử dụng bã sữa đậu nành sản xuất thức ăn thủy sản hạn chế, số lồi cá đường ruột khơng chứa loại enzyme tiêu hóa chất xơ, khả tiêu hóa chất hạn chế, đặc biệt loài ăn động vật (Chakrabarti ctv., 1995) Nghiên cứu sử dụng phụ phẩm từ chế biến sữa đậu nành mức 10% 20% phần ăn tôm thẻ chân trắng thử nghiệm Hawaii năm 2010, kết tôm tăng trưởng có độ tiêu hóa mức thấp 18,2% (Forster ctv., 2010) Vì để cải thiện khả tiêu hóa thức ăn có chứa tỷ lệ chất xơ cao, việc bổ sung enzyme tiêu hóa chất xơ lên men nguyên liệu vi khuẩn trước làm thức ăn cần quan tâm Các nghiên cứu nhằm nâng cao khả Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II * Email: tvkhanh76@yahoo.com 64 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 14 - THÁNG 10/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II tiêu hóa hấp thụ chất dinh dưỡng phụ phẩm từ chế biến sữa đậu nành nghiên cứu trước (Kasai ctv., 2004), tiến hành thí nghiệm tiêu hóa vách tế bào phụ phẩm từ chế biến sữa đậu nành, enzyme cellulase thủy phân vách cellulose sơ cấp, vách tế bào thứ cấp gồm galacturonic acid, đường protein, nghiên cứu sử dụng pectinase để thủy phân vách tế bào thứ cấp Kết cho thấy hỗn hợp enzyme tiêu hóa 83-85% tế bào phụ phẩm từ chế biến sữa đậu nành thô Ngoài việc thủy phân enzyme, việc lên men vi khuẩn bã sữa đậu nành nghiên cứu trước đây, chống oxy hóa từ Bacillus natto (Yokota ctv., 1996; Hu ctv., 2010; Mateos-Aparicio ctv., 2010) tạo nattokinase từ Bacillus subtilis, tăng hàm lượng peptide (Oh ctv., 2006; Sanjukta Rai, 2016) Chủng vi sinh Bacillus subtilis B3 sản phẩm đề tài “Hoàn thiện sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh BioShrimp-RIA2 phòng bệnh Vibrio spp gây tơm ni” có khả sinh enzyme ngoại bào protease, caseinase, amylase cellulase có hoạt tính mạnh, phân lập từ hệ tiêu hố tơm thẻ Sử dụng vi khuẩn nhằm mục đích gia tăng giá trị cho BSĐN thông qua giải pháp kết hợp thủy phân lên men bán rắn tạo nguồn nguyên liệu dễ hấp thu, dinh dưỡng cao, loại bỏ vách cellulose tế bào giúp cải thiện hệ tiêu hóa II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm Bã sữa đậu nành có nguồn gốc từ nhà máy chế biến sữa Vinasoy, Bình Dương Hình Bã sữa đậu nành từ nhà máy chế biến sữa Vinasoy Vi khuẩn Bacillus subtilis B3 chủng phân lập từ hệ tiêu hóa tơm, sử dụng để lên men bán rắn với mật độ vi khuẩn đạt khoảng 107 CFU/gam pha loãng 100 lần từ mơi trường gốc ~109 CFU/gam Hình Vi khuẩn Bacillus subtilis B3 sử dụng thí nghiệm lên men bán rắn Enzyme cellulase thương mại từ Công ty Rừng Biển, hoạt độ tối ưu 7.000 U/gam nhiệt độ 37oC pH 6,5 2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.1 Xác định hoạt độ cellulase thích hợp cho trình lên men Vi khuẩn Bacillus subtilis B3 khảo sát có hoạt tính cellulase, dịch lên men từ vi khuẩn 24 48 xác định hoạt độ cellulase thông qua hàm lượng đường khử theo phương pháp (Miller, 1959) Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử Acid Dinitrosalisylic - DNS Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử bước sóng 530 nm Dựa hàm lượng đường khử, xác định độ thủy phân tối ưu cellulase thương mại phá vỡ vách tế bào sơ cấp chất 200g bã sữa đậu nành nhiệt độ 37°C 24 hoạt độ enzyme từ 12 U/g, 24 U/g, 35 U/g 54 U/g, sau lựa chọn hoạt độ thích hợp để thực việc lên men (khoảng 50U/g theo Kasai ctv., (2004)) 2.2.2 Lên men kết hợp thủy phân Lên men bán rắn khay chứa kg, lặp lại lần, đặt tủ lên men 100 lít, q trình lên men tối ưu trùng sau thủy phân vi khuẩn Bacillus subtilis B3 kết hợp với enzyme cellulase, có bổ sung mơi trường khống cho q trình lên men bán rắn g/L KH2PO4, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 14 - THÁNG 10/2019 65 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II g/L NaCl dextrose g/L Sản phẩm sau lên men đánh giá thủy phân vách cellulose, protein tan phân đoạn protein Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis B3 theo phương pháp tiêu chuẩn (BS EN 15784, 2009) a Ảnh hưởng thời gian lên men Ảnh hưởng thời gian lên men khảo sát điều kiện nhiệt độ 37oC, pH 6,5, độ dày nguyên liệu cm, thời gian khảo sát 96 Mẫu lấy theo thời gian 24 giờ/lần để xác định mật độ vi khuẩn b Ảnh hưởng nhiệt độ lên men Ảnh hưởng nhiệt độ lên men bán rắn kết hợp với thủy phân enzyme cellulase khảo sát điều kiện nhiệt độ 30, 37 40oC, pH 6,5, độ dày nguyên liệu cm, mẫu thu để xác định mật độ vi khuẩn c Ảnh hưởng giá trị pH Đo mật độ vi khuẩn thí nghiệm xác định ảnh hưởng pH môi trường lên men điều kiện pH 6,0; 6,5 7, có độ dày nguyên liệu cm, thời gian nhiệt độ từ kết khảo sát thí nghiệm 2.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm Từ kết xác định xử lý phụ phẩm bã sữa đậu nành vi khuẩn B subtilis B3 kết hợp thủy phân enzyme, sản phẩm tiến hành phân tích đánh giá hàm lượng dinh dưỡng gồm hàm lượng ẩm (%) xác định theo phương pháp TCVN 4326:2001, protein thô (%) theo TCVN 4328-1:2007, lipid thô (%) theo AOAC 920.39, tro (%) theo TCVN 43272007, xơ (%) theo TCVN 4329:2007, protein tan acid amin tự theo phương pháp Lowry Vách tế bào sơ cấp thứ cấp cellulose bã sữa phương pháp nhuộm Hematoxylin & Eosin đọc kết kính hiển vi JVC (TK-C1380E) Phân đoạn protein phương pháp điện di SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) để nhận diện có mặt protein kháng dinh dưỡng nhóm conglycinin gồm: α’conglycinin (72 kDa), α-conglycinin (68 kDa) β-conglycinin (52 kDa) nhóm glycinin gồm acidic (37 kDa) basic (20 Kda) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định hoạt độ cellulase thích hợp cho trình lên men Hoạt độ cellulase vi khuẩn Bacillus subtilis B3 thời điểm hoạt hóa khác thể Hình Mơi trường sau lên men cho thấy có gia tăng hoạt độ gần gấp đơi (85,75 U/ml) sau 48 hoạt hóa môi trường dinh dưỡng so với thời điểm 24 Tuy nhiên, hoạt độ cellulase vi khuẩn lên men pha loãng 100 lần (107 CFU/ gam) tương đương 8,5 U/ml, thấp so với nghiên cứu Kasai ctv., (2004) hoạt độ enzyme cellulase khoảng 50 U/g bổ sung để thủy phân vách tế bào bã sữa đậu nành, cần thiết phải bổ sung thêm enzyme thủy phân hòa tồn BSĐN Hình Hoạt độ cellulase vi khuẩn Bacillus subtilis B3 thời điểm hoạt hóa khác 66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 14 - THÁNG 10/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Xác định hoạt độ tối ưu cellulose cho trình thủy phân Bảng Hàm lượng glucose hoạt độ khác cellulose bã sữa đậu nành Enzyme cellulase (U/gam mẫu) 14 24 35 54 Kết glucose từ thủy phân vách tế bào, hoạt độ 54 U/g cho thấy glucose tạo cao (3.388±262,4 µg/g) Tuy nhiên, hoạt độ (54 U/g) cao gấp 1,5 lần so với 35 U/g (2.627±563,5 µg/g) lượng glucose tạo tăng gấp 1,3 lần Do đó, hiệu kinh tế, hoạt độ enzyme cellulase chọn bổ sung mức 35 U/gam mẫu Glucose (µg/g) 2.109±351,6 2.168±224,9 2.627±563,5 3.388±262,4 3.2 Khảo sát trình lên men kết hợp enzyme cellulase Bacillus subtilis B3 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian lên men Kết khảo sát mật độ vi khuẩn lên men bán rắn B subtilis B3 96 để xác định mật độ tối ưu thể Hình Hình Mật độ vi khuẩn (CFU/g) theo thời gian lên men kết hợp cellulase B subtilis B3 Kết cho thấy việc lên men bán rắn (CFU/g) trì tiếp tục đến 96 sau kết hợp thủy phân enzyme cellulase lên men cho thấy sau 48 đạt mật độ tối ưu Log =8,1 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men Hình Mật độ vi khuẩn B subtilis B3 nhiệt độ lên men bán rắn khác kết hợp thủy phân TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 14 - THÁNG 10/2019 67 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Khi lên men kết hợp thủy phân (Hình 5) cho thấy 24 đầu nhiệt độ 40oC có mật độ B subtilis B3 (Log=6,12 CFU/g) cao không đáng kể so với 37oC (Log=5,90 CFU/g) Tuy nhiên sau 48 lên men, nghiệm thức cho thấy đạt mật độ cao thời điểm này, cao 37oC (Log=8,11 CFU/g), 40oC (Log=7,76 CFU/g), nhiệt độ 30 oC cho thấy ln trì mật độ vi khuẩn thấp so với 37oC 40 oC 48 Từ 72 đến 96 giờ, mật độ vi khuẩn 40 oC 37 oC cho thấy giảm rõ rệt, thời điểm 72 vi khuẩn nhiệt độ 30 oC tăng mạnh tương đương so với 37 oC 96 cho thấy mật độ thấp nhiệt độ khảo sát 3.2.3 Ảnh hưởng giá trị pH Hình Mật độ B subtilis B3 lên men bán rắn kết hợp với thủy phân cellulase pH khác Từ Hình cho thấy pH 6,5 48 lên men bán rắn kết hợp thủy phân mật độ B subtilis B3 đạt mức cao (24 giờ, Log =6,97 CFU/g; 48 Log =8,84 CFU/g) so với pH Ở thời gian 72 cho thấy nghiệm thức pH có mật độ B subtilis B3 cao pH 6,5 pH 7, nhiên, sau 96 lên men cho thấy mật độ B subtilis B3 nghiệm thức tương đương khoảng Log= 6,3 CFU/g 3.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm Chất lượng sản phẩm tiến hành phân tích đánh giá Bảng Thành phần dinh dưỡng nguyên liệu lên men bán rắn Bã sữa đậu nành 88,79 Protein thô (%VCK*) 16,68±0,62 Bã sữa đậu nành + B subtilis B3 + cellulase 9,66 16,23 Ẩm Lipid (%VCK) 9,44±1,06 5,39±0,20 25,76±0,17 Tro (%VCK) 3,09±0,02 22,53 4,93±0,02 Xơ (%VCK) (*) VCK: Vật chất khô Kết từ việc lên men bã sữa đậu nành phương pháp bán rắn đánh giá Bảng (2) Ở thí nghiệm lên men bán rắn B subtilis B3 kết hợp thủy phân cellulase cho thấy hàm lượng protein không tăng so với bã sữa 68 đậu nành Trong đó, hàm lượng xơ lipid giảm rõ rệt so với nguyên liệu BSĐN ban đầu (12,54% 42,90%), nhiên hàm lượng tro thí nghiệm cho thấy gia tăng sau lên men TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 14 - THÁNG 10/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng Bảng kết so sánh hàm lượng protein tan, acid amin tự mật độ vi khuẩn bã sữa lên men bán rắn Nguyên liệu Bã sữa đậu nành Bã sữa đậu nành + B subtilis B3 + cellulase Protein tan (µg/g) Acid amin tự (µg/g) Mật độ B subtilis B3 sau sấy (CFU/g) 2,83 ± 0,34 0,30 ± 0,04 4,51 ± 0,08 0,93 ± 0,03 1,43 x 108 Các số protein tan, acid amin tự mật độ vi khuẩn B subtilis B3 Bảng 3, cho thấy lên men kết hợp cellulase thủy phân cho thấy hàm lượng protein tan tăng so với trước lên men 1,68 (µg/g), hàm lượng acid amin tự lên men kết hợp tăng 0,63 (µg/g) so với Hình Tế bào bã sữa trước xử lý nhiệt trước lên men Đồng thời, mật độ B subtilis B3 sản phẩm sau sấy khô đạt mật độ 108 (CFU/g), cho thấy nguyên liệu có dinh dưỡng đầy đủ cho vi khuẩn phát triển, xem dạng probiotic Hình Tế bào bã sữa sau xử lý nhiệt Hình Tế bào sau lên men vi khuẩn B subtilis B3 + cellulase pH 6,5 nhiệt độ 37oC, độ dày 3,0 cm Các hình ảnh mơ tế bào bã sữa đậu nành trước xử lý nhiệt, sau xử lý nhiệt sau lên men đề tài so sánh với nguyên liệu bã sữa xử lý nhiệt (Hình 8) nguyên liệu sau thủy phân B subtilis B3 enzyme cellulase cho thấy tương đương với kết nhóm nghiên cứu Kasai ctv., (2004) Từ hình ảnh mơ kết điện di (Hình 7, 8, 10) cho thấy bã sữa đậu nành thủy phân vách thứ cấp gần hoàn toàn dinh dưỡng bên vách tế bào bã sữa protein hầu hết thủy phân có phân tử lượng