Bài viết tiến hành phân lập và sàng lọc một số loài tảo biển dị dưỡng từ lá cây Đước và cây Mắm ở huyện Cần Giờ và Năm Căn có tích lũy lipid cao và đồng thời khảo sát môi trường dinh dưỡng, điều kiện môi trường nuôi cấy. Kết quả phân lập được loài Schizochytrium mangrove ĐCM có khả năng tích lũy lipid tổng số 26,65%.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN KẾT QUẢ PHÂN LẬP Schizochytrium MANGROVE GIÀU LIPID PHỤC VỤ CHO NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Võ Minh Sơn1*, Vương Thị Hồng Hạnh1 TĨM TẮT Acid béo khơng no cao phân tử (PUFA) nguồn dưỡng chất thiết yếu cho động vật thủy sản, giúp tăng trưởng, tăng tỉ lệ sống sinh sản, cải thiện hệ số thức ăn Do hạn chế cung cấp PUFA từ động vật thực vật, nhiều nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu cung cấp PUFA từ vi sinh vật vi tảo Trong vi tảo biển dị dưỡng (hay nấm biển) nguồn nguyên liệu cung cấp acid béo không no đầy tiềm Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập sàng lọc số loài tảo biển dị dưỡng từ Đước Mắm huyện Cần Giờ Năm Căn có tích lũy lipid cao đồng thời khảo sát môi trường dinh dưỡng, điều kiện môi trường nuôi cấy Kết phân lập loài Schizochytrium mangrove ĐCM có khả tích lũy lipid tổng số 26,65% Tảo S mangrovei ĐCM phát triển thích hợp ở pH 5-6, nồng độ muối 25-30‰, nồng độ đường 50-60 g.l-1, nguồn nitơ thích hợp bao gồm peptone, cao nấm men monosodium glutamate Từ khoá: PUFA, Schizochytrium, tảo dị dưỡng I MỞ ĐẦU Acid béo không no cao phân tử (PUFA) đóng vai trị quan trọng cấu trúc màng tế bào, phát triển hệ thần kinh cho trẻ sơ sinh phòng ngừa số bệnh tim mạch (Sijtsma Swaaf, 2004) Đối với động vật thủy sản, PUFA giúp phát triển tuyến sinh dục, tăng chất lượng trứng cá bột, tăng tỉ lệ sống tăng trưởng (Kanazawa ctv., 1979; Watanabe, 1993; Watanabe Vassallo-Agius, 2003) Nguồn cung cấp PUFA docosahexaenoic acid (DHA) eicosapentaenoic acid (EPA), chủ yếu từ lồi cá biển cá trích, cá thu, cá mịi, cá hồi (Gunstone, 1996) Dầu cá ứng dụng phổ biến thực phẩm dược phẩm, nhiên dầu cá có nhiều khuyết điểm chất lượng phụ thuộc vào lồi cá, mùa vụ, vi trí đánh bắt, nhiễm tạp dầu cá môi trường ô nhiễm, mùi vị khó chịu Ngồi dầu cá cịn chứa hỗn hợp loại acid béo, việc tách DHA hay EPA cho giá thành cao (Sijtsma Swaaf, 2004) Để đáp ứng nhu cầu sử dụng PUFA ngày cao, nhiều nghiên cứu tìm nguồn cung cấp PUFA cao từ vi sinh vật thay cho dầu cá thực vật Dầu vi sinh vật (microbial oil) hay dầu đơn bào (single-cell oil – SCO) bao gồm vi sinh vật vi khuẩn, vi tảo quang dưỡng dị dưỡng có khả tổng hợp PUFA nuôi cấy hệ thống lên men (Sijtsma Swaaf, 2004) PUFA tổng hợp từ Vibrio sp nước mặn nước đạt 10,7% (Ando ctv., 1992; Ringø ctv., 1992), Bacterium đạt 16% (Akimoto ctv., 1990); vi nấm Mortierella alpina S-4 đạt 23,6% (Shinmen ctv., 1992), Saprolegnia parasitica Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản * Email: vominhson@yahoo.com 38 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN đạt 3,9% (Kendrick Ratledge, 1992); từ vi tảo biển quang dưỡng Isochrysis galbana đạt 6,7% (Alonso ctv., 1992), Nannochloropsis oculata đạt 12,9% (Chini Zittelli ctv., 1999); nhóm vi tảo biển dị dưỡng (Thraustochytrid labyrinthulid) có khả tích lũy HUFA cao tảo Crypthecodinium cohnii đạt 30% (Kyle Gladue, 1991), tảo Schizochitryum sp đạt 35-40% (Yokochi ctv., 1998) Thraustochytrium aureum ATCC 34304 đạt khoảng 50% (Bajpai ctv., 1991) Hiện nay, nhà khoa học đặc biệt quan tâm tới nhóm vi sinh vật thuộc nhóm tảo biển hay nấm biển dị dưỡng, chúng có khả sinh trưởng nhanh, sinh khối cao, tích lũy acid béo mạch dài đa nối đôi cao (Barclay, 1992) hàm lượng sterol cao cần thiết cho phát triển tơm, tích lũy HUFA (ω-3 ω-6), protein, carbonhydrate, sắc tố vitamin Các yếu tố dinh dưỡng giúp cho ấu trùng tôm phát triển nhanh, tỉ lệ sống cao, tôm post khỏe mạnh (Barclay, 2006) Tảo Schizochytrium sp sử dụng làm giàu luân trùng Artemia giúp cho ấu trùng cá biển phát triển tốt bổ sung EPA DHA cho cá bố mẹ giúp tăng cường chất lượng trứng tinh trùng (Castillo ctv., 2009; Harel ctv., 2002) Thraustochytrid sinh vật đơn bào nước mặn (marine protist) hay vi sinh vật giống nấm (fungi-like microbe), hay gọi tảo biển dị dưỡng (marine heterotrophic) xếp vào lớp Labryinthulomycetes, ngành Heterokontophyta, giới Chromista, bao gồm giống Thraustochytrium, Aplanochytrium, Japonochytrium, Ulkenia, Schizochytrium Thraustochytrid thường gặp vùng cửa sông, vùng rừng ngập mặn, kiểu dinh dưỡng hoại sinh, phân hủy hợp chất hữu trầm tích (Kamlangdee Fan, 2003) Nhóm Thraustochytrid có khả sử dụng đa dạng nguồn carbon nitrogen (Goldstein, 1963), tiết enzyme ngoại bào cellulase, amylase (Raghu-kumar, 2002) ngồi cịn tích lũy carotenoid (Carmona ctv., 2003) Blume, thuộc họ Đước Rhizophoraceae) Sinh khối tảo Schizochytrium sp khô hay tươi sử dụng dùng làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng tôm hay làm giàu thông qua luân trùng Artemia Tảo Schizochytrium sp có nhiều ưu điểm thích hợp cho việc ương ni ấu trùng tơm kích thước nhỏ 50μm, chứa II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Mẫu Đước (Rhizophora apiculata Mắm (Avicennia sp Vierrh, thuộc họ Cỏ roi ngựa Verbenaceae) giai đoạn phân hủy rừng ngập mặn thuộc xã Tam Hiệp, huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chi Minh huyện Năm Căn, tỉnh Cà Mau Mơi trường phân lập cải tiến có kí hiệu GPYc (Hồng ctv., 2008) bao gồm: glucose (20 g/l), cao nấm men (4 g/l), agar (16 g/l) nước biển có độ mặn 25‰ Mơi trường sau hấp tiệt trùng, đợi nguội, bổ sung thêm kháng sinh, bao gồm Streptomiceine 50000 IU/ ml (0,1%), Peniciline 50000 IU/ml (0,1%) Ampiciline 50000 IU/ml (0,1%) Môi trường lỏng sau phân lập (Hồng ctv., 2008), vi tảo nuôi cấy môi trường M1 cải tiến, có thành phần glucose (30 g/l), cao nấm men (10 g/l) nước biển có độ mặn 25‰ Hấp tiệt trùng 121oC, atm, 15 phút trước sử dụng Hóa chất Nile Red/DMSO (Sigma) dùng nhuộm lipid TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 39 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Vi tảo Schizochytrium được phân lập theo phương pháp của Yokochi ctv., (1998) Các mẫu lá Đước và lá Mắm được rửa bằng nước biển đã khử trùng, sau đó đặt lá vào đĩa petri vô trùng có chứa nước biển 25‰, dùng tăm cạo nhẹ mặt lá Sau đó dịch của lá được ly tâm 2000rpm, 4ºC 10 phút Loại bỏ dịch treo, phần còn lại được pha loãng bậc 10 nước biển Mỗi nồng độ pha loãng trải đĩa thạch GPYc Các đĩa này ủ ở nhiệt độ 28ºC, tối, khoảng 3-5 ngày tiến hành quan sát kính hiển vi Các tế bào tảo Schizochytrium có dạng hình tròn, có nhiều tế bào nang, hay có các bào tử di động Chọn khuẩn lạc tảo Schizochytrium và cấy chuyền nhiều lần qua đĩa thạch có chứa môi trường GPYc có bổ sung kháng sinh cho đến thu được khuẩn lạc thuần 2.2.2 Định tính lipid phương pháp nhuộm với Nile Red Bằng phương pháp nhuộm lipid với Nile Red để tìm chủng vi tảo có chứa hạt lipid nhiều hay ít Phương pháp tiến hành theo mô tả AAT Bioquest®, Inc (2012) được tóm tắt sau Dung dịch Nile Red/DMSO đệm PBS có nồng độ 200 –1000 nM, bảo quản -20ºC tránh ánh sáng Thu sinh khối tảo cách ly tâm 6000 rpm dịch tế bào 10 phút 4ºC, cho mật độ tế bào đạt khoảng 1-5×105 (cfu.ml-1) Sau ly tâm, thu cặn, bổ sung 500 μl dung dịch nhuộm giữ nhiệt độ phòng 5-10 phút, tránh ánh sáng Sau loại bỏ dung dịch nhuộm cách ly tâm rửa lại sinh khối đệm PBS Sau nhuộm, tiến hành quan sát kính hiển vi huỳnh quang bước sóng khoảng 552-636 nm Tại bước sóng này, hạt lipid tế bào nhuộm bắt màu vàng cam sáng tế bào màu đen 40 2.2.3 Định lượng lipid tổng số Sau định tính lipid, tiến hành ni cấy chủng erlen 500 ml có chứa 250 ml mơi trường M1 ngày 28oC lắc 200 rpm Sau ngày nuôi cấy, sinh khối thu cách ly tâm dịch tế bào 6.000 rpm 4oC 10 phút Bỏ dịch, cặn được cấp đông qua đêm tủ -80ºC Sau đó, tiến hành đơng khô nhằm thu sinh khối khô Đo lipid tổng phương pháp Folch, phịng Phân tích chất lượng thực phẩm dinh dưỡng thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch – Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II Sau định lượng sinh khối khơ chủng có hàm lượng lipid cao nhất, chọn chủng để tiến hành định danh hình thái làm đối tượng nghiên cứu cho khảo sát 2.2.4 Định danh tảo bằng hình thái Quan sát hình thái tế bào tảo theo mô tả của Raghu-Kumar (1988) để định danh chủng tảo phân lập Khuẩn lạc tảo thuần được cấy môi trường M1 lỏng và quan sát liên tục hình thái tế bào qua các giai đoạn phát triển kính hiển vi Quang học BX51 (Olympus, Nhật Bản) có độ phóng đại 100x 2.2.5 Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng tới tăng trưởng + Khảo sát môi trường và đường cong tăng trưởng Khảo sát tăng trưởng của tảo các môi trường bản nhằm chọn môi trường thích hợp cho nhân giống Các môi trường khảo sát chuẩn bị theo mô tả nghiên cứu trước cố định nồng độ đường, nitơ nồng độ muối Các môi trường bao gồm M1 (Hồng ctv., 2008), môi trường M2 (Honda ctv., 1998) M3 (Wu ctv., 2005) được mô tả Bảng Chuẩn bị môi trường 50 ml erlen 100 ml, môi trường lặp TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN lại lần Các môi trường hấp tiệt trùng 121oC, 1atm 15 phút trước sử dụng Riêng môi trường M2, thành phần vitamine bổ sung sau hấp làm nguội Giống hoạt hóa mơi trường lỏng M1 cấy vào bình với mật độ 5,3 log Nuôi cấy lỏng lắc 200 rpm 28oC ngày Theo dõi mật độ tế bào hàng ngày cách đếm tế bào với buồng đếm hồng cầu cân trọng lượng khô tế bào sau lọc thể tích, sau sấy 105oC Bảng Thành phần môi trường Thành phần Môi trường M1 Môi trường M2 Môi trường M3 Glucose (g.l ) 20 20 20 Cao nấm men (g.l-1) 4 NaCl (g.l-1) 25 25 25 Monosodium glutamate (g.l-1) - - KH2PO4 (g.l ) - 0,1 (NH4)2SO4 (g.l-1) - 0,2 - MgSO4 7H2O (g.l-1) - - CaCl2 (g.l-1) - - 0,2 KCl (g.l-1) - - Vitamine B1 - 0,1 µg/L - Vitamine B12 - 0,01 µg/L - Vitamine H - µg/ml - -1 -1 + Khảo sát đường cong tăng trưởng Chủng tảo đuợc hoạt hóa mơi trường bản ngày, sau cấy chuyền vào môi trường bản tối ưu với mật độ ban đầu 5,3 log Nuôi lỏng lắc 200 rpm 280C 14 ngày Theo dõi thay đổi mật độ tế bào (MĐTB), trọng lượng khô (TLK) kích thước tế bào (KTTB) ngày + Khảo sát pH Sử dụng mơi trường thích hợp để làm môi trường cho khảo sát pH Các thành phần môi trường cố định, thay đổi nồng độ pH nghiệm thức Các nghiệm thức chuẩn bị bình erlen 100 ml chứa 50 ml môi trường khảo sát Khảo sát giá trị pH 5; 6; 7; Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Chủng khảo sát hoạt hóa mơi trường M1 cấy vào bình với mật ban đầu 5,3 log Nuôi lỏng lắc 200 rpm ngày 28oC Theo dõi mật độ tế bào hàng ngày và cân trọng lượng khô + Khảo sát sảnh hưởng nồng độ muối, glucose, nguồn nitrogen lên tăng trưởng tế bào Sử dụng môi trường bản thích hợp để làm môi trường cho khảo sát nồng độ muối 10, 15, 20; 25 30‰; nồng độ glucose: 20; 30; 40; 50 60 g/l; Khảo sát nguồn nitơ hữu và vô cơ: cao nấm men (g/l), peptone (g/l), monosodium glutamate (g/l), NaNO3 (g/l) NH4Cl (g/l) Các nghiệm thức chuẩn bị bình erlen 100 ml chứa 50 ml môi trường khảo sát Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Chủng khảo sát cấy vào bình với mật ban đầu là 5,3 log Nuôi lỏng lắc 200 rpm ngày 28oC Theo dõi mật độ và cân trọng lượng khơ TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 41 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN + Đánh giá ảnh hưởng môi trường tối ưu lên phát triển chủng tảo phân lập Môi trường bản thích hợp ở sử dụng làm mơi trường khảo sát thí nghiệm Các thành phần khác môi trường cố định, thay đổi giá trị pH, nồng độ muối, nồng độ đường nguồn nitơ thích hợp xác định từ khảo sát Thí nghiệm chuẩn bị bình erlen 500 ml chứa 250 ml môi trường với lần lặp lại Chủng khảo sát cấy chuyển vào bình mơi trường có mật đợ 5,3 log Tiến hành thí nghiệm ngày 280C lắc 200 rpm Theo dõi mật độ tế bào hàng cách đếm với buồng đếm hồng cầu, cân trọng lượng khô tế bào sau lọc thể tích, sau sấy 105oC đo kích thước tế bào Kết sử dụng để dựng lại đường cong tăng trưởng cho chủng khảo sát 2.2.6 Xử lý số liệu Sử dụng phân tích ANOVA yếu tố để phân tích số liệu Khi bảng ANOVA xác định khác biệt có ý nghĩa nhóm, phép so sánh multiple comparision test (Tukey’s) sử dụng để so sánh khác biệt có ý nghĩa có ý nghĩa thống kê (p 0,05) Tuy nhiên, TLK tảo S mangrovei ĐCM nuôi nồng độ muối 25‰ (11,23 ± 1,25 mg/ml) 30‰ (11,83 ± 0,15 mg/ml) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với nồng độ muối khác (Hình 6) Hình Mật độ tế bào trọng lượng khô tảo S mangrovei ĐCM ni mơi trường có nồng độ muối khác sau ngày 46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN + Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose 0,09 log) 50 g/l (7,39 ± 0,08 log) khác biệt Chủng S mangrovei ĐCM có khả glucose 60 g/l (22,57 ± 0,31 mg/ml) cao khác phát triển tốt nồng độ đường từ 20 biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với nồng - 60 g/l (Hình 7) MĐTB nồng độ đường 60 độ lại TLK nồng độ glucose 50 g/l g/l (7,54 ± 0,11 log) cao khác biệt có ý nghĩa 60 g/l khác biệt khng có ý nghĩa thống kê (p (p < 0,05) so với nồng độ 30 g/l (7,31 ± 0,10 < 0,05) Do vậy, thí nghiệm khảo sát log) MĐTB nồng độ 20 g/l (7,46 ± 0,35 môi trường TU đề tài, sử dụng nồng độ log), 30 g/l (7,31 ± 0,10 log), 40 g/l (7,43 ± glucose 50 g/l khơng có ý nghĩa (p > 0,05) TLK nồng độ Hình Mật độ tế bào trọng lượng khô tảo S mangrovei ĐCM ni mơi trường có nồng độ glucose khác sau ngày Theo báo cáo Wu ctv., (2005) cho nitơ khác Xét TLK, nguồn thấy, nồng độ glucose thích hợp cho nitơ khơng có khác biệt mặt thống kê (p > phát triển chủng Schizochytrium sp S31 0,05) Xét MĐTB có khác biệt rõ rệt Cao khoảng 20 – 40 g/l Còn báo cáo nấm men (7,46 ± 0,04 log) peptone (7,63 ± Hồng ctv., (2007) cho thấy, chủng 0,10 log) có MĐTB cao khác biệt có ý nghĩa (p Schizochytrium PQ6 PQ7, nồng độ glucose < 0,05) so với môi trường chứa nguồn thích hợp khoảng 60 – 90 g/l Trong nitơ khác Môi trường chứa NH4Cl (6,31 ± 0,03 nghiên cứu cho thấy nồng độ 50g/l cho thích hợp cho tăng sinh khối mật độ tế bào tảo S mangrovei ĐCM + Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ Chủng S mangrovei ĐCM có khả phát triển mơi trường chứa nguồn log) có MĐTB thấp khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với nguồn nitơ cịn lại Vậy tảo S mangrovei ĐCM có khả sử dụng nguồn nitrogen theo thứ tự: peptone, cao nấm men (yeast extract), monosodium glutamate, NaNO3, NH4Cl TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 47 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Theo dõi phát triển hàng ngày chủng Trong đó, mơi trường chứa NH4Cl, tế bào Schizochytrium ĐCM môi trường chứa phát triển không bình thường, kích thước tế bào nguồn nitơ khác cho thấy, tế bào nhỏ trọng lượng khô thấp Ở mơi trường có mơi trường chứa cao nấm men, peptone chứa NaNO3 quan sát thấy, kích thước tế monosodium glutamate phát triển tốt bào lớn trọng lượng tế bào cao ngược mật độ, trọng lượng khơ kích thước tế bào lại mật độ tế bào thấp Hình Mật độ tế bào trọng lượng khô tảo Schizochytrium ĐCM ni mơi trường có nguồn nitơ khác sau ngày + Đánh giá ảnh hưởng môi trường tối ưu Dựa môi trường bản M3 và đồng thời thay đổi các giá trị pH, nồng độ muối và đường, nguồn nitơ thông qua các kết quả khảo sát chọn nồng độ tối ưu sau: Môi trường tối ưu (MTTU) bao gồm: glucose (50g/l), cao nấm men (4g/l), monosodium glutamate (1g/l), NaCl (25g/l), CaCl2 (0,2g/l), KCl (1g/l), KH2PO4 (1g/l), MgSO4.7H2O (5g/l) và pH Hình Mật độ tế bào, trọng lượng khơ kích thước tế bào chủng S mangrovei ĐCM sau nuôi 14 ngày môi trường MTTU 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Kết quả khảo sát MTTU cho thấy MĐTB ban đầu 5,30 ± 0,06 log sau ngày đạt trạng thái cân 7,65 ± 0,06 log Duy trì trạng thái cân từ ngày thứ (7,65 ± 0,06 log) đến ngày thứ 14 (7,55 ± 0,01 log) Trong đó, TLK ngày (0,02 ± 0,01 mg/ ml) tăng mạnh đến ngày thứ (19,03 ± 0,42 mg/ml) sau trì cân tới ngày thứ 10 (18,62 ± 0,39 mg/ml) Từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 14 (17 ± 0,78 mg/ml) bắt đầu giảm nhẹ KTTB ngày 14,1 µm, sau ngày giảm mạnh cịn 5,1 µm Từ ngày (5,1 µm) ngày thứ (12,5 µm) tăng mạnh, sau tăng chậm đến ngày thứ 14 (14,31 µm) Kết cho thấy MTTU, chủng S mangrovei ĐCM đạt mật độ cực đại và kích thước tế bào tương đương nuôi môi trường bản M3 Tuy nhiên trọng lượng khô tăng gấp lần (M3: 9,68mg/ml, MTTU: 19,15 mg/ml) IV THẢO LUẬN Leaño ctv., (2003) phân lập chủng Schizochytrium mangrovei (IAo-1 and IXm6), Schizochytrium sp BSn-1 có hàm lượng lipid tổng số 16%-39% Wu ctv., (2005) khảo sát khả tích luỹ lipid tổng số chủng Schizochytrium sp S31 (ATCC 20888) đạt 40% trọng lượng khô Ở Việt Nam, chủng tảo Schizochytrium PQ6 PQ7 phân lập từ Đước vùng biển Phú Quốc có khả ni mơi trường tối ưu Theo nghiên cứu Barclay (2006) rằng, chi Schizochytrium phát triển tốt môi trường có pH từ 6,0 – 8,5 tùy theo lồi có khoảng pH tối ưu riêng cho phát triển tế bào tích lũy lipid lồi Theo kết thí nghiệm thấy, chủng S mangrovei ĐCM, có khả phát triển tốt mơi trường có tính acid (pH = pH = 6) Theo báo cáo Barclay (2006) chi Schizochytrium có khả sống mơi trường có nồng độ muối 75‰ tốt nồng độ muối nhỏ 50‰ tốt 25‰ Schizochytrium N-2 phân lập từ già Đước (Kandelia candel) Hong Kong, có khả phát triển mơi trường có độ mặn từ – 30 ‰ độ mặn tối ưu cho phát triển dao động từ 20 – 30 ‰ (Kamlangdee Fan, 2003) Theo Leo ctv., (2003) thử nghiệm điều kiện ni cấy chủng Schizochytrium mangrovei (IAo-1 IXm-6) chủng Schizochytrium sp BSn-1, cho thấy chúng phát triển tốt độ mặn 15 – 30‰ nhiệt độ 20 -30 oC, đạt sinh khối khô mg/ml hàm lượng lipid tổng số 16 – 39% Kết thí nghiệm cho thấy, chủng Schizochytrium ĐCM phát triển tốt nồng độ muối từ 25 30‰ Điều phù hợp với nghiên cứu trước tích luỹ lipid tổng số đạt 38%-41% trọng lượng Theo báo cáo Wu ctv., (2005) cho khô (Hồng ctv., 2008) Trong nghiên cứu thấy, nồng độ glucose thích hợp cho phân lập chủng tảo ĐCM có phát triển chủng Schizochytrium sp S31 khả tích luỹ lipid tởng sớ đạt 26,7% trọng khoảng 20 – 40 g/l Còn báo cáo lượng khô nuôi môi trường bản Do Hồng ctv., (2007) cho thấy, chủng đó chủng ĐCM có tiềm tích lũy lipid cao Schizochytrium PQ6 PQ7, nồng độ glucose TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 49 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN thích hợp khoảng 60 – 90 g/l Trong nghiên cứu cho thấy nồng độ 50g/l cho thích hợp cho tăng sinh khối mật độ tế bào tảo S mangrovei ĐCM Theo mô tả Wu (2005) khảo sát nguồn nitơ khác cho thấy cao nấm men (0,4%) thích hợp cho tảo Schizochytrium sp phát triển tăng sinh khối, tích lũy lipid DHA Cịn nguồn nitơ khác monosodium glutamate, NH4Cl NaNO3 monosodium glutamate 0,1% cho kết cao cho q trình tích lũy lipid phát triển tế bào V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết quả phân lập được chủng tảo dị dưỡng Schizochytrium mangrovei ĐCM có khả tích lũy lipid tổng số 26,65% Tảo S mangrovei ĐCM phát triển thích hợp ở pH 5-6, nồng độ muối 25-30‰, nồng độ đường 50-60 g/l, nguồn nitơ thích hợp bao gồm peptone, cao nấm men monosodium glutamate 5.2 Đề nghị Cần nghiên cứu thêm điều kiện nuôi cấy nhằm nâng cao hàm lượng lipid HUFA Thử nghiệm ứng dụng tảo S.mangrovei ĐCM làm giàu luân trùng Artemia nhằm nâng cao tỉ lệ sống số ấu trùng cá biển Thử nghiệm dùng tảo S.mangrovei ĐCM làm thức ăn cho zoea tôm thẻ, ương nuôi động vật hai mảnh vỏ LỜI CẢM ƠN Để hồn thành nghiên cứu này, tơi xin chân thành cảm ơn Anh Chị phòng Nguồn Lợi Khai thác thủy sản nội địa (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II) giúp thu mẫu Tơi chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo phịng Sinh học Thực nghiệm Viện Nghiên Cứu NTTS II tạo điều kiện sở vật chất cho thực nghiên cứu Xin cảm ơn bạn sinh viên trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ nghiên cứu đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO Akimoto, M., Ishii, T., Yamagaki, K., Ohtaguchi, K., Koide, K., and Yazawa, K., 1990 Production of eicosapentaenoic acid by a bacterium isolated from mackerel intestines Journal of the American Oil Chemists’ Society 67, 911-915 Barclay, W R., 1992 Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids U.S Patent 5, 130, 242 Alonso, D L., Grima, E M., Pérez, J A S., Sánchez, J L G., and Camacho, F G., 1992 Isolation of clones of Isochrysis galbana rich in eicosapentaenoic acid Aquaculture 102, 363-371 Barclay, W R., 2006 Schizochytrium and Thraustochytrium strains for producing high concentrations of omega-3 unsaturated fatty acids, Martek Biosciences Corporation, United States Patent 7,022,512 B2 Ando, S., Nakajima, K., and Hatano, M., 1992 Incorporation of n-3 polyunsaturated fatty acids into phospholipids of a marine bacterium Vibrio sp cultivated with sardine oil Journal of Fermentation and Bioengineering 73, 169-171 Carmona, M L., Naganuma, T., and Yamaoka, Y., 2003 Identification by HPLC-MS of carotenoids of the Thraustochytrium CHN-1 strain isolated from the Seto Inland Sea Biosci Biotechnol Biochem 67, 884-8 Bajpai, P., Bajpai, P., and Ward, O., 1991 Production of docosahexaenoic acid by Thraustochytrium aureum Applied Microbiology and Biotechnology 35, 706-710 Chini Zittelli, G., Lavista, F., Bastianini, A., Rodolfi, L., Vincenzini, M., and Tredici, M R., 1999 Production of eicosapentaenoic acid by Nannochloropsis sp cultures in outdoor tubular 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN photobioreactors Journal of Biotechnology 70, 299-312 mangroves, Philippines Fungal Diversity 12, 111-122 Goldstein, S., 1963 Development and nutrition of new species of Thraustochytrium American Journal of Botany 50, 271-279 Product Technical Information Sheet, 2012 Nile Red *UltraPure Grade*, AAT Bioquest®, Inc., US Gunstone, F D., 1996 Fatty acid and lipid chemistry Blackie Academic, London Honda, D., Yokochi, T., Nakahara, T., Erata, M., and Higashihara, T., 1998 Schizochytrium limacinum sp nov., a new thraustochytrid from a mangrove area in the west Pacific Ocean Mycological Research 102, 439-448 Hồng, Đ D., Anh, H L., and Thu, N T H., 2008 Phân lập vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium giàu DHA vùng biển huyện đảo Phú Quốc Tạp chí sinh học 30, 50-55 Hồng, Đ D., Hiền, H M., Hưng, N Đ., Nam, H S., Anh, H L., Thu, N H., and Chi, Đ K., 2007 Nghiên cứu trình sinh tổng hợp DHA từ lồi vi tảo biển dị dưỡng Labyrinthula, Schizochytrium ứng dụng Tạp Chí Khoa Học Cơng Nghệ 45, 144-154 Kamlangdee, N., and Fan, K W., 2003 Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp isolated from mangrove Songklanakarin J Sci Technol 25, 643-650 Kanazawa, A., Teshima, S., and Endo, M., 1979 Requirements of prawn Penaeus japonicus for essential fatty acids Memories of the Faculty of Fisheries of Kagoshima University 28, 27-33 Kendrick, A., and Ratledge, C., 1992 Lipids of selected molds grown for production of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids Lipids 27, 15-20 Kyle, D J., and Gladue, R M., 1991 Eicosapentaenoic acids and methods for their production International Patent Application, Patent Cooperation Treaty Publication WO 91/14427, October 3, 1991 Leaño, E M., Gapasin, R S J., Polohan, B., and Vrijmoed, L L P., 2003 Growth and fatty acid production of thraustochytrids from Panay Raghu-Kumar, S., 1988 Schizochytrium mangrovei sp now., a Thraustochytrid from mangroves in India Trails Br My col Soc 90, 627-631 Raghu-kumar, S., 2002 Ecology of the marine protists, the Labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and Labyrinthulids) European Journal of Protistology 38, 127-145 Ringø, E., Jøstensen, J., and Olsen, R., 1992 Production of eicosapentaenoic acid by freshwater Vibrio Lipids 27, 564-566 Shinmen, Y., Kawashima, H., Shimizu, S., and Yamada, H., 1992 Concentration of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid in an arachidonic acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4, grown with fish oil Applied Microbiology and Biotechnology 38, 301-304 Sijtsma, L., and Swaaf, M E., 2004 Biotechnological production and applications of the ω-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid Applied Microbiology and Biotechnology 64, 146-153 Watanabe, T., 1993 Importance of docosahexaenoic acid in marine larval fish Journal of the World Aquaculture Society 24, 152-161 Watanabe, T., and Vassallo-Agius, R., 2003 Broodstock nutrition research on marine finfish in Japan Aquaculture 227, 35-61 Wu, S.-T., Yu, S.-T., and Lin, L.-P (2005) Effect of culture conditions on docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp S31 Process Biochemistry 40, 3103-3108 Yokochi, T., Honda, D., Higashihara, T., and Nakahara, T., 1998 Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21 Applied Microbiology and Biotechnology 49, 72-76 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 51 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN RESULTS OF ISOLATION OF Schizochytrium MANGROVE WITH HIGH LIPID FOR AQUACULTURE Vo Minh Son1*, Vuong Thi Hong Hanh1 ABSTRACT PUFA is essential nutrient for aquatic animal, promoting growth, increasing survival rate and reproductivity, improving FCR Because PUFA/HUFA supplying source is limitated from animals and plants, many scientist are looking for PUFA/HUFA supplying from micro-bacteria and microalgae in which heterotrophic microalgae (or marine fungi) have ability to stimulate high unsaturated fatty acid This research, heterotrophic microalgae were isolated from leaf of mangrove in Can Gio and Nam Can province and evaluation of culture condition The result showned that Schizochitryum mangrove ĐCM had ability to stimulate 26,65% total lipid S mangrove ĐCM was culture in the medium with pH 5-6, salinity 25-30%0, 50-60 g/l glucose, and nitrogen source is from peptone, yeast extract, and monosodium glutamate Keywords: HUFA, Schizochytrium, heterotrophic microalgae Người phản biện: TS Đặng Tố Vân Cầm Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015 Ngày duyệt đăng: 15/6/2015 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No * Email: vominhson@yahoo.com 52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 ... nhuộm lipid TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 39 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Vi tảo Schizochytrium được phân lập... phịng Phân tích chất lượng thực phẩm dinh dưỡng thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch – Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II Sau định lượng sinh khối khô chủng có hàm lượng lipid. .. ctv., (2003) phân lập chủng Schizochytrium mangrovei (IAo-1 and IXm6), Schizochytrium sp BSn-1 có hàm lượng lipid tổng số 16%-39% Wu ctv., (2005) khảo sát khả tích luỹ lipid tổng số chủng Schizochytrium