Xử lý tình huống khi tách chiết ADN trong chương trình Sinh học cấp trung học phổ thông

Bài viết chỉ ra các tình huống thường gặp và cách xử lý, giúp quá trình thực hiện trở nên đơn giản, giảm thiểu thời gian, tăng độ tin cậy đối với kết quả thí nghiệm. Đồng thời, bài báo còn đề xuất quy trình tách chiết, nhận diện ADN đã được cải tiến nhằm giúp giáo viên và học sinh chủ động trong thực hiện và giảng dạy thí nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm ở trường phổ thông hiện nay.

Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Xã hội Nhân văn ISSN 2588-1213 Tập 129, Số 6A, 2020, Tr 67–75; DOI: 10.26459/hueuni-jssh.v129i6A.5658 XỬ LÝ TÌNH HUỐNG KHI TÁCH CHIẾT ADN TRONG CHƯƠNG TRÌNH SINH HỌC CẤP TRUNG HỌC PHỔ THÔNG Lê Minh Đức1, Phan Đức Duy2*, Lữ Thị Thanh Nga3 Trường Đại học Sài Gòn, 273 An Dương Vương, Hồ Chí Minh, Việt Nam Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế, 34 Lê Lợi, Huế, Việt Nam 3Trường THPT Tân Bình, 19 Hoa Bằng, TP Hồ Chí Minh Tóm tắt: Trong q trình tách chiết ADN tế bào động vật hay thực vật thuộc nội dung thực hành “Xác định thành phần hóa học tế bào” chương trình Sinh học 10 xuất nhiều tình gây khó khăn cho giáo viên học sinh Bài báo tình thường gặp cách xử lý, giúp trình thực trở nên đơn giản, giảm thiểu thời gian, tăng độ tin cậy kết thí nghiệm Đồng thời, báo cịn đề xuất quy trình tách chiết, nhận diện ADN cải tiến nhằm giúp giáo viên học sinh chủ động thực giảng dạy thí nghiệm điều kiện phịng thí nghiệm trường phổ thơng Từ khóa: Tách chiết ADN, thực hành sinh học 10, xử lý tình huống, cải tiến thí nghiệm Mở đầu Chương trình Sinh học 10 hành chương trình giáo dục phổ thơng (2018) có nội dung thực hành thí nghiệm nhận biết thành phần hóa học tế bào Được thể cụ thể nội dung “Thí nghiệm sử dụng enzim dứa tươi để tách chiết ADN” (Sinh học 10 hành), thực hành xác định số thành phần hoá học có tế bào: protein, lipid, acid nucleic (Chương trình giáo dục phổ thơng mới) Thực tế thực nội dung theo quy trình sách giáo khoa (SGK), xuất khó khăn, bất cập, hạn chế điều kiện phịng thí nghiệm trường phổ thông khâu chuẩn bị mẫu vật, pha chế sử dụng hóa chất, thao tác thực Mặt khác, kết thí nghiệm chưa chứng minh phần kết tủa màu trắng đục ADN Chúng gọi tình xảy q trình thực giảng dạy thí nghiệm Đối với tình này, hầu hết giáo viên khơng tìm biện pháp xử lý thích hợp Vì vậy, giáo viên thường dạy nội dung thực hành này, làm giảm hứng khởi học sinh học kiến thức tế bào học di truyền học Với lý trên, nghiên cứu thực với mục tiêu *Liên hệ: duy1264@gmail.com Nhận bài:17-02-2020; Hoàn thành phản biện: 05-3-2020; Ngày nhận đăng: 06-3-2020 Lê Minh Đức, Phan Đức Duy, Lữ Thị Thanh Nga Tập 129, Số 6A, 2020 cung cấp cho giáo viên tình xuất trình tách chiết ADN tế bào động vật, thực vật đề xuất biện pháp xử lý cách khoa học, hiệu Trên sở đề xuất quy trình tách chiết ADN cải tiến để giáo viên học sinh thực thí nghiệm đơn giản, nhanh, tiết kiệm chi phí thời gian hơn, phù hợp với điều kiện dạy học trường phổ thông [1, 2] Phương pháp – Tiến hành khảo sát, vấn giáo viên phổ thơng chun gia để thu thập nguồn tình liên quan đến thí nghiệm Đề xuất phương án xử lý, lựa chọn thực nghiệm phương án chọn – Chọn quy trình tách chiết ADN SGK sinh học 10 làm chuẩn Tiến hành cải tiến bước thực hiện, cơng đoạn thí nghiệm Mỗi bước bố trí nghiệm thức lặp lại lần, tiến hành so sánh đánh giá kết – Phát đề xuất biện pháp xử lý tình xây dựng quy trình cải tiến theo hướng: đơn giản, dễ thực hiện, an toàn, giảm chi phí, tiết kiệm thời gian, tỉ lệ thành cơng cao Tiêu chí bao gồm: lượng phân tử ADN thu nhiều chứng minh phân tử tách chiết ADN thông qua phản ứng màu đặc trưng [3] Kết thảo luận 3.1 Mục tiêu thí nghiệm tách chiết ADN – Học sinh tách chiết ADN khỏi tế bào hóa chất dụng cụ đơn giản – Giải thích chất, ý nghĩa bước tiến hành thí nghiệm quy trình tách chiết ADN – Thực phản ứng màu đặc trưng để nhận biết ADN – Rèn luyện thao tác thí nghiệm, phân tích kết nhận diện ADN 3.2 Thực trạng dạy học thí nghiệm tách chiết ADN giáo viên phổ thơng Qua việc vấn điều tra phiếu 90 giáo viên trung học phổ thông địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp Đồng Nai, nhận thấy: – 94,4% (85/90) giáo viên nhận thấy cần thiết cho học sinh thực hành tách chiết quan sát ADN từ động vật thực vật – 27,8% (25/90) giáo viên chưa tự tin việc hướng dẫn học sinh sử dụng thiết bị thực bước thực hành thí nghiệm 68 Jos.hueuni.edu.vn Tập 129, Số 6A, 2020 – 28,9% (26/90) giáo viên tự tin việc giải thích, chứng minh kết thí nghiệm – Chỉ có 12,2% (11/90) giáo viên có dạy thực hành tách chiết ADN phịng thí nghiệm, 100% giáo viên chưa chứng minh kết tủa thu thí nghiệm có phải ADN hay khơng Những khó khăn giáo viên gặp phải tiến hành thí nghiệm sau: – Không đủ thời gian để thực việc tách chiết ADN tiết học – Khó thực khâu xử lý bảo quản mẫu gan gà gan heo tiết học thực hành phịng thí nghiệm khơng có tủ lạnh bảo quản dạy nhiều lớp tuần – Kết tủa ADN thu gan gà gan heo lẫn nhiều tạp chất – Giáo viên chưa chứng minh kết tủa thu có phải ADN hay khơng Những khó khăn ảnh hưởng khơng nhỏ đến kết dạy học thực hành thí nghiệm Thực tế đặt yêu cầu cần thiết phải nghiên cứu khắc phục tình tiến hành giảng dạy thí nghiệm Xây dựng quy trình tách chiết ADN cải tiến phù hợp với điều kiện nhà trường phổ thơng 3.3 Hệ thống tình biện pháp xử lý thực hành thí nghiệm tách chiết ADN Quy trình sử dụng enzyme dứa tươi để tách chiết ADN (SGK sinh học 10) gồm bước sau: nghiền mẫu vật, tách ADN khỏi tế bào nhân tế bào, kết tủa ADN dịch tế bào cồn tách ADN khỏi lớp cồn [2] Quy trình khơng có công đoạn nhận dạng ADN sau tách khỏi tế bào, gây khó khăn cho giáo viên việc phân tích, chứng minh kết thí nghiệm 3.3.1 Tình sử dụng hóa chất, dụng cụ thí nghiệm – Dụng cụ thí nghiệm Tình 1: Sau thu dịch chiết tế bào, quy trình SGK sử dụng ống nghiệm để thực bước Thực tế cho thấy, ống nghiệm tích, diện tích mặt thoáng nhỏ nên việc kết tủa ADN cồn cần nhiều thời gian lượng ADN thu Thao tác khuấy, vớt ADN khó khăn Biện pháp xử lý: Thay ống nghiệm cốc thủy tinh 100 ml 250 ml Kết thực nghiệm cho thấy, thao tác cốc thủy tinh, lượng ADN thu nhiều nhanh so với ống nghiệm Do cốc thủy tinh tích diện tích bề mặt lớn, tạo thuận lợi cho việc kết tủa lên bề mặt phân tử ADN, lượng ADN thu nhiều so với ống nghiệm 69 Lê Minh Đức, Phan Đức Duy, Lữ Thị Thanh Nga Tập 129, Số 6A, 2020 – Hóa chất thí nghiệm Tình 2: Quy trình SGK đề xuất sử dụng nước chiết dứa chứa enzyme bromelain giúp biến tính tách protein histon khỏi phân tử ADN, tạo điều kiện cho việc thu nhận ADN tinh Trong thực tế nay, số giáo viên khơng có điều kiện chuẩn bị nước chiết dứa cho nhiều tiết dạy liên tục lớp khác Biện pháp xử lý: Giáo viên bỏ qua cơng đoạn dùng nước chiết dứa không chuẩn bị Kết thực nghiệm cho thấy, phân tử ADN lẫn nhiều protein, chúng cho phản ứng màu xanh lam với thuốc thử diphenylamine nhiệt độ cao Đây phản ứng đặc trưng để nhận diện có mặt phân tử ADN Hơn nữa, thực hành phổ thông, nhằm nhận biết phát nhanh ADN có tế bào mà khơng thiết phải có ADN đủ sạch, việc giảm bớt số cơng đoạn quy trình nhằm giảm bớt thời gian kinh phí thực điều cần thiết Nước rửa chén có chứa chất tẩy sodium dodecyl sulfate phá hủy lớp lipit kép màng tế bào, màng nhân đồng thời phân hủy protein gắn kết với ADN [5] 3.3.2 Tình khâu lựa chọn mẫu Tình 3: Theo SGK Sinh học 10, gan gà, gan heo đậu Hà Lan đề xuất làm mẫu vật để tách chiết ADN Những mẫu vật khó bảo quản, thao tác nghiền mẫu tốn nhiều thời gian Biện pháp xử lý: Thay mẫu mẫu hành tây, chuối chín tế bào niêm mạc miệng Hành tây chuối hai loại mẫu vật dễ tìm kiếm, bảo quản lâu, giá thành thấp, thao tác nghiền mẫu đơn giản Tế bào niêm mạc miệng lấy từ em học sinh tạo cho em tự tin, thích thú nhìn thấy ADN sau q trình thí nghiệm 3.3.3 Tình thao tác xử lý mẫu vật Tình 4: Nếu mẫu vật chuối chín hành tây quy trình phổ biến thường hướng dẫn lọc lấy dịch chiết tế bào sau nghiền mẫu với nước Công đoạn giúp thu lượng ADN tinh nhiều tốn nhiều thời gian dụng cụ làm thí nghiệm Biện pháp xử lý: Có thể bỏ qua cơng đoạn lọc mẫu vải lọc để tiết kiệm thời gian dụng cụ thí nghiệm mà thu lượng ADN cần thiết thí nghiệm Trong q trình nghiền mẫu, cần bổ sung khoảng g NaCl tinh thể (trong 100 g mẫu) tạo thuận lợi cho việc tách kết tủa phân tử ADN Để tiết kiệm thời gian dụng cụ, mẫu chuối chín nên sử dụng túi nilon vuốt mép để nghiền mẫu nhanh Đối với hành tây, sử dụng cối chày để nghiền khơng có máy xay Thực nghiệm cho thấy thời gian nghiền mẫu chày cối sứ hành tây chuối chín phút cho kết tối ưu 70 Tập 129, Số 6A, 2020 Jos.hueuni.edu.vn Thời gian nghiền mẫu ảnh hưởng đến lượng ADN thu Thời gian nghiền mẫu hợp lý (khoảng phút), bảo vệ ADN khỏi tác nhân học (nghiền, lắc mạnh) tác nhân hóa học (enzyme nuclease nội bào) Trong nhiều trường hợp, giáo viên học sinh nghiền mẫu q nhanh, mẫu mơ chưa nghiền hồn toàn lâu khiến ADN bị phân giải enzyme nội bào Tình 5: Đối với tế bào niêm mạc miệng, quy trình thường sử dụng que lấy phết mẫu niêm mạc miệng chun dụng có giá thành cao, số trường khơng trang bị Biện pháp xử lý: Sử dụng 20 ml nước muối sinh lý 0,9% để súc miệng phút, nhả vào cốc thủy tinh 250 ml; mẫu thu chứa nhiều tế bào niêm mạc miệng Trước lấy mẫu, học sinh cần súc miệng nước để tránh nhiễm tạp chất mẫu Các bước thực giống quy trình tách ADN từ chuối hành tây Lớp niêm mạc miệng người có đặc điểm dễ bong tróc điều kiện bình thường nhai, nuốt thức ăn Súc miệng nước muối giúp thu lượng tế bào cần thiết cho thí nghiệm Do ADN phân tử phân cực có gốc phosphate mang điện tích âm, có khả liên với cation (Na+) dung dịch muối, trung hịa điện tích phân tử ADN, làm cho phân tử ADN kết dính với thay đẩy nhau, gặp cồn chúng dễ dàng bị kết tủa đẩy lên tác dụng lực vật lý [4] 3.3.4 Tình khâu tách ADN khỏi tế bào Tình 6: Ở bước sử dụng nước rửa chén để phá màng tế bào, màng nhân, học sinh thường sử dụng nhiều nước rửa chén tạo nhiều bọt, ảnh hưởng đến việc kết tủa ADN bước sau; ngược lại cho lượng nước rửa chén khơng thu đủ lượng ADN cần thiết a b Hình Lượng ADN thu chuối: a) Không bổ sung NaCl; b) bổ sung dung dịch NaCl 2% 71 a b Lê Minh Đức, Phan Đức Duy, Lữ Thị Thanh Nga Tập 129, Số 6A, 2020 Biện pháp xử lý: Nghiên cứu cho thấy, cần dùng lượng nước rửa chén vừa đủ với tỉ lệ 1/4 (5 ml nước rửa chén cho 20 ml dịch chiết tế bào), khuấy nhẹ tránh việc tạo bọt, để yên 1–2 phút nhằm ly giải màng tế bào màng nhân, giải phóng ADN Nước rửa chén thông dụng chứa sodium dodecyl sulfate, chất tẩy hoạt động bề mặt lưỡng tính, mang điện tích nên chất tẩy ion hóa phá vỡ liên kết ion liên kết hydro, có tác dụng biến tính hồn tồn protein chất liên kết với tất nhóm R protein, phá hủy màng lipit kép tế bào nhân cách xen vào hai lớp phospholipit kép Tạo điều kiện cho việc kết tủa cô lập ADN bước [4, 5, 6] 3.3.5 Tình cơng đoạn kết tủa ADN cồn Tình 7: Các quy trình phổ biến thường sử dụng cồn ethanol 70–90% dùng cồn ethanol 70% lạnh giúp ADN kết tủa nhanh hiệu Nếu không chuẩn bị cồn ethanol lạnh 70–90% phải làm nào? Biện pháp xử lý: Trong điều kiện phịng thí nghiệm khơng có cồn ethanol việc sử dụng cồn methanol 70–96% nhiệt độ phịng khơng ảnh hưởng nhiều đến kết thí nghiệm Sau cơng đoạn phá màng tế bào nước rửa chén, rót từ từ cồn methanol 70–96% với thể tích gấp đơi thể tích mẫu dịch nghiền, sau khoảng phút thấy xuất phân tử kết tủa màu trắng đục ADN tan nước không tan cồn, tác động lực vật lý lên bề mặt 3.3.6 Tình việc nhận dạng ADN Tình 8: Quy trình tách chiết ADN SGK khơng có cơng đoạn nhận biết kết tủa màu trắng thu có phải ADN hay không Vậy để khẳng định chúng ADN vật chất khác tế bào? Điều khiến cho việc phân tích chứng minh kết thí nghiệm gặp nhiều khó khăn giáo viên học sinh Biện pháp xử lý: Sử dụng phản ứng màu đặc trưng ADN với diphenylamine để nhận biết ADN Thuốc thử diphenylamine 0,5% pha dung dịch axit sulfuric đậm đặc Dùng kim mũi mác que tre nhẹ nhàng vớt phần kết tủa màu trắng cho vào ống nghiệm chứa 10 ml diphenylamine, đun cách thủy 10 phút thấy xuất màu xanh lam, chứng minh mẫu kết tủa thu ADN ADN phản ứng với diphenylamine dựa vào chuyển đổi đường deoxyribose có phân tử ADN (khơng có ARN) Khi bị thủy phân nhiệt độ cao môi trường acid, deoxyribose chuyển thành hydroxylevulinyl aldehyde, phản ứng với diphenylamine tạo phức hợp màu xanh lam bền vững Mức độ màu xanh lam tỉ lệ thuận với hàm lượng ADN [5] 72 Tập 129, Số 6A, 2020 Jos.hueuni.edu.vn a b c Hình Phản ứng màu đặc trưng nhận diện ADN: a) ADN kết tủa cồn; b) ADN làm ống nghiệm; c) Phản ứng màu xanh lam đặc trưng ADN với diphenylamine 3.4 Quy trình tách chiết ADN cải tiến Thông qua kết thực nghiệm, đề xuất quy trình tách chiết ADN cải tiến (Hình 3) với bước đơn giản, mẫu vật dễ tìm, dễ thực tiết kiệm thời gian Nội dung cải tiến so với quy trình SGK sau: Đề xuất sử dụng mẫu vật dễ chuẩn bị, chi phí thấp chuối, hành tây, tế bào niêm mạc miệng; công đoạn phân giải protein dịch chiết dứa bỏ qua giáo viên không chuẩn bị được; sử dụng cốc thủy tinh thay ống nghiệm giúp thao tác nhanh, dễ thực hiện, thu nhiều ADN; đề xuất nghiền mẫu với tinh thể NaCl nhằm tăng hiệu thí nghiệm; bổ sung cơng đoạn chứng minh phần kết tủa ADN phản ứng màu đặc trưng với diphenylamine; thời gian thực thực hành thí nghiệm theo quy trình cải tiến 15 phút, giảm nửa thời gian so với quy trình SGK [2, 4, 5] 73 Lê Minh Đức, Phan Đức Duy, Lữ Thị Thanh Nga Tập 129, Số 6A, 2020 Bước 1: Lựa chọn mẫu (Chuối chín, hành tây, tế bào niêm mạc miệng…) Bước 2: Nghiền mẫu với NaCl Bước 3: Tách ADN khỏi tế bào nhân tế bào Bước 4: Phân giải protein enzyme bromelain từ dứa Bước 5: Kết tủa ADN dịch tế bào cồn Bước 6: Tách ADN khỏi lớp cồn Bước 7: Nhận dạng ADN phản ứng màu đặc trưng với diphenylamine Hình Quy trình tách chiết ADN cải tiến Kết luận Trên sở thực thí nghiệm tách chiết ADN, chúng tơi phát tình diễn đề xuất biện pháp xử lý nhằm nâng cao hiệu thí nghiệm Các tình nghiên cứu nguồn tài liệu bổ ích giúp giáo viên giảng dạy; đồng thời cung cấp tình thực tiễn cho giảng viên trường sư phạm việc rèn luyện kỹ dạy học thực hành thí nghiệm cho sinh viên sư phạm, nâng cao chất lượng đào tạo giáo viên sinh học Thơng qua biện pháp xử lý tình huống, chúng tơi xây dựng quy trình tách chiết ADN cải tiến nhằm thực thí nghiệm đơn giản, tiết kiệm thời gian chi phí, góp phần tạo động lực cho việc triển khai hiệu hoạt động thực hành thí nghiệm trường phổ thơng 74 Tập 129, Số 6A, 2020 Jos.hueuni.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Giáo Dục Đào Tạo (2018), Chương trình giáo dục phổ thơng mơn Sinh học, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Phạm Văn Lập, Trần Dụ Chi, Trịnh Nguyên Giao, Phạm Văn Ty (2012), Sinh học 10, Nxb Giáo dục Việt Nam, Hà Nội Lê Minh Đức, Phan Đức Duy (2018), Xử lý tình thực tiêu hiển vi tạm thời quan sát đột biến số lượng nhiễm sắc thể thực vật, Tạp chí giáo dục, 424, 51–54 Mai Sĩ Tuấn cộng (2013), Thực hành sinh học trường phổ thông, Nxb Giáo dục Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Xuân Viết (2016), Giáo trình Thực hành sinh học tế bào, Nxb Đại học Sư phạm, Hà Nội Harvey Lodish, Arnold Berk, Chris A Kaiser, Monty Krieger, et al (2019), Molecular cell biology – Sinh học phân tử tế bào – tập 3, Nxb Trẻ, Hà Nội PROBLEM-SOLVING IN DNA EXTRACTION EXPERIMENT IN HIGH-SCHOOL BIOLOGY SYLLABUS Le Minh Duc1, Phan Duc Duy2, Lu Thi Thanh Nga3 Sai Gon University, 273 An Duong Vuong, Ho Chi Minh city, Vietnam University of Education, Hue University Tan Binh High School, 19 Hoa Bang Str., Ho Chi Minh city, Vietnam Abstract: In extracting DNA from animal or plant cells in the practice section "Determining the chemical composition of cells" in the grade 10 biology syllabus, there have been many situations that make it difficult for teachers and students This study points out common situations and suggests solutions that make the process simple, reducing operational time and increasing the reliability of the experimental results It is thereby helping teachers and students be active in performing and teaching the experiment The study also proposes an improved process of DNA extraction and identification for teachers and students to perform easily under the current laboratory conditions in high schools Keywords: DNA extraction, grade 10 biology experiments, problem-solving, improved experiment 75 ... cung cấp cho giáo viên tình xuất trình tách chiết ADN tế bào động vật, thực vật đề xuất biện pháp xử lý cách khoa học, hiệu Trên sở đề xuất quy trình tách chiết ADN cải tiến để giáo viên học sinh. .. quy trình tách chiết ADN cải tiến phù hợp với điều kiện nhà trường phổ thông 3.3 Hệ thống tình biện pháp xử lý thực hành thí nghiệm tách chiết ADN Quy trình sử dụng enzyme dứa tươi để tách chiết. .. ADN thu nhiều chứng minh phân tử tách chiết ADN thông qua phản ứng màu đặc trưng [3] Kết thảo luận 3.1 Mục tiêu thí nghiệm tách chiết ADN – Học sinh tách chiết ADN khỏi tế bào hóa chất dụng cụ