(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp streptococcus suis từ dịch não tủy của người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HỒN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HỒN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƢỜI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHAN LÊ THANH HƢƠNG Hà Nội - 2013 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ S.suis 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Một số yếu tố độc lực chình vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán 1.1.3 Cơ chế gây bệnh S.suis 1.2 SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƢỜI CỦA S.suis 15 1.3 BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG 19 1.3.1 Đƣờng lây truyền 19 1.3.2 Triệu chứng 19 1.3.3 Biện pháp phòng bệnh 20 1.3.4 Biện pháp chống dịch 21 1.3.5 Nguyên tắc điều trị 21 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐỐN PHỊNG THÍ NGHIỆM 22 1.4.1 Ni cấy phân lập 22 1.4.2 Nhuộm Gram 22 1.4.3 Phản ứng catalase 22 1.4.4 Xét nghiệm định danh, định typ: 23 1.4.5 Phát vi khuẩn S suis phản ứng Realtime PCR 23 1.5 PHƢƠNG PHÁP PCR 24 1.5.1 Giới thiệu phƣơng pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction – PCR) 24 1.5.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR 24 1.5.3 Giới thiệu phản ứng PCR đa mồi 28 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 34 2.1.1 Chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 34 2.1.2 Dịch não tủy 34 2.1.3 Dịch não tủy bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tình S suis (để đánh giá hiệu quy trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng đề tài): 35 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 2.1.4 Sinh phẩm nghiên cứu 35 2.1.5 Trang thiết bị, dụng cụ 38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 38 2.2.1 Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô 38 2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S suis số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực vi khuẩn 44 2.2.3 Nghiên cứu tối ƣu chu trính nhiệt 45 2.2.4 Nghiên cứu tối ƣu thành phần tham gia phản ứng 47 2.2.5 Nghiên cứu mức độ phát vi khuẩn S suis số yếu tố độc lực vi khuẩn quy trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng nghiên cứu Tình ổn định PCR đa mồi 47 2.2.6 Đánh giá tình đặc hiệu cặp mồi (khả bắt cặp chéo) với vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S suis 48 2.2.7 Xây dựng quy trính xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA S suis 48 2.3 ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƢƠNG PHÁP 50 2.3.1 Tiêu chuẩn xác định chẩn đốn dƣơng tình âm tình 50 2.3.2 Các số tình tốn độ tin cậy giá trị phƣơng pháp [3, 4] 50 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN 53 3.1.1 Tạo bệnh phẩm mô 53 3.1.2 Lựa chọn cặp mồi tổ hợp mồi phù hợp: 54 3.1.3 Xác định điều kiện tối ƣu phản ứng PCR đa mồi phát S suis số yếu tố độc lực phổ biến 56 3.1.4 Tối ƣu hóa thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi phát vi khuẩn S suis số yếu tố độc lực phổ biến 58 3.1.5 Độ nhạy tình ổn định quy trính PCR đƣợc xây dựng (khả lặp lại kết quả) 62 3.1.6 Đánh giá khả bắt cặp chéo cặp mồi (tình đặc hiệu) với vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S suis 64 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI) 65 3.3 ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƢƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 69 3.3.1 Kết nuôi cấy phân lập/xác định đƣợc vi khuẩn từ bệnh phẩm: 69 3.3.2 Các chi số đánh giá độ chình xác giá trị hữu ìch phƣơng pháp 70 KẾT LUẬN 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học DANH MỤC HÌNH Hính 1.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kình hiển vi điện tử Hính 1.2: Khuẩn lạc S suis môi trƣờng thạch máu cừu thạch máu ngựa Hính 1.3 Bệnh nhân bị nhiễm S suis 20 Hính 1.4 Sơ đồ phản ứng PCR 25 Hính 3.1 Thử nghiệm tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp đến tổ hợp 8) 54 Hính 3.2.Thử nghiệm tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp đến tổ hợp 16) 55 Hính 3.3 PCR đa mồi với điều kiện phản ứng tối ƣu phát trực tiếp S suis bệnh phẩm Error! Bookmark not defined Hính 3.4 Thử nghiệm hàm lƣợng mồi với nồng độ mồi 20pmol/µl 59 Hính 3.5 Thử nghiệm hàm lƣợng mồi với nồng độ mồi khác 60 Hính 3.6 Thử nghiệm Quy trính PCR xây dựng mẫu bệnh phẩm 61 Hính 3.7 Mức độ phát vi khuẩn S suis yếu tố độc lực vi khuẩn PCR đa mồi hoàn thiện (kết với bệnh phẩm mơ phỏng) 62 Hính 3.8 Kiểm tra tình đặc hiệu tổ hợp mồi & quy trính PCR đa mồi 64 Hính 3.9 Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy nhiệt độ 850C 900C 60 phút 66 Hính 3.10 Hiệu xử lý dịch não tủy nhiệt độ 800C với thời gian ủ khác 67 Hính 3.11 Hiệu xử lý dịch não tủy bệnh nhân 800C/60‟(đánh giá PCR đơn mồi) Error! Bookmark not defined Hính 3.12 Hiệu xử lý dịch não tủy Kit nhiệt độ 800C/60‟ 67 Hính 3.13 Ứng dụng quy trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng mẫu bệnh phẩm 69 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hệ gen số chủng Sreptococcus suis Bảng 2.1 Một số trính tự mồi chủ yếu (primer) đƣợc sử dụng nghiên cứu [11,25,39,41] 37 Bảng 2.2 Các tổ hợp mồi đƣợc sử dụng thử nghiệm 44 Bảng Các chu trính PCR đa mồi đƣợc thử nghiệm 46 Bảng 2.3 Bảng số liệu để tình tốn số 51 Bảng 2.4 Mức độ LR+, LR - liên quan đến khả mắc bệnh không mắc bệnh 51 Bảng 3.1 Kết khẳng định lại đặc tình vi khuẩn dùng làm mẫu 53 Bảng 3.2 Các tổ hợp mồi thìch hợp đƣợc lựa chọn nghiệm 55 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng chu trính PCR đến khả phát S.suis 56 Bảng 3.4 Khả phát vi khuẩn yếu tố độc lực thay đổi điều kiện quy trính PCR đa mồi 57 Bảng 3.5 Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi đƣợc khảo sát 58 Bảng 3.6 Tình ổn định Quy trính PCR thực mẫu bệnh phẩm63 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng phƣơng pháp xử lý bệnh phẩm dùng/không dùng kit 65 Bảng 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu phƣơng pháp PCR đa mồi so với phƣơng pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144 70 Bảng 3.9 So sánh kết ba phƣơng pháp: PCR đơn mồi, đa mồi NCPL71 Bảng 3.10 Các số đánh giá độ chình xác hữu ìch phƣơng pháp PCR đa mồi nuôi cấy phân lập (n=153) 71 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair C (-) Chứng âm C (+) Chứng dƣơng Cps Capsular polysaccharide DNA Deoxyribonucleic acid DNT Dịch não tủy Ef Extracellular factor Mrp Muramidase-released protein NCPL Nuôi cấy phân lập PCR Polymerase chain reaction Pƣ Phản ứng Sly Suilysin S.suis Streptococcus suis VMN Viêm màng não VK Vi khuẩn Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm 1960s giới vài năm gần khu vực châu Á có Trung Quốc Việt Nam, ln có cảnh báo tầm nghiêm trọng vi khuẩn Streptococcus suis (S suis) nhƣ tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời có tiềm gây vụ bùng phát dịch Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tình ngƣời S suis đƣợc coi bệnh nhiễm trùng nổi, có khả gây tỷ lệ tử vong di chứng cao Rất nhiều trƣờng hợp mắc bệnh có biểu lâm sàng nặng nhƣ: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng nhiễm độc liên cầu Số liệu lâm sàng sơ số viện bệnh viện lớn nhƣ Viện Các Bệnh truyền nhiễm Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Trung ƣơng Huế cho thấy S suis nguyên nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết viêm màng não mủ ngƣời lớn Việt Nam Ở nƣớc có kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S suis kỹ thuật nuôi cấy phân lập kinh điển phát kháng nguyên đặc hiệu kỹ thuật miễn dịch học, chì kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến Ở Việt Nam, ví không đồng sở vật chất, trang thiết bị nhƣ không ổn định kỹ thực hành chẩn đốn phịng ngiệm, phƣơng pháp sinh học phân tử đại nhằm chẩn đoán S suis khó áp dụng rộng rãi Tuy nhiên phƣơng pháp đại, nhanh chình xác, phƣơng pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) phƣơng pháp có tình khả thi mặt kinh tế kỹ thực so với phƣơng pháp PCR định lƣợng (Real time PCR) Với phƣơng pháp PCR đa mồi, đồng thời phát đƣợc có mặt vi khuẩn S suis, xác định đƣợc typ huyết (typ 2) vài gen độc lực vi khuẩn Phƣơng pháp giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, cơng sức có độ đặc hiệu cao Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Chình ví vậy, thực đề tài “Nghiên cứu phát triển hồn thiện quy trình PCR đa mồi để phát trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy ngƣời” với mục tiêu chình sau đây: - Xây dựng quy trính PCR đa mồi phát trực tiếp S suis bệnh phẩm ngƣời; - Xây dựng quy trính xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực để bộc lộ DNA S suis Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Kết hính 3.11 cho thấy tất nồng độ vi khuẩn phƣơng pháp xử lý kìt phƣơng pháp xử lý nhiệt thấy vạch DNA tƣơng ứng với sản phẩm cặp mồi CPS 2J, Sly 16S rDNA Nhƣ độ nhạy nhƣ hiệu phƣơng pháp xử lý nhiệt hoàn toàn tƣơng đƣơng với phƣơng pháp xử lý kit chuẩn Nhƣ vậy, nhiệt độ 800C 60 phút điều kiện đơn giản để xử lý bệnh phẩm dịch não tủy có chứa vi khuẩn S suis nhằm mục đìch tách chiết đƣợc DNA sử dụng phản ứng PCR Hiện nay, thị trƣờng kit dùng để tách chiết DNA có giá thành cao Ví vậy, thành công nghiên cứu phƣơng pháp xử lý mẫu bệnh phẩm đơn giản nhiệt độ góp phần đáng kể việc làm giảm giá thành mẫu xét nghiệm, làm giảm gánh nặng kinh tế cho ngƣời bệnh đặc biệt tính trạng kinh tế khó khăn nhƣ Hình 3.12 Hiệu xử lý dịch não tủy bệnh nhân 800C/60’(đánh giá PCR đơn mồi) M: thang chuẩn DNA; (+): chứng dƣơng; (-): chứng âm; Sp1-Sp5: mẫu bệnh phẩm lâm sàng (DNT) đƣợc xử lý 800C/60‟ Đặng Thị Kiều Oanh 68 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Ở mẫu bệnh phẩm, vạch DNA vị trì kìch thƣớc 498 bp cặp mồi đặc hiệu cho typ vi khuẩn S.suis xuất rõ nét Nhƣ phƣơng pháp xử lý mẫu bệnh phẩm 800C 60 phút thìch hợp để xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy để bộc lộ DNA vi khuẩn S.suis M (+) 19 10 11 12 13 14 15 20 21 22 23 24 25 26 27 M 28 29 30 31 32 33 34 16 17 18 35 10 (-) Hình 3.13 Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng mẫu bệnh phẩm M: thang chuẩn DNA; 1, 2, 3… 35: 35 mẫu bệnh phẩm (+): chứng dƣơng; (-): chứng âm 101: mẫu bệnh phẩm mô với nồng độ 10 vk/pƣ Hính 3.13 cho thấy kết chạy PCR đa mồi 35 mẫu bệnh phẩm, có mẫu bệnh phẩm 16, 17, 24, 25, 26, 31,32 không thấy xuất sản phẩm PCR đa mồi Trong số mẫu lại chủ yếu vạch sản phẩm, có mẫu 8, 23, 27 29 có vạch sản phẩm Để khẳng định lại kết phân tìch, mẫu kiểm tra lại phƣơng pháp PCR đơn mồi 3.3 ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƢƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 3.3.1 Kết nuôi cấy phân lập/xác định đƣợc vi khuẩn từ bệnh phẩm: Số bệnh phẩm bệnh nhân đƣợc chẩn đoán VMN mủ nghi S suis: 53 Số bệnh phẩm nuôi cấy phân lập xác định S suis : 44 mẫu (44/53 trƣờng hợp nhiễm S suis) Đặng Thị Kiều Oanh 69 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Số bệnh phẩm xác định S suis PCR đa mồi: 53 mẫu (53/53 trƣờng hợp nhiễm S suis ) 3.3.2 Các chi số đánh giá độ xác giá trị hữu ích phƣơng pháp Trong trường hợp tiêu chuẩn để xác định viêm màng não S suis phải dương tính phương pháp nuôi cấy phân lập (được coi chuẩn vàng) Số mẫu phân tích bao gồm: tổng số mẫu bệnh phẩm chẩn đoán lâm sàng VMN mủ nghi vi khuẩn S suis 44 mẫu số mẫu âm tính thực (100 mẫu): n = 44 +100 = 144 Bảng 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu phƣơng pháp PCR đa mồi so với phƣơng pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144 Kết chẩn đoán S suis ni cấy phân lập Dƣơng tình Âm tình Phƣơng pháp Dƣơng tình đa mồi PCR (phƣơng pháp thử Âm tình nghiệm) Tổng Chỉ số đánh giá độ xác Tổng 44 144 100 100 44 100 144 Phƣơng pháp nuôi cấy Độ nhạy Độ đặc hiệu 100% 100% Phƣơng pháp PCR đa mồi 100% 100% Kết Bảng 3.8 cho thấy, phƣơng pháp PCR đa mồi phát liên cầu khuẩn lợn so với nuôi cấy phân lập có độ nhạy đạt 100% độ đặc hiệu đạt 100% Trong trường hợp tiêu chuẩn để xác định viêm màng não S suis dương tính với hai phương pháp ni cấy phân lập PCR đa mồi Số mẫu phân tích bao gồm: tổng số mẫu bệnh phẩm chẩn đoán lâm sàng VMN mủ nghi vi khuẩn S suis 53 mẫu số mẫu âm tính thực (100 mẫu): Đặng Thị Kiều Oanh 70 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học n = 53 +100 = 153 Bảng 3.9 So sánh kết ba phƣơng pháp: PCR đơn mồi, đa mồi NCPL Kỹ thuật chẩn đoán Kết phát vi khuẩn S suis tổng số mẫu bệnh phẩm nghi ngờ (n = 53) Dƣơng tính (+) Âm tính (-) (%) (%) Nuôi cấy phân lập PCR đa mồi PCR đa mồi Bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng VMN nghi S suis 44 (83,02%) (16,98%) 53 53 (100%) 53 (100%) (0%) (0%) 53 53 Bảng 3.9 cho thấy kết phát PCR đơn mồi tƣơng tự PCR đa mồi (có cặp mồi khác nhau) nhiều phƣơng pháp NCPL 16,98%, nói cách khác tỷ lệ âm tình giả NCPL 16,98% Bảng 3.10 Các số đánh giá độ xác hữu ích phƣơng pháp PCR đa mồi nuôi cấy phân lập (n=153) Kết chẩn đốn S suis Tổng Dƣơng tình Âm tình Dƣơng tình 53 53 Phƣơng pháp đa mồi PCR Âm tình 100 100 53 100 153 Tổng Phƣơng pháp ni Dƣơng tình 44 44 cấy phân lập Âm tình 100 109 53 100 153 Tổng So sánh giá trị hai phƣơng pháp với tổng số mẫu = 153 Phƣơng pháp nuôi cấy Phƣơng pháp PCR đa mồi Chỉ số đánh giá độ xác: Độ nhạy 83,02% 100% Độ đặc hiệu 100% 100% Tỷ lệ dƣơng tình giả 0 Tỷ lệ âm tình giả 16,98% Chỉ số đánh giá hữu ích: + LR - LR Giá trị dự đốn dƣơng tình (PPV) Giá trị dự đốn âm tình (NPV) Đặng Thị Kiều Oanh 0,17 1.00 0.917 1.00 1.00 71 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Kết Bảng 3.10 cho thấy, phƣơng pháp PCR đa mồi phát liên cầu khuẩn lợn có độ nhạy cao với 100%; phƣơng pháp ni cấy có độ nhạy 83,02% Tỷ lệ âm tình giả phƣơng pháp PCR đa mồi 0%, tỷ lệ âm tình giả phƣơng pháp nuôi cấy gần 17% (16,98%) Cả hai phƣơng pháp có độ đặc hiệu 100% tỷ lệ dƣơng tình giả 0% Nếu xét nghiệm PCR đa mồi dƣơng tình với vi khuẩn S suis, xác xuất mắc bệnh 100%, ni cấy âm tình với S suis, xác xuất không mắc bệnh S suis 91,7% Nói cách khác, giá trị dự đốn dƣơng tình PCR đa mồi ni cấy 100% giá trị dự đốn âm tình PCR đa mồi 100% nuôi cấy 91,7% Với điều kiện Việt Nam nay, có nhiều lý giá trị âm tình ni cấy có nhiều khả âm tình giả (do dùng kháng sinh trƣớc vào bệnh viện, vi khuẩn bị kháng sinh ức chế không phát triển đƣợc môi trƣờng nuôi cấy, kỹ nuôi cấy không chuẩn, môi trƣờng nuôi cấy không đảm bảo chất lƣợng…), nhƣng bệnh phẩm chứa DNA vi khuẩn nên có kết dƣơng tình sử dụng phƣơng pháp PCR, vói lý nhƣ nên mẫu âm tình ni cấy nhƣng dƣơng tình PCR khơng thể coi mẫu âm tình thực (để tình theo cơng thức) đƣợc Cũng nhƣ vậy, khơng chình xác coi mẫu bệnh phẩm phát đƣợc vi khuẩn nuôi cấy phân lập tỷ lệ dƣơng tình thực Chúng tơi tình tốn độ nhạy, độ đặc hiệu giá trị hữu ìch khác áp dụng PCR đa mồi 153 mẫu bệnh phẩm (bao gồm 53 mẫu bệnh nhân có biểu viêm màng não mủ nghi vi khuẩn S suis 100 mẫu DNT bệnh nhân viêm não vi rut (dựa lâm sàng xét nghiệm sinh hóa - tế bào DNT) dựa nguyên tắc nhƣ sau: - Đánh giá hiệu phát PCR đa mồi với qui định dương tính kết phát vi khuẩn dương tính phương pháp coi chuẩn vàng (nuôi cấy phân lập), khơng tính trường hợp dương tính PCR đa mồi (là phương pháp đánh giá) (n=144) Độ nhạy phƣơng pháp xét nghiệm so sánh với phƣơng pháp đƣợc coi „chuẩn vàng‟ tỷ lệ dƣơng tình thực mẫu bệnh phẩm mà xét Đặng Thị Kiều Oanh 72 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học nghiệm cần đƣợc so sánh phát đƣợc Với cỡ mẫu 144, phƣơng pháp PCR đa mồi phát liên cầu khuẩn lợn so với nuôi cấy phân lập có độ nhạy đạt 100% độ đặc hiệu đạt 100% Chỉ số LR+ cho thấy tỷ lệ dƣơng tình thực hai phƣơng pháp nhƣ phát đƣợc vi khuẩn hay yếu tố di truyền vi khuẩn thí chắn dƣơng tình, số LR- cho thấy tỷ lệ âm tình giả PCR đa mồi áp dụng với S suis 0% - So sánh hiệu phát vi khuẩn phương pháp PCR đa mồi với PCR đơn mồi nuôi cấy phân lập.Trong trường hợp tiêu chuẩn để xác định viêm màng não S suis dương tính với hai phương pháp: nuôi cấy phân lập PCR (n=153) Ở phần phân tìch này, sở để thiết lập bảng tình tốn là: mẫu đƣợc coi dƣơng tình có ìt hai phƣơng pháp dƣơng tình mẫu âm tình hai phƣơng pháp âm tình Trong 53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng VMN nghi S suis có 44 mẫu ni cấy dƣơng tình, 09 mẫu ni cấy âm tình Nếu phát PCR đa mồi có 100% số mẫu dƣơng tình (53/53) Nếu tình theo quy định “viêm màng não xác định S suis dương tính với hai phương pháp: ni cấy phân lập PCR” thí độ nhạy phƣơng pháp nuôi cấy 83,02% độ nhạy PCR đa mồi 100% (Bảng 3.10), tình xác thực PCR đa mồi đƣợc kiểm chứng với PCR đơn mồi (quy trính chuẩn phịng nghiệm Liên cầu, Viện Quốc gia Bệnh nhiễm trùng, Tokyo, Nhật Bản) Trong trƣờng hợp này, độ đặc hiệu phƣơng pháp PCR đa mồi so sánh với nuôi cấy phân lập 100% hay tỷ lệ âm tình giả phƣơng pháp PCR đa mồi 0%, tỷ lệ âm tình giả phƣơng pháp ni cấy xấp xỉ 17% (Bảng 3.10) Ngồi ra, sử dụng mồi tham khảo từ tài liệu khoa học công bố cho kỹ thuật PCR đa mồi thử nghiệm nên tổ hợp mồi lựa chọn đƣợc khảo sát tình đặc hiệu Đặng Thị Kiều Oanh 73 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học KẾT LUẬN Xây dựng quy trính PCR đa mồi phát trực tiếp vi khuẩn S suis (liên cầu khuẩn lợn) số yếu tố độc lực vi khuẩn bệnh phẩm ngƣời đạt yêu cầu giới hạn phát hiện/độ nhạy tình đặc hiệu/độ đặc hiệu tình lặp lại kết nhƣ sau: - Với bệnh phẩm mô (đảm bảo giống bệnh phẩm thật bao gồm vi khuẩn đƣợc chuẩn độ dịch não tủy ngƣời từ bệnh nhân bị hội chứng não cấp): + Giới hạn phát đạt vi khuẩn/1 ống phản ứng + Tình đặc hiệu: khơng có tƣợng bắt cặp nhầm với vi khuẩn khác loại - Với bệnh phẩm lâm sàng: + Độ nhạy: đạt 100% + Độ đặc hiệu so với phƣơng pháp phát khác (nuôi cấy phân lập, PCR đơn mồi): đạt 100% - Khả lặp lại kết PCR đa mồi: đạt 100% với bệnh phẩm mô bệnh phẩm lâm sàng Xây dựng đƣợc quy trính xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy đơn giản không dùng sinh phẩm thƣơng mại mà đạt hiệu phát PCR đa mồi: - Xử lý nhiệt độ 800C/60 phút - Đảm bảo chất lƣợng (bộc lộ DNA vi khuẩn, khử chất ức chế…) tƣơng đƣơng nhƣ tách chiết sinh phẩm Đặng Thị Kiều Oanh 74 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học KIẾN NGHỊ Phƣơng pháp PCR đa mồi phƣơng pháp sinh học phân tử chẩn đoán nhanh Streptococcus suis từ dịch não tủy ngƣời Phƣơng pháp PCR đa mồi tiết kiệm thời gian, công sức nhƣ làm giảm giá thành xét nghiệm mẫu bệnh phẩm Ví thế, phƣơng pháp đƣợc triển khai bệnh viện Trung tâm y tế dự phịng tuyến tỉnh thí việc điều trị giám sát bệnh S.suis gây đạt hiệu tốt Đặng Thị Kiều Oanh 75 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tế - Cục Y tế dự phịng mơi trƣờng (2009), Cẩm nang phòng chống bệnh truyền nhiễm, Hà Nội Nguyễn Thị Hồng Lan, Trần Tịnh Hiền (2007), Nhiễm liên cầu lợn Bệnh viện Bệnh nhiệt đới từ tháng 1/2005 đến tháng 12/2006, Kỷ yếu Hội thảo khoa học Thách thức chẩn đoán điều trị Bệnh nhiễm trùng, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, Thành phố Hồ Chì Minh Dƣơng Đính Thiện (2006), Dịch tễ học lâm sàng, Nhà xuất y học Nguyễn Văn Tuấn (2008), Y học thực chứng, Nhà xuất y học Tài liệu Tiếng Anh Astrid de Greeff,Andrea Hamilton,Iain C Sutcliffe,Herma Buys,Loek van Alphen, Hilde E Smith (2003), “Lipoprotein signal peptidase of Streptococcus suis serotype 2”, Microbiology, 149, 1399–1407 Benga L, Goethe R, Rohde M, Valentin-Weigand P (2004), “Non-encapsulated strains reveal novel insights in invasion and survival of Streptococcus suis in epithelial cells”, Cell Microbioly, 6(9),867–881 Berthelot-Herault F, Cariolet R, Labbe A, Gottschalk M, Cardinal JY, Kobisch M (2001), “Experimental infection of specific pathogen free piglets with French strains of Streptococcus suis capsular Type 2” Can J Vet Res, 65(3),196–200 Berthelot-Herault F, Gottschalk M, Morvan H, Kobisch M (2005), “Dilemma of virulence of Streptococcus suis: Canadian isolate 89-1591 characterized as a virulent strain using a standardized experimental model in pigs”, Can J Vet Res., 69(3), 236–240 Chang B, Wada A, Ikebe T, Ohnishi M, Mita K, Endo M, Matsuo H, Asatuma Y, Kuramoto S, Sekiguchi H, Yamazaki M, Yoshikawa H, Watabe N, Yamada H, Kurita S, Imai Y, Watanabe H (2006), “Characteristics of Streptococcus suis Isolated from Patients in Japan”, Jpn J Infect Dis., 59 (6), 397-399 Đặng Thị Kiều Oanh 76 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 10 Constance Schultsz, Ewout Jansen, Wendy Keijzers, Anja Rothkamp, Birgitta Duim, A Wagenaar, Arie van der Ende (2012), “Differences in the Population Structure of Invasive Streptococcus suis Strains Isolated from Pigs and from Humans in the Netherlands”,PLoS ONE, 7(5), 11 Corinne Marois, Laëtitia Le Devendec, Marcelo Gottschalk, and Marylène Kobisch (2006), “Molecular characterization of Streptococcus suis strains by 16S– 23S intergenic spacer polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis”, Can J Vet Res, 70(2): 94–104 12 Dan Takeuchi,Anusak Kerdsin, Anupong Pienpringam, Phacharaphan Loetthong, Sutit Samerchea, Pakkinee Luangsuk, Kasean Khamisara, Nithita Wongwan, Prasanee Areeratana, Piphat Chiranairadul, Suwat Lertchayanti, Sininat Petcharat, Amara Yowang, Phanupong Chaiwongsaen,Tatsuya Nakayama, Yukihiro Akeda, Shigeyuki Hamada, Pathom Sawanpanyalert, Surang Dejsirilert, Kazunori Oishi (2012), “Population-Based Study of Streptococcus suis Infection in Humans in Phayao Province in Northern Thailand”, PLoS One, 7(2): e31265 13 Dang Trung Nghia Ho, Thi Phuong Tu Le, Marcel Wolbers, Quang Thai Cao,Van Minh Hoang Nguyen, Vu Thieu Nga Tran, Thi Phuong Thao Le, Hoan Phu Nguyen, Thi Hong Chau Tran, Xuan Sinh Dinh, Song Diep To, Thi Thanh Hang Hoang, Truong Hoang, James Campbell, Van Vinh Chau Nguyen, Tran Chinh Nguyen, Van Dung Nguyen, Thi Hoa Ngo, Brian G Spratt, Tinh Hien Tran, Jeremy Farrar,Constance Schultsz (2011), “Risk Factors of Streptococcus suis Infection in Vietnam A Case-Control Study”, PLoS One, 6(3), e17604 14 De Greeff A, Buys H, Verhaar R, Dijkstra J, Van Alphen L, Smith HE (2002), “Contribution of fibronectin-binding protein to pathogenesis of Streptococcus suis serotype 2”, Infect Immun,70(3),1319–1325 15 Esgleas M, Dominguez-Punaro Mde L, Li Y, Harel J, Dubreuil JD, Gottschalk M (2009), “Immunization with SsEno fails to protect mice against challenge with Streptococcus suis serotype 2”, FEMS Microbiol Lett., 294(1),82–88 Đặng Thị Kiều Oanh 77 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 16 Esgleas M, Lacouture S, Gottschalk M (2005), “Streptococcus suis serotype binding to extracellular matrix proteins”, FEMS Microbiol Lett., 244(1),33–40 17 Ferrando ML, Fuentes S, De Greeff A, Smith H, Wells JM (2010), “ApuA, a multifunctional α-glucan-degrading enzyme of Streptococcus suis, mediates adhesion to porcine epithelium and mucus”, Microbiology, 156(Pt 9),2818–2828 18 Ge J, Feng Y, Ji H et al (2009), “Inactivation of dipeptidyl peptidase IV attenuates the virulence of Streptococcus suis serotype that causes streptococcal toxic shock syndrome”, Curr Microbiol, 59(3),248–255 19 Gottschalk M., Karriker L, Ramirez A, Schwartz KJ, Stevenson G, Zimmerman J (Eds) (2011), Streptococcosis In: Diseases of Swine, Wiley Publishers, NJ, USA 20 Gottschalk MG, Lacouture S, Dubreuil JD.( (1995), “Characterization of Streptococcus suis capsular type haemolysin”, Microbiology, 141(Pt 1),189–195 21 Gottschalk M, Segura M (2000), “ The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis: the unresolved questions”, Vet Microbiol.,76(3),259–272 22 Gottschalk M, Xu J, Calzas C, Segura M (2010), “Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen”, Fut Microbiol.,5(3),371–391 23 Heiman F L Wertheim, Ho Dang Trung Nghia, Walter Taylor, Constance Schultsz (2009), “Streptococcus suis: An Emerging Human Pathogen”, Clin Infect Dis., 48 (5): 617-625 24 Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol”, BioTechniques, 23(3), 504-511 25 Henk J Wisselink, Jeroen J Joosten, and Hilde E Smith (2002), “Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two VirulenceAssociated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar Specimens from Pigs”, J Clin Microbiol., 40(8): 2922–2929 26 Hilde E Smith, Vincent Veenbergen, Joeke van der Velde, Marloes Damman, Henk J Wisselink,Mari A Smits (1999), “The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays”, J Clin Microbiol.,37 (10), 3146-3152 Đặng Thị Kiều Oanh 78 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 27 Ho Dang Trung Nghia, Ngo Thi Hoa, Le Dieu Linh, James Campbell, To Song Diep, Nguyen Van Vinh Chau, Nguyen Thi Hoang Mai, Tran Tinh Hien, Brian Spratt, Jeremy Farrar, Constance Schultsz (2008), “Human Case of Streptococcus suis Serotype 16 Infection”, Emerg Infect Dis., 14(1), 155–157 28 Hongjie Yu, Huaiqi Jing, Zhihai Chen, Han Zheng, Xiaoping Zhu, Hua Wang, Shiwen Wang, Lunguang Liu, Rongqiang Zu, Longze Luo, Nijuan Xiang, Honglu Liu, Xuecheng Liu, Yuelong Shu, Shui Shan Lee, Shuk Kwan Chuang, Yu Wang, Jianguo Xu, Weizhong Yang, and the Streptococcus suis study groups2 (2006), “Human Streptococcus suis Outbreak, Sichuan, China”, Emerging Infectious Diseases, 12 (6), 914-920 29 Hsih-Yen Tsai, Liao CH, Liu CY, Huang YT, Teng LJ, Hsueh PR (2012), Streptococcus suis infection in Taiwan, 2000-2011, Diagnostic microbiology and infectious disease, 74(1),75-7 30 Kay R, Cheng AF, Tse CY., (1995), “Streptococcus suis infection in Hong Kong.”, QJM., 8(1), 39-47 31 Kerdsin A, Dejsirilert S, Sawanpanyalert P et al.(2011), “ Sepsis and spontaneous bacterial peritonitis in Thailand” Lancet, 378(9794),960 32 Lalonde M, Segura M, Lacouture S, Gottschalk M (2000), “Interactions between Streptococcus suis serotype and different epithelial cell lines”, Microbiology, 146(Pt 8), 1913–1921 33 Lecours MP, Fittipaldi N, Takamatsu D, Okura M, Segura M, Goyette-Desjardins G, Van Calsteren MR, Gottschalk M (2012), “Sialylation of Streptococcus suis serotype is essential for capsule expression but is not responsible for the main capsular epitope”, Microbes Infect., 14(11), 941-950 34 Liu LN, Hu FQ, Zhu JM, Zhao Y, Pan Q, Li M, Tang JQ (2007), “Study on expression of Streptococcus suis serotype sly gene, purification and activity of its product”, Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi.,28(12):1198-202 Đặng Thị Kiều Oanh 79 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 35 Lun ZR, Wang QP, Chen XG, Li AX, Zhu XQ (2007), “Streptococcus suis: an emerging zoonotic pathogen”, Lancet Infect Dis.,7(3):201-9 36 M Gottschalk, R Higgins, M Jacques, K R Mittal, and J Henrichsen (1989), “Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis”, J Clin Microbiol., 27(12): 2633–2636 37 Ma E, Chung PH, So T, Wong L, Choi KM, Cheung DT, Kam KM, Chuang SK, Tsang T, ; Collaborative Study Group on Streptococcus suis infection in Hong Kong (2008), “Streptococcus suis infection in Hong Kong: an emerging infectious disease?”, Epidemiol Infect., 136(12):1691-7 38 Markoulatos P, Mangana-Vougiouka O, Koptopoulos G, Nomikou K, Papadopoulos O (2000), “Detection of sheep poxvirus in skin biopsy samples by a multiplex polymerase chain reaction”, J Virol Methods., 84(2):161-7 39 Marois C, Bougeard S, Gottschalk M, Kobisch M (2004), “Multiplex PCR assay for detection of Streptococcus suis species and serotypes and 1/2 in tonsils of live and dead pigs”, J Clin Microbiol., 42(7):3169-75 40 Mohini Joshi, Dr.Deshpande J.D (2010), “Polymerase chain reaction: Methods, principles and application”, International Journal of Biomedical Research, 1(5), 81-97 41 M S Princivalli1, C Palmieri1, G Magi1, C Vignaroli1, A Manzin2, A Camporese3, S Barocci4, C Magistrali4, B Facinelli (2009), “Genetic diversity of streptococcus suis clinical isolates from pigs and humans in Italy (2003-2007)”, Euro Surveill., 14(33) pii: 19310 42 Nahuel Fittipaldi, Mariela Segura1, Daniel Grenier, Marcelo Gottschalk (2012), “Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis”, Future Microbiology, (2), 259-279 43 Nguyen Thi Hoang Mai, Ngo Thi Hoa,Tran Vu Thieu Nga,Le Dieu Linh,Tran Thi Hong Chau,Dinh Xuan Sinh, Nguyen Hoan Phu,Ly Van Chuong,To Song Diep,James Campbell,Ho Dang Trung Nghia,Tran Ngoc Minh,Nguyen Van Vinh Chau,Menno D de Jong, Nguyen Tran Chinh, Tran Tinh Hien, Jeremy Farrar, Constance Schultsz Đặng Thị Kiều Oanh 80 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học (2008), “Streptococcus suis Meningitis in Adults in Vietnam”, Clin Infect Dis., 46 (5): 659-667 44 Norton PM, Rolph C, Ward PN, Bentley RW, Leigh JA (1999), “Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced by the presence of suilysin”, FEMS Immunol Med Microbiol.,26(1),25–35 45 P Markoulatos, N Siafakas, M Moncany (2002), “Multiplex polymerase chain reaction: A practical approach”, Journal of Clinical Laboratory Analysis, 16(1), 47–51 46.Pan X, Ge J, Li M et al.(2009), “The orphan response regulator CovR: a globally negative modulator of virulence in Streptococcus suis serotype 2”, J Bacteriol., 191(8), 2601–2612 47 Pian Y, Gan S, Wang S, Guo J, Wang P, Zheng Y, Cai X, Jiang Y, Yuan Y (2012), " Fhb, a Novel Factor H-Binding Surface Protein, Contributes to the Antiphagocytic Ability and Virulence of Streptococcus suis”, Infect Immun.,80(7):2402-13 48 R Higgins, M Gottschalk, M Boudreau,A Lebrun, J Henrichsen (1995), “Description of six new capsular types (29-34) of Streptococcus suis”, J Vet Diagn Invest, 7, 405-406 49 Salles MW, Perez-Casal J, Willson P, Middleton DM (2002), “Changes in the leukocyte subpopulations of the palatine tonsillar crypt epithelium of pigs in response to Streptococcus suis Type infection”,Vet Immunol Immunopathol., 87(1–2),51–63 50 Samantha J King, Andrew G Allen, Duncan J Maskell, Christopher G Dowson and Adrian M Whatmore(2004), “Distribution, Genetic Diversity, and Variable Expression of the Gene Encoding Hyaluronate Lyase within the Population Streptococcus suis”, J Bacteriol., 186(14), 4740 51 Seong-Min Choi, Bang-Hoon Cho, Kang-Ho Choi, Tai-Seung Nam, Joon-Tae Kim, Man-Seok Park, Byeong C Kim, Myeong-Kyu Kim, Ki-Hyun Cho (2012), “Meningitis Caused by Streptococcus suis”, J Clin Neurol, 8, 79-82 Đặng Thị Kiều Oanh 81 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 52 Smith HE, Buijs H, De Vries RR, Wisselink HJ, Stockhofe-Zurwieden N, Smits MA (2001) Environmentally regulated genes of Streptococcus suis: identification by the use of iron-restricted conditions in vitro and by experimental infection of piglets”, Microbiology, 147(Pt 2),271–280 53 Staats JJ, Feder I, Okwumabua O, Chengappa MM (1997), “Streptococcus suis: past and present”, Vet Res Commun.,21(6),381-407 54 Tang Y, Zhang X, Wu W, Lu Z, Fang W (2012), “ Inactivation of the sodA gene of Streptococcus suis type encoding superoxide dismutase leads to reduced virulence to mice”, Vet Microbiol.,158(3-4), 360-6 55 Vanier G, Sekizaki T, Dominguez-Punaro MC et al (2008), “Disruption of srtA gene in Streptococcus suis results in decreased interactions with endothelial cells and extracellular matrix proteins”, Vet Microbiol., 127(3–4),417–424 56 Wangkaew S, Chaiwarith R, Tharavichitkul P, Supparatpinyo K (2006), Streptococcus suis infection: a series of 41 cases from Chiang Mai University Hospital, J Infect., 52(6), 455-60 57 Wu T, Chang H, Tan C, Bei W, Chen H, (2009), “The orphan response regulator RevSC21 controls the attachment of Streptococcus suis serotype-2 to human laryngeal epithelial cells and the expression of virulence genes”, FEMS Microbiol Lett., 292(2),170–181 58 Zhang A, Chen B, Mu X et al (2009), “Identification and characterization of a novel protective antigen, Enolase of Streptococcus suis serotype 2”, Vaccine 27(9),1348–1353 59 Zhang A, Mu X, Chen B et al (2010), “Identification and characterization of IgA1 protease from Streptococcus suis”, Vet Microbiol., 140(1–2),171–175 Đặng Thị Kiều Oanh 82 Cao học K18 ... Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HỒN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƢỜI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA... học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Chình ví vậy, chúng tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu phát triển hồn thiện quy trình PCR đa mồi để phát trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy ngƣời” với... JS14 Streptococcus suis SC84 Streptococcus suis SS12 Streptococcus suis ST1 Streptococcus suis ST3 Streptococcus suis 05HAS68 Streptococcus suis 89/1591 Streptococcus suis R61 Streptococcus suis