Nghiên Cứu Vai Trò Của Các Yếu Tố Phiên Mã NAC Đáp Ứng Với Điều Kiện Hạn Ở Cây Họ Đậu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Phan Lam Sơn HÀ NỘI - 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Phan Lam Sơn Các kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí khoa học quốc tế đồng ý tất tác giả báo, chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị khác Tất trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo hợp tác quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) Viện Nghiên cứu RIKEN Nhật (Bản) tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình học tập, thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Đồng (Ngun Giám đốc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp) TS Trần Phan Lam Sơn (Trưởng Nhóm nghiên cứu đường dẫn truyền tín hiệu (nay đổi tên thành Nhóm nghiên cứu đáp ứng với yếu tố bất lợi) thuộc Trung tâm Khoa học nguồn tài nguyên bền vững, Viện RIKEN, Nhật Bản) tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để thực hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới postdoc, kỹ thuật viên nhân viên nhóm nghiên cứu TS Trần Phan Lam Sơn, nơi thực nội dung luận án hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện vể thời gian cho tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Đào tạo Sau đại học, thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện cho suốt q trình học tập hồn thành luận án nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình đặc biệt bố mẹ, anh chị vợ ủng hộ, động viên, khích lệ chỗ dựa tinh thần cho tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án nghiên cứu Ngồi ra, tơi gửi lời cảm ơn tới bạn bè đồng nghiệp ln ủng hộ có ý kiến đóng góp q báu để tơi hồn thành luận án nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu luận án 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Những đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hạn hán ảnh hưởng bất lợi hạn hán trồng 1.1.1 Những thiệt hại ngành trồng trọt hạn hán gây 1.1.2 Hạn hán nguyên nhân gây hạn hán trồng 11 1.1.3 Ảnh hưởng hạn trồng 12 1.1.3.1 Ảnh hưởng hạn tới sinh trưởng phát triển trồng 13 1.1.3.2 Ảnh hưởng hạn tới đặc điểm hình thái giải phẫu 14 1.1.3.3 Ảnh hưởng hạn tới mối quan hệ nước 15 1.1.3.4 Ảnh hưởng hạn tới trình quang hợp 15 1.1.3.5 Ảnh hưởng hạn tới trình hô hấp 17 1.1.3.6 Ảnh hưởng hạn tới hấp thu dinh dưỡng khoáng 18 1.1.3.7 Ảnh hưởng hạn tới cân hormone 18 1.1.3.8 Ảnh hưởng hạn tới hàm lượng protein, axit amin khoáng chất 19 iii 1.1.3.9 Ảnh hưởng hạn tới lipid 22 1.1.3.10 Ảnh hưởng hạn tới q trình oxy hóa 22 1.1.3.11 Ảnh hưởng hạn tới phân tử 23 1.2 Sự đáp ứng trồng với hạn 24 1.3 Vai trị yếu tố phiên mã NAC q trình đáp ứng với stress hạn trồng 27 1.3.1 Tổng quan yếu tố phiên mã NAC 27 1.3.2 Cấu trúc đặc trưng protein NAC 29 1.3.3 Chức yếu tố phiên mã NAC trình đáp ứng với hạn trồng 29 1.4 Vai trò họ đậu 35 1.4.1 Vai trò đậu tương 35 1.4.2 Vai trò đậu gà 37 1.4.3 Ảnh hưởng hạn tới đậu tương đậu gà 39 1.5 Cải thiện khả chống chịu hạn họ đậu sử dụng kỹ thuật chuyển gen 43 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1 Vật liệu nghiên cứu 47 2.1.1 Vật liệu thực vật 47 2.1.2 Các chủng khuẩn, nấm men vector 47 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng cho PCR qRT-PCR 47 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 47 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 47 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 48 2.3 Phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Trồng xử lý đậu tương 48 2.3.2 Tách chiết, tinh RNA tổng hợp cDNA cho tách dòng gen GmNAC085 48 2.3.3 Thiết kế cấu trúc vector phân tích khả hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men 49 iv 2.3.4 Thiết kế cấu trúc vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 50 2.3.5 Phương pháp biến nạp sàng lọc Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 52 2.3.6 Phương pháp phân tích chuyển gen 35S:GmNAC085 kỹ thuật lai southern blot 53 2.3.7 Đánh giá khả sinh trưởng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện thường 53 2.3.8 Phương pháp đo hàm lượng diệp lục 54 2.3.9 Đánh giá khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 54 2.3.9.1 Phương pháp đánh giá hạn khay 55 2.3.9.2 Phương pháp cân trọng lượng cốc 55 2.3.10 Phương pháp đo nhiệt độ bề mặt WT chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 56 2.3.11 Đo tỷ lệ thành phần nước, mức độ rò rỉ ion độ ẩm đất 56 2.3.12 Xác định hàm lượng malondiadehyde khả hoạt động enzyme chống oxy hóa 57 2.3.13 Phương pháp trồng, xử lý thu mẫu đậu gà 57 2.3.14 Tách chiết RNA, xử lý DNAseI, tổng hợp cDNA cho phân tích qRT-PCR 58 2.3.15 Phân tích biểu gen kỹ thuật qRT-PCR 58 2.3.16 Tiêu chuẩn lựa chọn gen CaNAC đáp ứng hạn tiềm 59 2.3.17 Phân tích ý nghĩa thống kê 60 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Nghiên cứu chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với điều kiện hạn mơ hình Arabidopsis 61 3.1.1 Kết thiết kế cấu trúc vector phân tích hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men 61 3.1.2 Kết phân lập thiết kế vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 63 v 3.1.3 Kết sàng lọc lựa chọn dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 66 3.1.4 Kết đánh giá kiểu hình Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện thường 68 3.1.5 Kết đánh giá khả kháng hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 70 3.1.6 Kết đánh giá mức độ phá hủy tế bào tốc độ thoát nước chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 72 3.1.7 Sự biểu GmNAC085 tăng cường bảo vệ Arabidopsis chuyển gen chống lại phản ứng oxy hóa stress hạn gây 74 3.1.8 Sự biểu GmNAC085 làm tăng mức biểu gen thị Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện stress hạn 77 3.2 Đánh giá mức độ biểu gen CaNAC đậu gà điều kiện xử lý hạn ABA 84 3.2.1 Kết so sánh tỷ lệ thành phần nước hai giống đậu gà Hashem ILC482 điều kiện xử lý nước 84 3.2.2 Đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý hạn 85 3.2.3 Đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý ABA 94 3.2.4 Sự biểu khác gen CaNAC giống ILC482 Hashem 102 3.2.5 Sự biểu khác gen CaNAC rễ giống ILC482 Hashem 105 3.2.6 Lựa chọn gen CaNAC tiềm cho nghiên cứu chức sâu 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC 134 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt ABA Abscisic acid Axit abscisic Ade Adenine A-đê-nin ABRC3 ABA response complex Phức hợp đáp ứng ABA AD Activation domain Vùng trình tự hoạt hóa AP2/ERF APETALA2/Ethylene response Các yếu tố liên kết đáp ứng element binding factors với ethylene APX Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase AREB/ABF Abscisic acid-responsive Liên kết yếu tố đáp ứng ABA element binding ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphat bZIP bZIP transcription factor Yếu tố phiên mã bZIP CAT Catalase Catalaza CCA1 Circadian clock associated Liên kết nhịp sinh học cDNA complementary DNA ADN bổ sung CO2 Carbon dioxide cacbon điơxít CSD1 Copper/Zinc superoxide Copper/Zinc superoxide dismutase dismutase D Drought Xử lý hạn DAD Days after drought Ngày sau xử lý hạn DNA Deoxinucleic acid Axit deoxinucleic DREB Dehydration responsive Protein liên kết với yếu tố đáp element-binding protein ERD1 GM Early ứng nước to Đáp ứng sớm với bất lợi responsive dehydration stress nước Germination medium Môi trường nảy mầm vii GR Glutathione reductase Glutathione reductase His Histidine Histidin IAA Indole-3-acetic acid Axit indole-3-acetic LB Lysogeny broth Môi trường giàu dinh dưỡng nuôi khuẩn E.coli LEA Late embryogenesis abundant Sự phát triển phôi muộn LHY Late elongated hypocotyl Chậm kéo dài trụ mầm MDA Malondiadehyde Malondialdehyd MGDG Monogalactosyldiacylglycerol Monogalactosyldiacylglycerol miRNA microRNA ARN không mã hóa mRNA Messenger RNA RNA thơng tin MYB/MYC MYB/MYC transcription Yếu tố phiên mã MYB/MYC factor NAC NAM (no apical meristem), Yếu tố phiên mã NAC ATAF1/2, CUC2 (cup- shaped cotyledon) NACRS NAC recognition sequence NADPH Nicotinamide adenine Nicotinamit dinucleotide phosphate NCED Nine-cis-epoxy Trình tự nhận biết NAC adenin dinucleotit phosphat carotenoid Nine-cis-epoxy carotenoid dioxygenase dioxygenase O2- Superoxide Superoxit OE Overexpression Sự biểu PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase POD Peroxidase Peroxidase PSI Photosystem I Hệ thống quang hợp I PSII Photosystem II Hệ thống quang hợp II qRT-PCR Quantitative real-time PCR PCR định lượng thời gian thực viii RD20 Responsive to desiccation 20 Đáp ứng với nước 20 RD29B Responsive to desiccation 29B Đáp ứng với nước 29B RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNAi RNA interference RNA can thiệp ROS Reactive oxygen species Các loại phản ứng oxi hóa RT-PCR Reverse RuBisCO transcription Chuỗi phản ứng polymerase polymerase chain reaction phiên mã ngược Ribuloses-bisphosphate Ribuloses-bisphosphate carboxylase/oxygenase carboxylase/oxygenase sAPX Stromal ascorbate peroxidase Stromal ascorbate peroxidase SD Synthetic dropout Môi trường nuôi nấm men SOD Superoxide dismutase Superoxide dismutase SSC Saline-sodium citrate Saline-sodium citrate TF Transcription factor Yếu tố phiên mã Trp Tryptophan Tryptophan TRR Transcriptional regulatory region Vùng điều hòa phiên mã WT Wild-type Loài (cây) gốc, loài nguyên thủy, đối chứng không chuyển gen Tưới nước đầy đủ WW Well-watered WRKY WRKY transcription factor Yếu tố phiên mã WRKY YEB Yeast Extract Broth Dịch chiết nấm men nuôi khuẩn Agrobaceria ix DANH MỤC BẢNG TT Bảng Nội dung Trang 1.1 Diện tích canh tác số trồng bị ảnh hưởng hạn hán giới 1.2 Ảnh hưởng hạn hán đến suất trồng số nước giới 1.3 Một số yếu tố phiên mã NAC trồng khác 29 1.4 Một số gen NAC nghiên cứu chức 33 trình đáp ứng với hạn hán trồng 1.5 Sản lượng đậu tương theo năm giới (triệu tấn) 37 1.6 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 38 năm gần 1.7 Tình hình sản suất đậu gà giới năm 2018 40 1.8 Ảnh hưởng hạn hán đến số giai đoạn đậu 44 tương đậu gà 1.9 Một số gen ứng viên chuyển vào họ đậu 45 nhằm tăng cường khả chịu hạn 3.1 Kết dự đốn trình tự nhận biết NAC (CACG) 79 vùng promoter 1000bp số gen thị 3.2 Mức độ biểu gen CaNAC giống đậu 88 gà chịu hạn tốt ILC482 chịu hạn Hashem điều kiện xử lý nước 3.3 Mức độ biểu gen CaNAC rễ giống 90 đậu gà chịu hạn tốt ILC482 chịu hạn Hashem điều kiện xử lý nước 3.4 Mức độ biểu gen CaNAC giống x 96 đậu gà chịu hạn tốt ILC482 chịu hạn Hashem điều kiện xử lý ABA 3.5 Mức độ biểu gen CaNAC rễ giống 98 đậu gà chịu hạn tốt ILC482 chịu hạn Hashem điều kiện xử lý ABA 3.6 So sánh tỷ lệ biểu 19 gen CaNAC 105 giống ILC482 Hashem điều kiên thường, xử lý nước ABA 3.7 So sánh mức độ biểu 19 gen CaNAC rễ giống ILC482 Hashem điều kiên thường, xử lý nước ABA xi 108 DANH MỤC HÌNH TT Hình Nội dung Trang 1.1 Biểu đồ nhiệt độ giới 1.2 Bản đồ diện tích khơ hạn tỉnh Ninh Thuận năm 2014-2016 10 1.3 Ảnh hưởng hạn hán tới trồng chế chống chịu 13 trồng hạn hán 1.4 Sự đáp ứng thực vật điều kiện hạn hán 28 1.5 Cấu trúc đặc trưng yếu tố phiên mã NAC 30 1.6 Ảnh hưởng hạn hán tới họ đậu 41 3.1 Kết thiết kế vector pGBKT7:TRR cho phân tích 64 biểu nấm men 3.2 Kết phân tích khả phiên mã GmNAC085 64 nấm men 3.3 Kết nhân dòng gen GmNAC085 từ thư viện cDNA 66 PCR kiểm tra khuẩn lạc vector tái tổ hợp pKS:GmNAC085 3.4 Kết sàng lọc lựa chọn Arabidopsis chuyển 68 gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 môi trường GM có chứa kháng sinh kanamycin 3.5 Kết phân tích southern blot Arabidopsis 69 chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 3.6 Kiểu hình thân Arabidopsis chuyển gen 70 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện bình thường 3.7 Kiểu hình rễ hàm lượng diệp lục Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện bình thường xii 71 3.8 Kiểu hình chịu hạn Arabidopsis chuyển 72 gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sử dụng phương pháp phân tích tỷ lệ sống sót 3.9 Kiểu hình chịu hạn 35S:GmNAC085 OE1 73 OE2 sử dụng phương pháp phân tích giảm sinh khối 3.10 So sánh tỷ lệ thành phần nước mức độ dò rỉ ion 75 WT chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện xử lý hạn 3.11 So sánh nhiệt độ bề mặt WT 76 chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện xử lý hạn 3.12 Hàm lượng Malondialdehyde (MDA) WT 77 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sau 12 ngày xử lý hạn 3.13 Hoạt tính enzyme chống oxy hóa mức độ biểu 78 gen liên quan WT 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sau 12 ngày xử lý hạn 3.14 Mức độ biểu gen liên quan tới bất lợi 80 WT 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sau 12 ngày xử lý hạn 3.15 Cơ chế đáp ứng Arabidopsis chuyển gen 84 35S:GmNAC085 với điều kiện hạn 3.16 So sánh tỷ lệ thành phần nước hai đậu gà ILC482 86 Hashem trình xử lý nước 3.17 Mức độ biểu 19 gen CaNAC giống 89 chịu hạn Hashem giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện xử lý nước 3.18 Mức độ biểu 19 gen CaNAC rễ giống chịu xiii 91 hạn Hashem giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện xử lý nước 3.19 Sự trùng lặp gen CaNAC rễ hai 92 giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý nước 3.20 Mức độ biểu 19 gen CaNAC giống chịu 97 hạn Hashem giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện xử lý ABA 3.21 Mức độ biểu 19 gen CaNAC rễ giống 99 chịu hạn Hashem giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện xử lý ABA 3.22 Sự trùng lặp gen CaNAC rễ hai giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý ABA xiv 100 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hạn hán biết tới yếu tố bất lợi phi sinh học ảnh hưởng tiêu cực tới suất trồng an ninh lương thực toàn giới Hơn nữa, hạn hán nguyên nhân gây số ảnh hưởng bất lợi khác trình trao đổi chất thực vật co giãn tế bào, phá hủy màng tế bào, giảm chức enzyme tham gia trình liên kết màng, oxy hóa lipid protein việc tích lũy sản phẩm dư thừa phản ứng oxy hóa, ức chế khả quang hợp Để đối phó với hạn, trồng kích hoạt số chế đáp ứng với bất lợi mức độ sinh hóa, sinh lý phân tử khác để giúp chúng sống sót Hơn nữa, thực vật đáp ứng với hạn hán cách gián tiếp thông qua số mạng lưới điều khiển khác nhau, yếu tố phiên mã (TF) đóng vai trị quan trọng việc điều hịa biểu gen mục tiêu Các protein NAC biết tới siêu họ số họ TF có mặt hầu hết loài thực vật Các TF NAC tham gia vào tất trình sinh trưởng, phát triển đáp ứng với môi trường bất lợi khác thực vật Trong năm gần đây, nhiều công bố vai trò TF NAC tham gia trình đáp ứng hạn thực vật Cụ thể, vài gen NAC phát nghiên cứu chức điều kiện stress hạn stress thẩm thấu mơ hình Arabidopsis (ANAC019, ANAC055, ANAC072/RD26 ANAC016), số trồng quan trọng lúa (OsNAC5, OsNAC6 OsNAC10), lúa mỳ (TaNAC2, TaNAC29 TaNAC67), cho thấy tiềm việc cải thiện khả chống chịu hạn cho trồng Tuy nhiên, có cơng bố nghiên cứu chức cụ thể TF NAC đối tượng họ đậu Trong khi, đậu tương (Glycine max L.) đậu gà (Cicer arietinum L.) biết tới trồng họ đậu quan trọng trồng nhiều vùng giới nguồn thực phẩm cung cấp dinh dưỡng thiết yếu cho người vật nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng hạn hán Cụ thể, hạn hán ảnh hưởng tới tất giai đoạn sinh trưởng phát triển họ đậu dẫn đến làm giảm suất sản lượng đậu tương đậu gà tồn giới Chính từ ảnh hưởng bất lợi hạn hán trồng nói chung họ đậu nói riêng; với vai trị tầm quan trọng họ đậu, cụ thể đậu tương đậu gà nông nghiệp Việt Nam giới, xây dựng luận án nghiên cứu khoa học với tiêu đề “Nghiên cứu vai trò yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn họ đậu” Trong đó, nghiên cứu tập trung làm rõ chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với hạn hán đối tượng mơ hình Arabidopsis thaliana Sau đó, dựa kết nghiên cứu chức cụ thể gen GmNAC085 làm sáng tỏ, tiếp tục sàng lọc phân tích để phát gen NAC khác có tiềm đáp ứng tốt với hạn đối tượng họ đậu quan trọng khác, cụ thể đậu gà Mục tiêu nghiên cứu luận án 2.1 Mục tiêu tổng quát Mục tiêu đề tài nhằm làm rõ chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với điều kiện hạn mơ hình Arabidopsis tìm gen CaNAC tiềm liên quan đến đáp ứng với điều kiện hạn đậu gà 2.2 Mục tiêu cụ thể  Nghiên cứu để làm rõ chức gen GmNAC085trong trình đáp ứng với điều kiện xử lý hạn mơ hình Arabidopsis, từ tìm chế chịu hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085  Phân tích, đánh giá mức độ biểu gen CaNAC hai giống đậu gà chịu hạn Hashem chịu hạn tốt ILC482 điều kiện xử lý nước ABA kỹ thuật qRT-PCR để tìm gen CaNAC tiềm có khả đáp ứng tốt với hạn hán Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học  Các kết nghiên cứu luận án cho thấy GmNAC085 gen đáp ứng với bất lợi đậu tương đóng vai trị yếu tố hoạt hóa phiên mã Sự biểu liên tục GmNAC085 Arabidopsis điều khiển promoter 35S làm tăng cường khả chống chịu hạn chuyển gen thông qua điều chỉnh q trình sinh trưởng cây, giảm tỷ lệ nước phá hủy màng tế bào, tăng mức độ hoạt động enzyme chống oxy hóa tăng biểu gen đáp ứng tới bất lợi chuyển gen  Kết luận án cung cấp liệu khoa học biểu khác gen CaNAC hai giống đậu gà chịu hạn Hashem chịu hạn tốt ILC482 điều kiện xử lý nước ABA; đồng thời dựa vào kết so sánh mức độ biểu gen CaNAC hai giống đậu gà tiêu chí lựa chọn gen ứng viên, xác định số gen CaNAC có tiềm đáp ứng với hạn tốt cho nghiên cứu chức cụ thể đối tượng mơ hình/cây trồng quan trọng  Ngoài ra, luận án xem tài liệu tham khảo có ý nghĩa cho cơng tác giảng dạy hoạt động nghiên cứu khoa học liên quan tới lĩnh vực cải tạo trồng nông nghiệp có khả đáp ứng tốt với hạn hán 3.2 Ý nghĩa thực tiễn  Kết luận án cung cấp nhìn chi tiết vai trị tích cực gen GmNAC085 việc điều khiển thích nghi trồng với hạn hán, từ cho thấy tiềm ứng dụng gen GmNAC085 việc phát triển trồng chuyển gen chịu hạn  Mặt khác, luận án cung cấp gen CaNAC ứng cử viên đầy triển vọng đáp ứng với nước cho nghiên cứu chức cụ thể trước sử dụng chúng kỹ thuật di truyền để phát triển đậu gà chuyển gen, trồng khác có suất vượt trội điều kiện thiếu nước Những đóng góp luận án  Kết luận án cho thấy GmNAC085 đóng vai trị chất hoạt hóa phiên mã nấm men, với vùng hoạt hóa nằm đầu C- GmNAC085 Khi so sánh với đối chứng không chuyển gen (WT), Arabidopsis chuyển gen (35S:GmNAC085) cho thấy giảm tăng trưởng, cải thiện khả chịu hạn thông qua việc tăng cường tính tồn vẹn màng tế bào giảm tốc độ thoát nước điều kiện thiếu nước Hơn nữa, giảm hàm lượng MDA kèm với việc tăng khả hoạt động enzyme chống oxy hóa SOD, CAT APX 35S:GmNAC085 Cùng với đó, biểu mạnh gen mã hóa enzyme chống oxy hóa gen đáp ứng với hạn 35S:GmNAC085 so với WT điều kiện hạn Các kết cung cấp nhìn rõ nét vai trị tích cực GmNAC085 việc điều hịa đáp ứng trồng với hạn hán, từ cho thấy tiềm ứng dụng GmNAC085 công tác phát triển giống trồng kháng hạn  Cùng với đó, luận án đánh giá biểu 19 gen CaNAC đáp ứng với nước rễ hai giống đậu gà đối lập tính chịu hạn điều kiện ngâm nước (đối chứng), xử lý nước ABA, để kiểm tra tương quan mức độ biểu khác gen CaNAC khả chịu hạn khác hai giống Kết phân tích qRT-PCR cho thấy mối quan hệ tích cực số lượng gen tăng giảm xử lý nước khả chịu hạn Khả chịu hạn cao giống ILC482 có thể, phần nhiều gen CaNAC tăng mức độ biểu gen giảm mức độ biểu mô rễ giống ILC482 so với Hashem Ngoài ra, so sánh đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống đậu gà ILC482 Hashem cho thấy đặc trưng biểu đáp ứng với xử lý nước khác nhau, điều biểu gen CaNAC liên quan tới đặc trưng mô kiểu gen Hơn nữa, kết phân tích cho thấy khả chịu hạn tốt giống ILC482 so với Hashem liên quan tới gen CaNAC02, 04, 05, 16 24 Do vậy, kết luận án cung cấp gen CaNAC tiềm hứa hẹn cho việc nghiên cứu chức cụ thể chúng, làm tiền đề cho việc phát triển giống đậu gà/các họ đậu quan trọng khác có khả cải thiện suất điều kiện hạn hán  Tóm lại, luận án cung cấp sở khoa học tham gia TF NAC vào trình đáp ứng với điều kiện hạn họ đậu Qua đó, cho thấy tiềm ứng dụng TF NAC cải tạo giống trồng có khả chống chịu hạn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hạn hán ảnh hưởng bất lợi hạn hán trồng 1.1.1 Những thiệt hại ngành trồng trọt hạn hán gây Nền nơng nghiệp tồn cầu kỷ 21 phải đối mặt với thách thức khó khăn cần phải tăng suất trồng lên gần 70% để đáp ứng nhu cầu lương thực cho khoảng 9,7 tỷ người vào năm 2050 [24], [59] Tuy nhiên, mục tiêu tăng suất trồng gặp phải nhiều thách thức docác khu vực canh tác ngày bị ảnh hưởng yếu tố ngoại cảnh bất lợi Trong số yếu tố bất lợi phi sinh học khác thách thức tới sản xuất trồng tồn cầu, hạn hán yếu tố ảnh hưởng tiêu cực diễn hầu khắp lục địa [59], [102], [106], [110] Cùng với đó, ấm lên tồn cầu biến đổi khí hậu (Hình 1.1) ngun nhân làm cho diện tích hạn hán giới dự đốn có khả vượt q 20% vào cuối kỷ này, đặc biệt vùng Trung Nam Mỹ, khu vực Trung Tây Âu, khu vực Nam Á [59] Ở khu vực Nam Á, nơi có 75% nơng dân làm nơng nghiệp phụ thuộc vào lượng mưa bị thiệt hại khoảng 84 tỷ USD cho biến đổi khí hậu tồn cầu Hầu hết loại trồng nhạy cảm với hạn hán, dẫn đến suất bị thiệt hại 50% [109] Khu vực Châu Phi bị ảnh hưởng nghiêm trọng hạn hán gần sau 12 năm, thiệt hại vào giai đoạn 2009 – 2011 [102] Trong đó, khu vực Đơng Nam Á, hạn hán gây thiệt hại khoảng 40% suất trồng hàng năm [64] Ngồi ra, biến đổi khí hậu ảnh hưởng trực tiếp tới suất trồng vật nuôi khu vực Địa Trung Hải Trung Đơng [109] Hình 1.1 Biểu đồ nhiệt độ giới Chú thích: Cập nhật ngày 03/07/2018 http://madriver.me/weather-worldmap.html/current-weather-maps-weathercom-map-and-world-temperature-best-of-at Hạn hán xảy tất châu lục giới với cường độ tần suất khác Khoảng 17% diện tích đất canh tác tồn cầu bị ảnh hưởng hạn hán giai đoạn 1980 – 2006 Hạn hán chủ yếu ảnh hưởng tới trồng phụ thuộc vào lượng nước mưa tự nhiên, chiếm 80% tổng diện tích canh tác tồn giới [59] Theo nghiên cứu [94], có 23 triệu hecta lúa nước khu vực châu Á (chiếm 20% tổng diện tích lúa giới) canh tác điều kiện dễ bị hạn hán Ở Pakistan, khoảng 33% lúa mỳ, 27% ngô, 56% cao lương kê, 52% lúa mạch, 77% đậu gà, 84% lúa mạch, 24% cải dầu mù tạt, 100% thầu dầu canh tác điều kiện phụ thuộc vào nước mưa bị ảnh hưởng nặng nề hạn hán [40] Trong đó, phần diện tích canh tác bị ảnh hưởng vĩnh viễn hạn hán giới ước tính khoảng 28% cao lương, 20% lúa mỳ, 19% lúa mạch 19% ngô [102], [106] Các tỷ lệ phần trăm khác đáng kể khu vực năm (Bảng 1.1) Bảng 1.1 Diện tích canh tác số trồng bị ảnh hưởng hạn hán giới Diện tích trồng bị Loại trồng Vùng ảnh hưởng hạn hán (%) Lúa mạch (Hordeum vulgare L.) Ngô (Zea mays L.) Lúa (Oryza sativa L.) Lúa mỳ (Triticum aestivum L.) Australia 65-70 Nam Mỹ 50 Đông Á 50 Châu Âu 60 Đông Nam Á 65 Châu Phi 80 Nam Mỹ 47 Nam Á 65 Nguồn: [102] Hơn nữa, hạn hán ảnh hưởng đến tổng suất trồng, ảnh hưởng thay đổi theo vùng mùa vụ xuất stress khác nhiệt độ cao (Bảng 1.2) Theo cơng bố [102] ước tính rằng, khoảng 36% tổng sản lượng trồng miền Đông Ấn Độ bị hạn hán Đặc biệt, biến đổi khí hậu toàn cầu làm gia tăng xuất mức độ nghiêm trọng hạn hán, nhiệt độ tăng làm gia tăng bốc nước Số liệu ghi nhận Bảng 1.2 cho thấy, hạn hán làm giảm suất số trồng quan trọng lúa, ngô, đậu tương, đậu gà, lạc, ngô, số nước giới Theo dự báo tình trạng hạn hán cịn nghiêm trọng năm tới khu vực bị ảnh hưởng hạn hán tăng gấp đơi vào năm 2050 Các khu vực bị ảnh hưởng giới bao gồm Bắc Trung Mỹ, Nam Trung Quốc Nam Brazil Tính chất thất thường khơng thể đốn trước chu kỳ hạn hán lũ lụt tăng lên [33], [102] Bảng 1.2 Ảnh hưởng hạn hán đến suất trồng số nước giới Năng suất giảm (%) Quốc gia 60 Pakistan 46-71 Jordan 15 Pakistan 50-80 Pháp 55-72 Ấn Độ 43-80 Iran 48 Cộng hòa Séc 89 Cộng hòa Séc 42-46 Ấn Độ Lúa mạch đen (Secale cereale L.) 52 Cộng hòa Séc Cao lương (Sorghum bicolor L.) 17 Pakistan Loại trồng Thầu dầu (Ricinus communis L.) Đậu tương (Glycine max L.) Đậu gà (Cicer arietinum L.) Lạc (Arachis hypogea L.) Ngô (Zea mays L.) Khoai tây (Solanum tuberosum L.) Lúa (Oryza sativa) Nguồn: [33], [102] Trong đó, Việt Nam nước chịu tác động không nhỏ biến đổi khí hậu tồn cầu (Hình 1.1) Tình trạng khô hạn ảnh hưởng trực tiếp tới sản xuất nông nghiệp Việt Nam Theo [8], vùng sản xuất nơng nghiệp Việt Nam hàng năm phải đối mặt với nhiều đợt hạn lớn, có thời điểm hạn ảnh hưởng tới 60% diện tích canh tác vùng sản xuất Dựa theo báo cáo Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thơn tính đến cuối tháng 3/2014, 26 nghìn hecta diện tích trồng vụ Đơng Xn năm 2013 – 2014 bị thiếu nước, tập trung chủ yếu tỉnh phía nam Đắk Lắk, Ninh Thuận Bình Phước, tính riêng tỉnh Ninh Thuận 2.079 hecta (Hình 1.2), gồm 501 hecta bị thiệt hại 100%, 1.578 hecta bị giảm suất [2] Hình 1.2 Bản đồ diện tích khơ hạn tỉnh Ninh Thuận năm 2014-2016 (Nguồn: http://kttvntb.gov.vn/Doc.aspx?d=579) Gần hơn, từ đầu vụ sản xuất Hè Thu 2019, khu vực Trung Bộ, nắng nóng gần xảy liên tiếp với thiếu hụt lượng mưa, dòng chảy nên số tỉnh xảy tình trạng hạn hán, thiếu nước Hàng chục nghìn hecta lúa trồng quan trọng khác tiếp tục đối mặt với tình trạng hạn hán phải điều chỉnh kế hoạch sản xuất, chí có diện tích trắng (https://dantocmiennui.vn/xa-hoi/san-xuat-nong-nghiepdoi-dien-voi-han-han-gia-tang/234339.html) Qua thấy, hạn hán nguyên nhân gây thiệt hại đáng kể cho suất trồng an ninh lương thực toàn cầu 10 1.1.2 Hạn hán nguyên nhân gây hạn hán trồng Thực vật loài sinh vật tự nhiên thường xuyên tiếp xúc với bất lợi môi trường khác bao gồm bất lợi sinh học phi sinh học Hạn bất lợi phi sinh học quan trọng ảnh hưởng tiêu cực tới trình sinh trưởng phát triển thực vật Hạn biết tới đặc trưng thường xuyên xuất khí hậu hầu hết khu vực, đặc biệt khu vực khô cằn bán khô cằn; đặc điểm khác từ vùng sang vùng khác Hạn thuật ngữ chung để mơ tả tượng khí thời tiết thường giải thích khoảng thời gian khơng có mưa Hạn khó để xác định; mơ tả dựa số quan điểm thơng qua việc quan sát thấu kính khí tượng, nông nghiệp, thủy văn kinh tế xã hội Nói chung, dựa quan điểm nơng nghiệp sinh lý, hạn xảy lượng nước có sẵn cho trồng bị giảm độ ẩm đất thấp thời điểm định [24], [33], [102], [106] Mặt khác, bất lợi nước (hay thiếu hụt nước) thực vật xảy tốc độ thoát nước từ bề mặt cao hấp thụ nước rễ Sự cân trình hấp thụ nước nước từ thực vật chủ yếu xảy tiềm nước đất thấp tiềm nước rễ Hầu hết điều kiện khí gây tình trạng thiếu nước liên tục thoát nước bốc Bởi vậy, hạn nông nghiệp xuất sau đợt hạn khí tượng Nhìn chung, điều kiện bình thường hạn thảm họa thiên tai nhiều khu vực lại trở thành vấn đề quan trọng người sử dụng nước cách lãng phí Ngoài ra, số vùng lượng mưa vừa đủ lượng mưa không đồng dẫn đến bất lợi nước thực vật Nhìn nhận cách thực tế, hạn xảy tất nước phát triển phát triển, tất xã hội phải chịu tác động tượng tự nhiên [33], [102], [106] 11 Ngày nay, biến đổi khí hậu tồn cầu làm thay đổi lượng mưa nhiều vùng giới, từ dẫn đến gia tăng nhiệt độ lượng cacbon điơxít (CO2) Tuy nhiên, có nhiều ngun nhân khác gây tượng stress hạn trồng nhiệt độ cao, cường độ chiếu sáng mạnh, gió khô, tất chúng làm tăng bốc nước từ đất Ngoài ra, yếu tố làm tăng nước từ từ làm cho chúng bị thiếunước Đôi khi, stress hạn không thực xuất thiếu hụt nước mơi trường Trong số trường hợp, có đủ lượng nước đất số tác nhân đất độ mặn cao, nhiệt độ đất thấp, ngập úng ức chế làm giảm hấp thụ nước rễ sau dẫn tới stress nước trồng Loại stress hạn gọi hạn giả hay hạn sinh lý điều kiện khí khơng phải yếu tố định trường hợp [83], [106] Các triệu chứng hạn khác trồng tùy thuộc vào loài thực vật, giai đoạn phát triển, điều kiện sinh trưởng yếu tố môi trường khác Mức độ nghiêm trọng hạn, thời gian hạn, điều kiện hóa lý đất sức sống yếu tố khác ảnh hưởng tới triệu chứng hạn hán thực vật Thông thường, triệu chứng hạn dễ nhận biết thực vật lá, héo lá, vàng rụng sớm Ngoài ra, có số triệu chứng bất thường nứt vỏ cành cây, chết nhánh, phát triển còi cọc Cuối cùng, điều kiện khắc nghiệt làm chết [33], [83], [106] 1.1.3 Ảnh hưởng hạn trồng Trong điều kiện hạn, trồng có đáp ứng/nhạy cảm khác nhau, tùy thuộc vào loại trồng; nhiên trường hợp, suất cuối bị giảm đáng kể Stress hạn ảnh hưởng đến số khía cạnh q trình sinh trưởng phát triển trồng, gồm có nảy mầm, phát triển chồi rễ, quang hợp giai đoạn sinh sản, (Hình 1.3) [35], [83] 12 Hình 1.3 Ảnh hưởng hạn tới trồng chế chống chịu trồng hạn 1.1.3.1 Ảnh hưởng hạn tới sinh trưởng phát triển trồng Hạn biết tới yếu tố bất lợi đa chiều trồng, ảnh hưởng đến khía cạnh khác trình sinh trưởng phát triển thực vật như: bị héo dẫn tới khô rụng, rễ dài đâm sâu rông hơn, thời gian hoa sớm hơn, thời gian sinh trưởng ngắn lại Ngồi ra, hạn hán ảnh hưởng tiêu cực tới số lượng chất lượng tăng trưởng suất cây, đặc biệt trồng nông nghiệp quan trọng Sự tăng trưởng phát triển phụ thuộc vào phân chia, kéo dài phân hóa tế bào Tất giai đoạn bị ảnh hưởng điều kiện khô hạn chất xúc tác, hoạt động enzyme bị rối loạn giảm việc cung cấp lượng từ trình quang hợp Tiềm nước trương nước bị giảm điều kiện thiếu nước, thực vật 13 khơng thể thực chức bình thường Giảm trương nước dẫn tới ức chế mở rộng tăng trưởng tế bào, mà mở rộng tăng trưởng tế bào tượng cần thiết cho giai đoạn đầu sinh trưởng hình thành Nhìn chung, yếu tố đóng vai trị quan trọng trồng gặp điều kiện stress hạnđó là: mức độ nghiêm trọng stress, thời điểm thời gian bị stress, đáp ứng trồng sau loại bỏ stress [83], [106] 1.1.3.2 Ảnh hưởng hạn tới đặc điểm hình thái giải phẫu Hạn biết ảnh hưởng đến nhiều khía cạnh hình thái giải phẫu thực vật Hình thái cấu trúc bị thay đổi thiếu nước Việc giảm kích thước lá, giảm kích thước số lượng tế bào khí khổng, giảm độ dày thành tế bào, giảm hình thành lớp cutin bề mặt lá, tăng già hóa thay đổi xảy thực vật bị ảnh hưởng hạn hán Sự phát triển diện tích thích hợp mở tế bào khí khổng yếu tố cần thiết cho trình quang hợp thực vật Do vậy, trình quang hợp thực vật thiếu nước bị giảm diện tích thấp, khả trao đổi khí qua khí khổng cao hơn, làm tăng q trình già hóa Ảnh hưởng hạn hán hình thái thực vật giảm kích thước Tỷ lệ quang hợp thấp yếu tố quan trọng làm giảm kích thước sinh khối Giảm hàm lượng chất diệp lục triệu chứng điển hình gây hạn làm thay đổi hình thái thực vật Hơn nữa, để tăng khả hấp thụ nước điều kiện thiếu nước, trồng có khả mở rộng rễ tạo hệ rễ phân nhánh Việc tăng sinh khối rễ điều kiện hạn mở rộng hệ rễ nhìn chung giúp hấp thụ nước tốt Theo đó, phát triển chồi giảm gặp điều kiện thiếu nước nhẹ, giảm tăng trưởng rễ đáng kể Bởi vậy, điều kiện nước, tỷ lệ rễ tăng, nhiên tổng sinh khối thực vật giảm đáng kể [102], [106], [136] 14 1.1.3.3 Ảnh hưởng hạn tới mối quan hệ nước Tỷ lệ thành phần nước, tiềm nước lá, sức chịu đựng khí khổng, tốc độ thoát nước nhiệt độ bề mặt tán yếu tố quan trọng mối quan hệ nước Giảm tỷ lệ thành phần nước ảnh hưởng sớm hạn thực vật Tỷ lệ thành phần nước thấp làm giảm tiềm nước dẫn đến đóng khí khổng Sức chịu đựng cao khí khổng nguyên nhân dẫn tới giảm tốc độ thoát nước cuối làm tăng nhiệt độ bề mặt Trong đó, nước yếu tố kiểm sốt nhiệt độ Sự gia tăng sức chịu đựng khí khổng lý quan trọng làm cho nhiệt độ bề mặt cao, đặc biệt cường độ ánh sáng cao Bởi vậy, có hiệu ứng phản hồi tích cực nhiệt độ sức chịu đựng khí khổng Tuy nhiên, việc đóng khí khổng làm nhiệt độ bề mặt tăng mức, dẫn đến làm biến tính protein, đặc biệt enzyme Ngoài ra, nhiệt độ cao bề mặt ảnh hưởng đến thay đổi linh hoạt màng tế bào, tác động đến khía cạnh khác q trình trao đổi chất Những thay đổi lý quan trọng gây xáo trộn chức trao đổi chất tế bào quang hợp, hơ hấp, hấp thu ion dinh dưỡng khống, tổng hợp đại phân tử axit amin, protein chất khác [26], [83], [106] 1.1.3.4 Ảnh hưởng hạn tới trình quang hợp Quá trình quang hợp bị giảm bị ức chế tác động stress hạn thực vật bậc cao Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng tới quang hợp như: giảm tốc độ giãn nở lá, diện tích bề mặt giảm, nhiệt độ bề mặt tăng, máy quang hợp bị suy yếu già hóa sớm Khi gặp tình trạng thiếu nước, khí khổng yếu tố gây tác động ức chế trình quang hợp Sự thiếu hụt CO2 đóng khí khổng kéo dài, đặc biệt điều 15 kiện bão hòa ánh sáng dẫn đến giảm tích lũy thành phần vận chuyển quang hợp Sự tích lũy hợp chất làm giảm phân tử oxy dẫn tới tăng sản phẩm dạng oxy phản ứng (ROS) superoxide (O2-), hydroxyl (OH-) hydrogen peroxide (H2O2), dẫn đến phá hủy oxy lục lạp Ngoài ra, mức hấp thu CO2 thấp đóng khí khổng yếu tố làm giảm tốc độ quang hợp việc giảm hoạt động enzyme liên quan đến CO2 (trong chu trình Calvin, pha tối) Các phản ứng pha tối hoạt động yếu gây cân pha sáng pha tối trình quang hợp, làm tích lũy ROS lục lạp [26], [83], [102], [106] ROS phá hủy máy quang hợp bao gồm màng thylakoid, sắc tố quang hợp enzyme Sự suy giảm hàm lượng diệp lục điều kiện thiếu nước yếu tố làm giảm cường độ quang hợp Hàm lượng diệp lục giảm gặp hạn phụ thuộc vào thời gian mức độ nghiêm trọng stress hạn Nhiều nghiên cứu rằng, carotenoid nhạy cảm với tình trạng thiếu nước diệp lục [26], [106] Tuy nhiên, không giống diệp lục, điều kiện thiếu nước làm gia tăng sắc tố xanthophyll zeaxanthin antheraxanthin thực vật Các sắc tố xanthophyll cho đóng vai trị bảo vệ thực vật điều kiện thiếu nước vài sắc tố có liên quan tới chu trình xanthophyll, giúp giải độc ROS Enzyme đóng vai trị quan trọng q trình chuyển hóa carbon chu trình Calvin ribuloses-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) Hàm lượng hoạt động RuBisCO giảm nhanh điều kiện thiếu nước Ảnh hưởng thấy rõ tất loài thực vật, mức độ nghiêm trọng phụ thuộc vào loài Sự suy giảm hoạt động RuBisCO q trình axit hóa chất lục lạp, thiếu chất cho carboxyl hóa (CO2 ribulose-bisphosphate), giảm hàm lượng và/hoặc hoạt động 16 chất xúc tác (ATPase, ATP synthase), thay đổi cấu trúc lục lạp RuBisCO, giải phóng RuBisCO từ lạp thể bị tổn thương Ngoài RuBisCO, hoạt động số enzyme khác liên quan đến chuyển hóa carbon phosphoenolpyruvate carboxylase, NADP-malic enzyme, fructose-1,6bisphosphatase, NADP-glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, phosphoribulokinase, sucrose phosphate synthase, pyruvate orthophosphate dikinase bị giảm đáng kể hàm lượng nước xuống thấp điều kiện hạn [26], [106] Hơn nữa, stress hạn làm gián đoạn vận chuyển điện tử phản ứng pha sáng trình quang hợp Tốc độ vận chuyển điện tử thấp gây ảnh hưởng tới q trình phosphoryl hóa tạo ATP làm giảm sinh tổng hợp NADPH/H+ Những thay đổi làm phá hủy máy quang hợp thực vật Bên cạnh đó, hai hệ thống quang điện PSI PSII lục lạp bị stress hạn bị ảnh hưởng, chủ yếu tốc độ vận chuyển điện tử thấp tích lũy sản phẩm ROS dư thừa Để chống lại thiệt hại stress hạn gây cho máy quang hợp, thực vật đáp ứng thích nghi cách tản nhiệt lượng ánh sáng, phá hủy protein D1 PSII, kích hoạt tăng hoạt động chu trình xanthophyll phân giải phức hợp ánh sáng tiếp nhận từ trung tâm phản ứng quang hợp [26], [83], [102], [106] 1.1.3.5 Ảnh hưởng hạn tới trình hơ hấp Sự đáp ứng thích nghi với stress hạn thực vật chế cần nhiều lượng Trong đó, rễ quan tiêu thụ nguồn carbon cố định từ trình quang hợp để giúp cho trì tăng trưởng, tích lũy chất khơ Bên cạnh đó, stress hạn làm tăng tốc độ hô hấp Trong điều kiện thiếu hụt nước, quang hợp bị giảm hô hấp diễn tích cực, gây thay đổi trình chuyển hóa carbon Tốc độ tăng trưởng thực vật xác định xác q trình đồng hóa CO-2 quang hợp tỷ lệ hơ hấp [18], 17 [26] Các trồng nhạy cảm với hạn sử dụng nguồn lượng lớn để hấp thụ nước từ đất, đặc biệt áp lực hạn Trong điều kiện stress hạn, chu trình axit tricarboxylic (TCA) sinh tổng hợp ATP bị ảnh hưởng dẫn đến tốc độ hô hấp giảm Tuy nhiên, hạn chế tốc độ hô hấp rễ sản xuất sinh khối rễ tình trạng thiếu nước nghiêm trọng giúp cải thiện sinh trưởng hoạt động sinh lý [18], [26], [83], [106] 1.1.3.6 Ảnh hưởng hạn tới hấp thu dinh dưỡng khống Stress hạn ảnh hưởng đến khả hấp thu dinh dưỡng thực vật phá vỡ cân nội môi ion tế bào thực vật Nhìn chung, lượng nước bị giảm điều kiện hạn làm hạn chế tổng hợp dinh dưỡng đất, làm giảm hấp thu dinh dưỡng rễ cuối làm giảm mật độ chúng Tình trạng thiếu nước làm thay đổi hấp thu chất dinh dưỡng rễ vận chuyển chất dinh dưỡng đến chồi Cụ thể stress hạn làm tăng nồng độ nitơ (N), giảm nồng độ phốtpho (P), làm giảm hàm lượng canxi (Ca), nhiên khơng có tác động rõ ràng đến nồng độ kali (K) Màng tế bào rễ đóng vai trị thiết yếu việc hấp thu dinh dưỡng khống thích hợp lại dễ bị stress hạn làm tổn thương Sự phá hủy màng tế bào dẫn đến phá vỡ cân nội môi ion [60], [106] Do đó, việc bảo vệ ổn định màng tế bào yếu tố quan trọng giúp có khả chịu hạn tốt 1.1.3.7 Ảnh hưởng hạn tới cân hormone Hormone đóng vai trị quan trọng việc điều chỉnh vận hành trình sinh học thực vật Một số hormone có liên quan đến tương tác thực vật với bất lợi mơi trường hạn Trong đó, axit abscisic (ABA) hormone nội sinh đáp ứng mạnh với stress hạn Khi bị hạn, hàm lượng ABA tăng, ABA tổng hợp rễ chuyển 18 đến chồi, đặc biệt lá, lục lạp [106] Trong điều kiện thiếu nước, hoạt động enzyme ATPase màng sinh chất giảm làm tăng pH thành tế bào dẫn tới việc chuyển đổi ABA thành dạng anion (ABA-) ABAkhông thể vượt qua màng sinh chất tế bào nên di chuyển phía tế bào bảo vệ khí khổng thơng qua nước qua Sự di chuyển ABA tới khí khổng làm đóng khí khổng làm giảm khả dẫn điện khí khổng Sức chịu đựng khí khổng tốt giúp việc nước từ bề mặt thấp hơn, phản ứng sớm để đáp ứng chống chịu với stress hạn Tuy nhiên, khí khổng đóng khiến lượng hấp thụ CO2 thấp, dẫn đến tốc độ quang hợp giảm ABA đóng vai trò quan trọng điều tiết hoạt động aquaporin (được gọi kênh vận chuyển nước qua màng) [100] Hơn nữa, tích lũy ABA điều kiện stress hạn làm giảm việc sản xuất ethylene Trái ngược lại với ABA, auxin đóng vai trị chất điều tiết có tác động tiêu cực đáp ứng với stress hạn thực vật, ví dụ giảm điều tiết axit indole-3-acetic (IAA) gây tích lũy mRNA late embryogenesis abundant (LEA) ABA gây tích lũy protein LEA, có liên quan đến đáp ứng với stress hạn thực vật, đặc biệt hạt Hàm lượng cytokinin (cụ thể zeatin) gibberellin (GA3) nội sinh sụt giảm nhanh chóng gặp stress hạn Cytokinin tham gia vào trì hỗn q trình già hóa, giúp thực vật thích nghi tốt với điều kiện hạn Ngoài ra, stress hạn làm gia tăng tích lũy brassinosteroid (BR) Được biết, brassinosteroid làm tăng hấp thu nước ổn định màng tế bào làm giảm rò rỉ ion qua màng điều kiện hạn [26], [100], [106] 1.1.3.8 Ảnh hưởng hạn tới hàm lượng protein, axit amin khoáng chất Khi gặp điều kiện hạn, thực vật tổng hợp hợp chất protein, axit amin tích lũy số khống chất để đối phó với bất lợi Stress hạn làm 19 thay đổi số lượng chất lượng protein thực vật Nhìn chung, điều kiện hạn hàm lượng protein bị giảmlà ức chế việc tổng hợp protein Khi gặp stress hạn biểu gen bị thay đổi, dẫn tới thay đổi tổng hợp protein mRNA liên quan tới hạn Tuy nhiên, tổng hợp vài protein enzyme ví dụ protein LEA, proteases, enzyme cần thiết cho sinh tổng hợp hợp chất thẩm thấu thích hợp khác nhau, enzyme tham gia vào phân giải ROS (ví dụ superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), ascorbate peroxidase (APX), glutathione reductase (GR)), protein tham gia vào điều khiển việc truyền tín hiệu biểu gen tăng đáp ứng với hạn [61], [106] Sự tích lũy chất hịa tan tương thích để cung cấp cho việc đáp ứng với stress thẩm thấu chế nhằm giúp cho trồng chống chịu với hạn tốt Các chất hịa tan tương thích có trọng lượng phân tử thấp tích lũy mức độ cao mà không gây ảnh hưởng tới thành phần tế bào q trình trao đổi chất Sự tích lũy chất hịa tan tương thích làm tăng áp suất thẩm thấu tế bào kích hoạt hấp thu nước từ đất Hơn nữa, chất hịa tan tương thích cịn tham gia vào điều chỉnh cân thẩm thấu không bào tế bào chất, trì sức trương hàm lượng nước tế bào, giúp bảo vệ thực vật chống nước tính ưa ẩm cao Ngồi ra, chúng thay phân tử nước xung quanh axit nucleic, protein (như enzyme), màng thời gian thiếu nước Các chất hịa tan tương thích ngăn chặn tương tác ion nồng độ cao với thành phần tế bào cách thay phân tử nước xung quanh thành phần bảo vệ chống lại ổn định đại phân tử quan trọng [61], [83], [102], [106] Proline axit amin đóng vai trị chất bảo vệ thẩm thấu Stress hạn làm tăng hàm lượng proline tế bào theo hai cách: (1) tăng tổng hợp proline; (2) giảm hoạt động số enzyme tham 20 gia vào chuyển hóa phân giải proline Sức trương bề mặt thấp nguyên nhân làm tích lũy proline điều kiện hạn Giữa proline sức chống chịu điều kiện hạn có mối liên hệ chặt chẽ với Cụ thể là, proline có vai trị quan trọng điều hịa thẩm thấu Sự tích lũy proline chất chống thẩm thấu khác làm giảm nước tế bào giúp cải thiện việc hấp thụ nước từ đất vào điều kiện hạn [17] Ngoài ra, proline giúp bảo vệ thành phần tế bào tránh khỏi stress oxy hóa, q trình sinh tổng hợp suy giảm proline đóng vai trị quan trọng việc cân lượng lục lạp ty thể Trong trình hình thành phân hủy proline, NADPH/H+ bị oxy hóa lục lạp, giúplàm giảm việc tạo ROS tiêu thụ điện tử dư thừa Hơn nữa, giảm NADH/H+ ty thể cần thiết để cung cấp lượng cho tế bào cho trình phụ hồi sau stress Proline khơng phải chất hịa tan tương thích chất bảo vệ thẩm thấu tạo tích lũy điều kiện thiếu nước Các chất hịa tan tương thích chia làm nhóm chính: (1) đường, gồm có đường đơn (fructose glucose) đường đa (sucrose, trehalose raffinose); (2) axit amin (proline citrulline); (3) hợp chất onium bao gồm amonium bậc ba bậc bốn hợp chất sulfonium (glycine-betaine 3-dimethylsulfoniopropionate); (4) polyol rượu đường (mannitol, pinitol, glycerol, sorbitol) [17], [30], [102], [106] Ngoài hợp chất tương thích, số trường hợp thực vật tích lũy khống chất cụ thể muối (NaCl) để trì nước nội bào Mặc dù tích lũy khống chất khơng phải lúc xuất q trình trao đổi chất Một số loài thực vật chịu mặn tích lũy số khống chất chống lại thiệt hại chế riêng biệt Nhìn chung, thực vật tích lũy khống chất khơng bào hợp chất tương thích tế bào chất để cân nước [101] 21 1.1.3.9 Ảnh hưởng hạn tới lipid Lipid thành phần phong phú màng tế bào đóng vai trị quan trọng việc giúp tế bào thực vật chống chịu lại stress mơi trường Nhìn chung, stress hạn dẫn đến xáo trộn mối liên hệ lipid màng protein làm giảm hoạt động enzyme liên kết màng khả vận chuyển hai lớp Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) glycolipid bị giảm sau gặp stress hạn MGDG thành phần quan trọng màng lục lạp; theo đó, hàm lượng MGDG thấp dẫn đến phá hủy màng lục lạp ảnh hưởng tiêu cực đến q trình quang hợp Sự peroxy hóa lipid tổn thương gây oxy hóa ảnh hưởng biết đến có liên quan đến hạn hán số bất lợi khác thực vật [100], [106] 1.1.3.10 Ảnh hưởng hạn tới q trình oxy hóa Sự tiếp xúc thực vật với loại môi trường bất lợi stress hạn dẫn đến việc tạo sản phẩm ROS bao gồm gốc O2.-, OH.-, H2O2, gốc kiềm, nhóm oxy đơn Việc bất lợi q trình oxy hóa coi căng thẳng thứ cấp, nguyên nhân gây phá hủy tế bào ROS phản ứng với protein, lipid, đại phân tử quan trọng khác, làm biến tính cấu trúc chức đại phân tử Nhiều phận tế bào tạo ROS bị stress hạn lục lạp, ty thể, peroxisome, số loại khác Việc sản sinh ROS hệ thống sinh học thực hai chế nhờ enzyme khơng nhờ enzyme; ngồi ra, cịn phụ thuộc vào số yếu tố nồng độ oxy tế bào [26] Nhìn chung, tích lũy ROS dẫn đến làm đứt gãy DNA, oxy hóa axit amin, protein sắc tố quang hợp, peroxid hóa lipid, Nhưng tiến hóa thực vật giúp chúng có số chế để tránh thiệt hại việc tích lũy ROS gây Tất chế tạo thành hệ thống phòng thủ chống oxy hóa, bao gồm thành phần enzyme 22 enzyme SOD, CAT, POD, APX GR số enzyme liên quan đến phản ứng chống oxy hóa thực vật Glutathione, axit ascorbic, carotenoids, α-tocopherol biết tới số hợp chất liên quan tới hệ thống phòng thủ chống oxy hóa thực vật [26], [83] 1.1.3.11 Ảnh hưởng hạn tới phân tử Nhiều công bố có tham gia phức hợp gen vào trình đáp ứng thực vật với stress hạn Có nhiều đặc trưng biểu gen thay đổi bị stress hạn Đầu tiên, biểu gen liên quan đến đáp ứng sớm với stress hạn, ví dụ chuyển tải tín hiệu TF bị thay đổi Tiếp theo, xảy thay đổi biểu gen liên quan đến đáp ứng muộn vận chuyển nước, cân thẩm thấu, bất lợi oxy hóa, q trình sửa chữa tổn thương Trong đó, cảm biến truyền tải tín hiệu hạn chưa hiểu rõ ràng Nhìn chung, tín hiệu hạn liên kết chặt chẽ với đường truyền tín hiệu ABA ABA đóng vai trị quan trọng trình đáp ứng với hạn thực vật làm phát sinh gen tăng cường đáp ứng Sự biểu gen thực vật điều khiển cấp độ khác nhau, bao gồm giai đoạn phiên mã, sau phiên mã, dịch mã, sau dịch mã Rõ ràng, điều khiển chế đáp ứng thực vật với stress phi sinh học có stress hạn kiểm soát hai cấp độ: mức độ phiên mã dịch mã Các phân tích tin sinh học xác định số TF có khả tăng cường mức độ biểu gặp stress hạn Các TF phân chia vào số nhóm MYB/MYC, protein zinc-finger NAC, Việc điều khiển trình dịch mã chế khác liên quan đến đáp ứng thực vật với hạn hạn kiểm soát việc tổng hợp protein Hơn nữa, nghiên cứu cấp độ sinh học phân tử gần thực vật đáp ứng với căng thẳng không mức độ mRNA protein tế bào liên quan đến giai đoạn sau dịch mã Các microRNA (miRNA) nhóm 23 RNA nhỏ biết tới điều chế quan trọng biểu gen mức độ sau dịch mã Trước đây, nhiều phân tử miRNA như: miR474, miR528, miR167, miR160, miR390, miR166, miR397, miR398, miR393, miR159, miR169, miR172, miR395, NAT-siRNAs, tasiRNA biết có tham gia vào đáp ứng chống chịu với hạn hán thực vật Các nghiên cứu cho thấy, phân tử miRNA tham gia vào trình đáp ứng trung gian với ABA, tín hiệu auxin, sinh trưởng tế bào, chống oxy hóa, điều chỉnh thẩm thấu, quang hợp, hô hấp bị stress hạn [25], [30], [106] 1.2 Sự đáp ứng trồng với hạn Thực vật biết tới sinh vật tự nhiên bị ảnh hưởng yếu tố môi trường bất lợi khác nhau; đó, chúng phát triển chế khác để chống chịu lại bất lợi Hơn nữa, thực vật sinh vật đa bào, đáp ứng chúng với bất lợi mơi trường có stress hạn phức tạp [26], [83], [102], [106] Thông thường, thực vật đáp ứng lại bất lợi môi trường thông qua hai chiến lược tránh bất lợi chống chịu bất lợi Các chế kháng hạn thực vật phân vào ba nhóm chính, gồm: hạn, tránh hạn chống chịu hạn Sự thoát hạn Sự hạn tức thực vật khơng gặp tình trạng thiếu nước, xảy thực vật rút ngắn vòng đời phát triển theo mùa cho phép sinh sản trước môi trường trở nên khô hạn Sự hoa sớm làm cho vòng đời ngắn hơn, coi hình thức thích nghi với hạn cách tránh yếu tố bất lợi Vòng đời thực vật phụ thuộc vào kiểu gen điều kiện môi trường Hơn nữa, thoát hạn xảy phát triển trùng với thời kỳ có độ ẩm đất thích hợp Do đó, trưởng thành sớm giúp hoa sớm tránh bất lợi hạn, nhiên suất thường bị giảm Ví dụ, 24 đậu đũa địa phương trồng Sudan, châu Phi gần sa mạc Sahara có khả hoa sớm trùng với thời gian chấm dứt mùa mưa, cách hạn điển hình [83], [102], [106] Sự tránh hạn Mục đích tránh hạn nhằm trì tiềm nước cao Đặc điểm nhóm chế làm giảm thoát nước cách kiểm soát thoát nước qua khí khổng trì hấp thụ nước từ đất hệ thống rễ phát triển rộng ăn sâu Hệ rễ sâu dày giúp hấp thu nước độ sâu đáng kể đất khoảng cách rộng Lớp biểu bì lơng có khả giúp trì tiềm nước mô cao coi dạng đặc tính chịu hạn Việc tạo cấu trúc làm giảm suất phải tiêu tốn lượng vào việc hình thành chúng Do đó, thực vật sử dụng chế tránh hạn để trì tiềm nước cao thường có kích thước nhỏ [83], [102], [106] Sự chống chịu hạn Đối với thực vật có chế chống chịu hạn làm hạn chế số lượng diện tích nhằm đối phó với tình trạng thiếu nước Tuy nhiên, nhóm chế dẫn đến suất Ngoài ra, cho thấy dạng đặc trưng chịu hạn lơng hình thành tuyến lơng hai mặt Các lơng có nhiệm vụ làm giảm nhiệt độ lá, thoát nước làm tăng phản xạ ánh sáng làm giảm nước tăng sức cản lớp bao phủ bên di chuyển nước khỏi bề mặt Trong đó, rễ quan để hấp thu nước từ đất, tốc độ tăng trưởng, mật độ kích thước rễ yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng stress hạn Một số nghiên cứu rằng, thay đổi hệ thống cấu trúc rễ yếu tố giúp tăng cường khả chống 25 chịu cây, đặc biệt chống chịu biết tới khả thực vật trì diện tích tốc độ sinh trưởng giai đoạn sinh trưởng kéo dài Sự tích lũy chất hịa tan thẩm thấu tương thích, hình thành hệ thống chống oxy hóa, thay đổi trình trao đổi chất, tăng tỷ lệ rễ/chồi, đóng khí khổng chế khác liên quan đến khả chống chịu hạn thực vật (Hình 1.3) [83], [102], [106] Đặc biệt, nghiên cứu chế phân tử trình đáp ứng chống chịu trồng với điều kiện bất lợi môi trường, cụ thể khả chịu hạn biết tới tính trạng nhiều gen kiểm soát Những nghiên cứu liên quan đến khả chống chịu hạn thực vật năm gần cho thấy, có nhiều gen tham gia vào q trình chia thành hai nhóm gen là: nhóm gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển q trình phiên mã, kinase ) nhóm gen chức (gen tham gia vào trình tổng hợp photphatase, protease, protein LEA, protein sinh tổng hợp axit amin, đường,…) (Hình 1.4) [5] Trong đó, yếu tố phiên mã đóng vai trị quan trọng tham gia vào trình điều khiển gen mục tiêu thông qua liên kết với yếu tố điều hòa cis nằm vùng promoter gen liên quan tới bất lợi khác [58], [90], [121], [122], [127] 26 Hình 1.4 Sự đáp ứng thực vật với stress hạn [5] 1.3 Vai trò yếu tố phiên mã NAC trình đáp ứng với stress hạn trồng 1.3.1 Tổng quan yếu tố phiên mã NAC Protein NAC biết đến họ TF lớn số họ TF có mặt hầu hết lồi thực vật Tên viết tắt NAC bắt nguồn từ nhà khoa học phát vùng bảo thủ đặc trưng có protein NAM (no apical meristem) họ hòa thảo, ATAF1/ATAF2 CUC2 (cupshaped cotyledon) Arabidopsis [7], [90], [108] 27 Bảng 1.3 Một số yếu tố phiên mã NAC trồng khác Số lượng gen NAC Loài thực vật Arabidopsis thaliana 117 Lúa (Oryza sativa) 151 Nho (Vitis vinifera) 74 Đậu tương (Glycine max) 152 Đậu Hà Lan (Cajanuscajan) 88 Dầu mè (Jatropha curcas L.) 100 Ngô (Zea mays) 152 Táo (Malus domestica) 180 Đậu gà (Cicer arietinum L.) 71 Khoai tây (Solanum tuberosum) 110 Gỗ dương (Populus trichocarpa) 163 Chuối (Musa acuminata) 167 Thuốc (Nicotiana tabacum) 152 Cà chua (Solanum lycopersicum) 104 Sắn (Manihot esculenta Crantz) 96 Cây vải (Gossypium raimondii) 145 Nguồn: [108] Cho đến nay, phần lớn hệ gen loài thực vật giải trình tự đầy đủ; đó, số lượng lớn gen NAC biết đến, ví dụ Arabidopsis có 117 thành viên, lúa có 151 thành viên, nho 74 thành 28 viên, gỗ dương 163 thành viên, đậu tương thuốc loại có 152 thành viên, đậu gà có 71 gen,… (Bảng 1.3) [108] 1.3.2 Cấu trúc đặc trưng protein NAC Các protein NAC biết có chứa vùng trình tự liên kết với DNA nằm đầu N- vùng trình tự NAC bảo thủ đặc trưng Vùng trình tự NAC bảo thủ đặc trưng đầu N- gồm khoảng 150 – 160 axit amin chia thành vùng phụ (A – E) [7], [90], [108], [122] Vùng trình tự NAC đặc trưng có liên kết với vùng DNA liên kết nhân tế bào, dẫn tới hình thành homodimer heterodimer với protein có chứa vùng NAC Trong đó, vùng trình tự đầu C- protein NAC khác chịu trách nhiệm cho điều khiển khác hoạt động hoạt hóa phiên mã protein NAC Đầu C- protein hoạt động vùng chức năng, đóng vai trị chất hoạt hóa ức chế phiên mã (Hình 1.5) [90], [108], [122] Các nghiên cứu gần protein NAC có vai trị quan trọng trình sinh trưởng, phát triển thực vật đối phó với yếu tố bất lợi sinh học phi sinh học, đặc biệt hạn hán [134], [138] Hình 1.5 Cấu trúc đặc trưng yếu tố phiên mã NAC [122] Chú thích:Vùng liên kết DNA đầu N- có vùng phụ (A-E) Vùng điều hòa phiên mã nằm đầu C- 1.3.3 Chức yếu tố phiên mã NAC trình đáp ứng với hạn trồng Các TF NAC biết đến với vai trò điều khiển hoạt động phiên mã gen đích theo sau việc liên kết với trình tự nhận biết NAC CACG (gọi tắt 29 NACRS) vùng promoter gen [58], [121], [125] Các TF NAC tham gia vào trình sinh học khác phát triển hoa, hình thành tế bào thứ cấp phân chia tế bào, phân hóa đỉnh sinh trưởng, già đáp ứng với yếu tố bất lợi sinh học phi sinh học [7], [85], [90], [108], [120] Hiện nay, dựa thông tin biểu đầy đủ hệ gen mức độ phiên mã gen giúp cho nhà nghiên cứu phát TF NAC có tiềm tham gia vào đáp ứng với hạn hán Cụ thể, có 38 gen GmNAC [62] 19 gen CaNAC [43] biết có tham gia vào đáp ứng với hạn đậu tương đậu gà, 40 gen OsNAC đáp ứng hạn mặn lúa [34] Và gần đây, nghiên cứu [53] có 28 gen GmNAC đáp ứng với xử lý nước giống đậu tương chịu hạn (B217 H228) giống đậu tương chịu hạn tốt (Jindou 74 78) Các gen NAC đáp ứng với yếu tố bất lợi có đặc trưng biểu khác loại mô mẫu/cơ quan định, giai đoạn phát triển cụ thể, đáp ứng biểu với loại stress định; vậy, tham gia chúng vào đường truyền tín hiệu thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi phức tạp [59] Một số gen NAC tham gia vào trình đáp ứng hạn thực vật liệt kê bảng 1.4 Trong Arabidopsis, lần biết tới tăng cường biểu gen AtNACO19, AtNACO55, AtNACO72/RD26 giúp cải thiện khả chống chịu hạn chuyển gen liên kết gen NAC với trình tự MYC-like có mặt promoter gen ERD1 [121] Trong đó, chuyển gen SNAC1 phân lập từ lúa giúp chúng chống chịu tốt với stress hạn giai đoạn hoa đậu điều kiện đồng ruộng [68] Một nghiên cứu khác cho thấy, biểu gen SNAC1 tăng mạnh không bào điều kiện hạn giúp lúa chuyển gen SNAC1 giảm mức độ thoát nước nhờ q trình đóng khí khổng diễn nhanh [109] OsNAC5 30 biết đến gen đáp ứng tăng mức độ biểu điều kiện xử lý hạn, lạnh, ABA methyl jasmonate Trong đó, lúa chuyển gen OsNAC5 làm thay đổi mức độ biểu số gen đáp liên quan tới bất lợi [113] Ngoài ra, chức gen OsNAC5 đáp ứng với hạn chứng minh Arabidopsis lúa chuyển gen [112] OsNAC6/SNAC2 biết tới gen tăng mức độ biểu điều kiện xử lý lạnh, hạn, mặn ABA, đồng thời lúa chuyển gen OsNAC6 giúp cải thiện tính chịu hạn Tuy nhiên, lúa chuyển gen OsNAC6 lại gây ức chế q trình sinh trưởng làm cịi cọc nguyên nhân làm giảm suất điều kiện thường, thể đặc tính chịu hạn mặn tốt [85], [86] Trong đó, lúa tăng cường biểu gen OsNAC5, OsNAC9/SNAC1, OsNAC10 điều khiển promoter đặc hiệu rễ RCc3 giúp lúa chuyển gen cải thiện khả đáp ứng với yếu tố bất lợi [107]; đồng thời cho thấy, mật độ rễ nhiều suất cao chuyển gen điều kiện xử lý hạn [103], [107] Sự tăng cường biểu gen TaNAC2 TaNAC29 phân lập từ lúa mỳ Arabidopsis chuyển gen giúp chúng đáp ứng chống chịu với hạn, mặn lạnh tốt thông qua điều khiển biểu gen đáp ứng với bất lợi đồng thời cải thiện đặc tính sinh lý [52], [75] Một điều thú vị là, biểu gen HvSNAC1 lúa mạch khơng cải thiện tính kháng hạn mà giúp chuyển gen chống lại lây nhiễm nấm Ramularia collo-cygni, biết tới tác nhân gây bệnh đốm [79] 31 Bảng 1.4 Một số gen NAC nghiên cứu chức trình đáp ứng với hạn hán trồng Tên gen Đối tượng tìm thấy Chức liên Đối tượng quan tới hạn/bất nghiên cứu lợi khác Tài liệu tham khảo AtNACO19 AtNACO55 Arabidopsis Arabidopsis Hạn [121] SNAC1 Lúa Cây Hạn [68] SNAC1 Lúa Lúa Hạn mặn [109] OsNAC5 Lúa Lúa Hạn [112] OsNAC6 Lúa Lúa Mất nước/đa bất lợi [85] HvSNAC1 Lúa mạch Lúa mạch Hạn bệnh đốm [79] CarNAC2 Đậu gà Arabidopsis Hạn [133] CarNAC4 Đậu gà Arabidopsis Hạn mặn [134] CarNAC5 Đậu gà Arabidopsis Hạn [135] CarNAC6 Đậu gà Arabidopsis Mất nước [69] TaNAC2 Lúa mỳ Arabidopsis Hạn/đa bất lợi [75] TaNAC29 Lúa mỳ Arabidopsis Hạn mặn [52] GmNAC20 Đậu tương Arabidopsis Hạn [44] GmNAC004 Đậu tương Arabidopsis Hạn [98] GmNAC019 Đậu tương Arabidopsis Hạn [48] GmNAC109 Đậu tương Arabidopsis Hạn [89] GmSNAC49 Đậu tương Arabidopsis Hạn [111] AtNACO72/RD26 Như trình bày bảng 1.4, có nhiều cơng trình tiến hành nghiên cứu chức gen NAC đáp ứng với stress hạn đối tượng trồng khác gồm có mơ hình Arabidopsis số trồng quan trọng lúa, bông, lúa mạch Tuy nhiên, gen NAC biết có đáp ứng với 32 xử lý nước/stress hạn họ đậu có số cơng bố sâu vào nghiên cứu chức cụ thể gen đối tượng mơ hình Arabidopsis (Bảng 1.4) Kết nghiên cứu [63] ra, có 38 gen GmNAC đáp ứng ứng với xử lý nước tổng số 152 thành viên NAC đậu tương Từ việc phát gen GmNAC có đáp ứng với xử lý nước đậu tương, số nghiên cứu làm rõ chức cụ thể vài gen GmNAC tiềm trình đáp ứng với stress hạn đối tượng mơ hình Arabidopsis Cụ thể, nghiên cứu chức gen GmNAC20 mô hình Arabidopsis cho thấy, gen đóng vai trị quan trọng việc điều khiển hình thành rễ bên Arabidopsis chuyển gen; từ đó, giúp cho chuyển gen tăng khả chống chịu tốt điều kiện thiếu nước so với đối chứng khơng chuyển gen [44] Cùng với đó, Arabidopsis chuyển gen GmNAC004 cho thấy số lượng rễ bên nhiều điều kiện bình thường đồng thời giúp trì nhiều rễ bên điều kiện xử lý hạn so với đối chứng không chuyển gen [98] Một số kết nghiên cứu gần ra, có mặt gen GmNAC109 Arabidopsis chuyển gen giúp chúng cải thiện mật độ rễ bên đồng thời làm tăng khả chống chịu stress phi sinh học có hạn hán thơng qua đường phụ thuộc ABA [88], [132] Ngoài ra, biểu GmNAC49 Arabidopsis làm chuyển gen tăng cường đáp ứng với hạn tốt so với đối chứng không chuyển gen [111] Điều đặc biệt ý là, số 38 gen GmNAC đáp ứng với điều kiện stress nước đậu tương này, gen GmNAC085 có đáp ứng mạnh với nước rễ chồi cho thấy tiềm ứng dụng gen cải tiến trồng tăng cường khả chịu hạn [63].Tuy nhiên, chưa có cơng trình khoa học nghiên cứu làm rõ chức cụ thể gen GmNAC085 trình đáp ứng với stress hạn đối tượng mô hình 33 Arabidopsis hay trồng quan trọng khác Trong đó, đối tượng đậu gà, nghiên cứu [95] lần đầu gen CarNAC3 tham gia vào trình sinh trưởng phát triển khác đậu gà trình đáp ứng với stresshạn; từ đó, cho thấy TF NAC đóng vai trị quan trọng q trình đáp ứng với hạn đậu gà Tiếp theo, nghiên cứu [43] đánh giá, phân tích trình tự đầy đủ tồn 71 thành viênTF NAC đậu gà kiểm tra mức độ phiên mã gen CaNAC phát có 19 gen CaNAC đáp ứng với stress nước rễ/lá đậu gà Hashem, từ có số nghiên cứu chức gen CaNAC đối tượng mơ hình Arabidopsis (Bảng 1.4) Cụ thể, biểu CarNAC2 Arabidopsis chuyển gen làm tăng cường khả chịu hạn chúng Ngoài ra, Arabidopsis chuyển gen CarNAC2 cho thấy làm trì hỗn nảy mầm hạt thời gian hoa so với đối chứng [133] Nghiên cứu [134] cho thấy, biểu mức CarNAC4 Arabidopsis làm cải thiện khả chịu hạn nồng độ muối cao thơng qua việc trì nước tốt hơn, hàm lượng MDA tích lũy proline nhiều chuyển gen so với đối chứng Ngồi ra, có mặt CarNAC04 làm tăng cường biểu gen đáp ứng với bất lợi RD29A, ERD10, COR15A, COR47, KIN1 DREB2A điều kiện thiếu nước nồng độ muối cao [134] Một nghiên cứu khác [135] rằng, biểu mức gen CarNAC5 làm tăng cường khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen thơng qua việc tăng cường điều hịa biểu số gen đáp ứng với bất lợi phi sinh học thay đổi số tiêu sinh lý so với đối chứng không chuyển gen Trong khi, biểu mức CarNAC6 Arabidopsis chuyển gen làm chúng nhạy cảm với ABA giai đoạn sinh trưởng rễ đồng thời giúp tăng cường khả chịu hạn so với không chuyển gen [69] Các 34 nghiên cứu cho thấy, gen hoạt động TF NAC đáp ứng với stress hạn đậu gà cho thấy tiềm ứng dụng cải tiến giống trồng chống chịu hạn 1.4 Vai trò họ đậu Cây họ đậu (thuộc họ Fabaceae Leguminosae) họ thực vật có hoa chiếm số lượng lớn thứ sau họ cúc họ lan, với từ 670 – 750 chi 18000 – 19000 loài Các họ đậu chia thành loại ngũ cốc lấy hạt, lấy lâm nghiệp Chúng biết đến trồng nhằm phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ người, làm thức ăn cho gia súc, sử dụng làm bột giấy, gỗ nhiên liệu, gỗ, sản xuất dầu, nguồn hóa chất dược phẩm, trồng làm cảnh, làm làm phân xanh tăng cường cho đất Ngoài ra, họ đậu đáng ý chỗ hầu hết chúng có quan hệ mật thiết với nhiều lồi vi khuẩn nốt sần rễ để cố định đạm cộng sinh Vì lý đó, họ đậu đóng vai trị quan trọng ln canh trồng [77] Trong số trồng họ đậu lấy hạt đậu tương đậu gà đóng vai trị vơ quan trọng nơng nghiệp tồn cầu 1.4.1 Vai trị đậu tương Đậu tương (Glycine max L.) loài họ đậu có nguồn gốc từ Đơng Á trồng nhiều giới biết tới trồng nơng nghiệp quan trọng giới, đóng góp 25% sản lượng dầu thực vật tồn cầu, khoảng 2/3 lượng protein tập trung cho thức ăn chăn nuôi, phần giá trị phần thức ăn cho người Ngồi ra, đậu tương có chứa lượng đáng kể tất axit amin thiết yếu cho người [4], [16] Cụ thể, hạt đậu tương khô chứa 36% protein, 19% dầu, 35% carbon hydrate, 5% khoáng chất số thành phần khác bao gồm loại vitamin, isoflavone saponin Hơn nữa, đậu tương nguyên chất nguồn cung chấp canxi, sắt, kẽm, phốt 35 pho, magiê, thiamine, riboflavin, niacin, axit folic [16] Theo báo cáo tổ chức dịch vụ thương mại tồn cầu vịng năm trở lại từ 2013 – 2018, Mỹ quốc gia có sản lượng đậu tương lớn giới với 123,7 triệu tấn, theo sau Brazil, Argentina, Trung Quốc (Bảng 1.5) Hiện nay, sản lượng đậu tương giới lớn trồng hạt lấy dầu khác, chiếm khoảng 68% sản lượng họ đậu 57% sản lượng hạt có dầu giới [32] Bảng 1.5 Sản lượng đậu tương theo năm giới (triệu tấn) Năm 2018 2017 2016 2015 2014 Mỹ 123,7 120,1 116,9 107,0 106,9 Brazil 117,9 114,7 96,4 97,5 86,8 Argentina 37,8 55,0 58,8 61,4 53,4 Trung Quốc 14,2 13,1 12,8 11,8 12,2 Ấn Độ 13,8 11,0 13,2 8,6 10,4 Paraguay 11,0 10,5 9,2 8,9 10,0 Canada 7,3 7,7 6,6 6,5 6,0 Liên minh Châu Âu 2,8 2,7 2,5 2,4 1,9 348,7 353,0 335,6 323,3 306,3 Thế giới Nguồn: [32] Trong đó, Việt Nam, đậu tương thực phẩm có truyền thống lâu đời, quan trọng, cung cấp protein chủ yếu cho người, thành phần thiếu bữa ăn truyền thống đại người; chiếm vị trí quan trọng cấu trúc trồng nơng nghiệp tồn quốc [114] Tuy nhiên, 36 năm gần sản lượng đậu tương Việt Nam tiếp tục giảm xuống mức nhu cầu thực phẩm, thức ăn ngành công nghiệp dầu thực vật (Bảng 1.6) Theo số liệu thống kê năm 2018, Việt Nam phải nhập 1,576 triệu đậu tương; Mỹ quốc gia đứng đầu lượng đậu tương Việt Nam nhập [38] Hiện tại, Chính phủ Việt Nam có chiến lược quy hoạch tổng thể ưu tiên phát triển loại hạt có dầu với mục tiêu 350 nghìn đất trồng đậu tương sản lượng 700 nghìn vào năm 2020 Tuy nhiên, hạn hán ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng phát triển đậu tương, dẫn đến cản trở việc mở rộng diện tích sản xuất trồng theo dự kiến [116] Bảng 1.6 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam năm gần Diện tích gieo trồng Năng suất Sản lượng (Nghìn ha) (Tấn/ha) (Nghìn tấn) 2011 181,1 1,47 266,9 2012 120,8 1,45 175,3 2013 180 1,5 270 2014 200 1,5 300 2015 100,8 1,45 146,4 2016 94 1,57 147,5 2017 100 1,57 157 2018 105 1,6 168 Năm Nguồn:[38] 1.4.2 Vai trò đậu gà Đậu gà (Cicer arietinum L.) trồng họ đậu quan trọng trồng để lấy hạt ăn lưu vực Địa Trung Hải, Châu Á, châu Úc Cây đậu gà 37 phát triển nhanh, phân nhánh đạt chiều cao từ 20 – 60 cm, chí lên tới m Cây có rễ cọc ăn sâu tới m nhiều rễ bên Thân có lơng, có nhiều nhánh, dài cm từ 10 – 20 chét, hình trứng elip Hoa đậu gà có màu trắng, hồng, tím xanh Hạt có kích thước thay đổi từ – 10 mm, hình dạng hạt từ cầu đến góc cạnh, màu trắng đến đen Cây đậu gà loài trồng số 43 loài thuộc chi Cicer Đậu gà chia làm nhóm Desi Kabuli Đậu gà Desi dạng bụi rậm với hoa tương đối nhỏ, có chứa sắc tố anthocyanin thân hoa màu xanh tím trồng chủ yếu Nam Á Ethiopia Hạt đậu gà Desi nhỏ, màu đậm, trơn nhăn Trong đó, nhóm đậu gà Kabuli hạt to, vỏ mỏng có màu vàng nhạt, trồng chủ yếu vùng Địa Trung Hải sử dụng làm thức ăn cho người Các loại Kabuli thường cứng cáp, phân nhánh hơn, hoa màu trắng [39], [56], [76] Cây đậu gà biết tới trồng họ đậu có vai trị việc cải tạo đất có khả cố định đạm rễ, đặc biệt vùng mưa nhiều hay khô hạn [56] Mặt khác, hạt đậu gà cịn đóng vai trị vô quan trọng vừa làm thực phẩm cho người làm thức ăn chăn nuôi hàm lượng protein cao khoảng 17 – 31% hoạt tính sinh học dao động từ 52 – 78% Các amino acid thiết yếu leucine, isoleucine, lysine, valine phenylalanine có mặt với số lượng đáng kể hạt [76] Hiện nay, đậu gà trồng 50 quốc gia thuộc tiểu lục địa Ấn độ, Bắc Phi, Trung Đông, Nam Âu, châu Mỹ Úc [39] Trong giai đoạn 2018, diện tích sản xuất đậu gà tồn cầu khoảng 17,8 triệu ha, đạt sản lượng 17,2 triệu suất trung bình 9,6 tấn/ha Trong đó, Ấn Độ nước sản xuất đậu gà lớn giới với sản lượng 11,3 triệu giai đoạn 2018, chiếm 65,7% sản lượng đậu gà toàn cầu Các quốc gia sản xuất đậu gà lớn khác bao gồm Úc, Pakistan, Nga, Thổ Nhĩ Kỳ, Iran, Myanmar, Mỹ Ethiopia [32] 38 Bảng 1.7 Tình hình sản suất đậu gà giới năm 2018 Diện tích Sản lượng Năng suất (triệu ha) (triệu tấn) (tấn/ha) Ấn Độ 11,9 11,3 9,6 Úc 1,1 1,0 9,3 Pakistan 1,0 0,3 3,3 Nga 0,8 0,6 7,6 Thổ Nhĩ Kỳ 0,5 0,6 12,3 Iran 0,5 0,2 4,4 Myanmar 0,4 0,5 13,8 Mỹ 0,3 0,6 16,9 Ethiopia 0,2 0,5 21,4 Thế giới 17,8 17,2 9,6 Nước Nguồn: [32] Trong đó, Việt Nam chưa có ghi nhận số liệu thống kê diện tích trồng đậu gà nước; nhiên thị trường có bán loại sản phẩm nhập dạng thô chế biến từ hạt đậu gà Qua cho thấy, giá trị mặt thực phẩm kinh tế đậu gà người tiêu dùng Việt Nam biết đến 1.4.3 Ảnh hưởng hạn tới đậu tương đậu gà Nhìn chung, ảnh hưởng hạn hán đến họ đậu phức tạp 39 xảy suốt q trình sinh trưởng phát triển (Hình 1.6) Những ảnh hưởng hạn hán xác định dựa thơng số định tính định lượng bao gồm mầm hạt, phát triển hạt, tiêu sinh lý, sinh hóa, điều hịa thẩm thấu, loại phản ứng oxy hóa, hàm lượng chất chống oxy hóa, điều hịa biểu phân tử gen, hấp thu dinh dưỡng, hình thành nốt sần, yếu tố cấu thành suất suất [35], [76], [83] Hình 1.6 Một số ảnh hưởng hạn tới họ đậu Các loại họ đậu có mức độ nhạy cảm với hạn hán khác nhau, trường hợp dẫn tới làm giảm suất cuối Sự giảm suất hạt họ đậu gây hạn hán có liên quan tới già hóa lá, phá hủy máy quang hợp phản ứng oxy hóa, giảm cố định carbon, ức chế hoa giai đoạn sinh sản, bất hoạt hạt phấn, giảm khả lấp đầy hạt [35], [76], [83] Do biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán trở thành yếu tố khó kiểm sốt khơng lường trước được, liên tục ảnh hưởng tới sản xuất trồng có tác động bất lợi họ đậu Các 40 nghiên cứu cho thấy điều kiện hạn hán nghiêm trọng làm xáo trộn hình thái thực vật, sinh lý, giai đoạn sinh trưởng, độ ẩm đóng vai trị thiết yếu hoạt động enzyme trình nảy mầm giúp làm sáng tỏ nhạy cảm hạn hán giai đoạn nảy mầm Giai đoạn nảy mầm sinh sản nhạy cảm với thiếu nước Trong điều kiện hạn, tỷ lệ nảy mầm đậu tương đậu gà bị giảm đáng kể [23] Quang hợp biết tới trình chịu trách nhiệm cho tăng trưởng phát triển thực vật nói chung họ đậu nói riêng bị ảnh hưởng yếu tốt môi trường bất lợi khác Cường độ, tốc độ thời gian stress ảnh hưởng tới phản ứng trồng tình trạng thiếu nước Stress hạn ảnh hưởng tới máy quang hợp cuối làm giảm suất họ đậu tùy thuộc vào tần suất mức độ stress Nghiên cứu [90] quan sát thấy, tốc độ quang hợp, độ dẫn khí khổng tốc độ thoát nước giảm đáng kể đậu tương điều kiện hạn Một nghiên cứu gần ra, suy giảm quang hợp đậu tương bị stress hạn, điều gây giảm tích luỹ chất khơ tốc độ tạo hạt dẫn tới làm giảm suất trực tiếp [126] Tương tự vậy, stress hạn cho ảnh hưởng đến hàm lượng chất diệp lục, huỳnh quang diệp lục trình quang hợp đậu gà [70] Hơn nữa, kiểm sốt khí khổng coi yếu tố sinh lý để tối ưu hóa việc sử dụng nước điều kiện hạn, ngăn ngừa nước mức điều kiện hạn kéo dài Nghiên cứu [22] quan sát thấy suy giảm tốc độ quang hợp, tốc độ nước độ dẫn khí khổng đậu tương gặp điều kiện hạn hán tương ứng 78,4%, 85,4% 92%; đó, độ dẫn khí khổng có liên quan tới tốc độ nước nhiều so với tốc độ quang hợp Một nghiên cứu khác cho thấy, suy giảm tốc độ thoát nước đậu tương bị stress hạn liên quan tới suy giảm 41 độ dẫn khí khổng thơng qua tích lũy ABA rễ [71] Trong vòng đời họ đậu, giai đoạn hoa hình thành hạt dễ bị ảnh hưởng thiếu hụt nước Stress hạn ảnh hưởng đến thời gian hoa, phát triển hoa dẫn đến bất hoạt hạt phấn thông qua việc làm giảm phát triển ống phấn nảy mầm hạt phấn Hơn nữa, stress hạn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả hình thành hoa, hạt; dẫn đến giảm suất cuối họ đậu Được biết, hạn hán làm giảm 92,7% số đậu tương bị stress giai đoạn bắt đầu hình thành quả; đó, bị stress giai đoạn kéo dài mức giảm 81,6% so với đối chứng [83] Bảng 1.8 Ảnh hưởng hạn hán đến số giai đoạn đậu tương đậu gà Đối tượng họ đậu Đậu tương Đậu gà Giai đoạn Giảm suất (%) Giai đoạn hình thành 73-82 Giai đoạn sinh sản 46-71 Giai đoạn làm đầy hạt 42 Giai đoạn sinh sản 45-69 Giai đoạn chín 49-54 Giai đoạn thụ phấn 27-40 Nguồn: [35], [83] Ngoài ra, hạn hán ảnh hưởng tới số lượng hạt đậu tương Cụ thể, đậu tương bị stress hạn giai đoạn hoa số lượng hạt cho giảm nhiều [83] Nghiên cứu [57] cho rằng, stress hạn xuất giai đoạn hình thành hoa dẫn đến thời gian hoa ngắn tạo hoa, 42 đó, số lượng hạt Bảng 1.8 cho thấy, suất cuối đậu tương đậu gà bị ảnh hưởng nhiều hay stress hạn tùy thuộc vào giai đoạn mà gặp hạn Tuy nhiên, stress hạn xảy giai đoạn hình thành nguyên nhân làm giảm suất đậu tương nhiều nhất, lên tới 73 – 82% 1.5 Cải thiện khả chống chịu hạn họ đậu sử dụng kỹ thuật chuyển gen Để cải thiện khả chống chịu hạn đồng thời trì suất ổn định trồng họ đậu nói riêng trồng nơng nghiệp quan trọng khác nói chung, việc phát triển đồng thời giống chịu hạn sử dụng nguồn nước hiệu biết tới chiến lược vô quan trọng Cùng với phát triển tiến khoa học công nghệ năm gần đây, kết hợp phương pháp chọn giống truyền thống với kỹ thuật đại sử dụng thị phân tử cơng nghệ sinh học có ý nghĩa to lớn công tác cải thiện khả chống chịu với hạn hán họ đậu [83] Trong đó, kỹ thuật chuyển gen thực vật xuất cách tiếp cận có giá trị để hiểu toàn diện chế kháng hạn phức tạp coi phương pháp bổ sung hữu ích để tạo trồng chuyển gen mong muốn Hơn nữa, phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học thời gian gần cho phép xác định gen cụ thể đáp ứng lại yếu tố bất lợi phi sinh học từ lồi chí từ lồi khác để chuyển vào trồng để làm thay đổi cấu trúc di truyền chúng; đồng thời giúp chúng chống chịu lại điều kiện hạn hán khắc nghiệt Các họ đậu chuyển gen thực theo số phương pháp trực tiếp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Trong nghiên cứu trước cho thấy, gen mục tiêu chuyển vào thực vật làm cải thiện hiệu suất trồng điều kiện hạn hán mà có tác động tiêu cực đến suất 43 đưa vào gen khác [102] Bảng 1.9 Một số gen ứng viên chuyển vào họ đậu nhằm tăng cường khả chịu hạn Đối tượng họ đậu Đậu tương Gen chuyển Chức GmDREB2 Tăng cường khả chịu hạn AtABF3 Cải thiện khả chịu hạn GmFDL19 Tăng cường khả chịu hạn GmSK1 Tăng cường khả chịu hạn GmNAC, Yếu tố phiên mã GmDREB, GmZIP, ERF089 DREB1A, RD29A Yếu tố phiên mã GmCaM4 Tăng mức độ biểu số gen đáp ứng với hạn Đậu gà Aquaporins Tăng cường khả chịu hạn DREB2A Yếu tố phiên mã MYB, WRKY, Yếu tố phiên mã bZIP AP2/ERF, XPB1 Yếu tố phiên mã Nguồn: [83] Các họ đậu chuyển gen chủ yếu đơn gen (Bảng 1.9), chúng thuờng gen mã hóa cho enzyme liên quan đến biến đổi lipid màng sinh tổng hợp chất thẩm thấu, protein tạo phôi muộn, 44 TF tham gia vào trình điều hòa biểu gen đáp ứng với hạn Cụ thể, việc chuyển gen P5CSF129A liên quan tới điều hòa thẩm thấu vào đậu gà làm tăng tổng hợp proline đồng thời giảm hàm lượng malondiadehyde (MDA) giảm việc sản sinh sản phẩm gốc tự do, khơng có gia tăng đáng kể tích lũy sinh khối [27] Trong khi, số gen thuộc họ TF AP2/ERF DREB đóng vai trị thiếu sinh trưởng phát triển cây, coi then chốt việc ứng phó với yếu tố mơi trường bất lợi phức tạp Sự biểu mức gen DREB1A điều khiển promoter Arabidopsis RD29A đậu gà chuyển gen cho thấy gia tăng biểu gen DREB1A điều kiện xử hạn so với điều kiện thường, chuyển gen RD29A:DREB1A có khả đáp ứng với hạn tốt so với đối chứng không chuyển gen thông qua điều hịa hấp thụ nước, đóng khí khổng, nước cấu trúc rễ [19] Một nghiên cứu khác biểu mức gen LOSS/ABA3 đậu tương chuyển gen làm tăng cường khả chịu hạn chúng thông qua việc tăng cường tích lũy ABA, kích hoạt biểu số gen đáp ứng với nước gây loạt phản ứng kháng sinh lý sinh hóa [65] Trong Việt Nam, để đối phó với tình trạng hạn hán biến đổi khí hậu gây ra, ngồi việc áp dụng biện pháp canh tác, sử dụng nước hợp lý giống trồng có khả chống chịu hạn chọn tạo truyền thống hướng nghiên cứu chọn tạo giống trồng sửa đổi yếu tố di truyền thông qua chuyển gen nhà khoa học nước quan tâm Gần thập kỷ qua, có nhiều kết nghiên cứu cho thấy việc tạo giống trồng quan trọng lúa, ngô, đậu tương, có tiềm chịu hạn kỹ thuật chuyển gen có ý nghĩa vơ to lớn nông nghiệp Việt Nam Cụ thể, theo kết cơng bố từ nhóm nghiên cứu GS.TS Phạm Xuân Hội cho thấy gen thuộc yếu tố phiên mã DREB1A DREB2A có tiềm 45 việc chọn tạo giống lúa có khả chống chịu với điều kiện bất lợi, có hạn [1], [6] Trong đó, nhóm nghiên cứu TS Trần Thị Cúc Hòa, nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương mang gen DREB1A có khả chống chịu hạn [14], [15] Hơn nữa, nghiên cứu [9] phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan tới tính chịu hạn đồng thời chuyển thành công gen vào đậu tương Việt Nam Ngồi ra, nhóm nghiên cứu PGS.TS Nguyễn Văn Đồng chuyển nạp thành công gen ZmNFYB2, ZmNAC1 GmMYB thuộc họ TF NF-Y, NAC MYB vào ngô đậu tương, biết gen có tham gia vào q trình đáp ứng với hạn trồng [10], [11], [12], [13] 46 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu thực vật Một số vật liệu thực vật sử dụng nghiên cứu bao gồm: Hạt giống đậu tương mơ hình Williams 82, hạt giống mơ hình Arabidopsis thaliana Col0, hạt giống đậu gà chịu hạn Hashem chịu hạn tốt ILC482 nhận từ Trung tâm Quốc tế Nghiên cứu Nông nghiệp vùng khô hạn, Syria lưu giữ Nhóm nghiên cứu đáp ứng với yếu tố bất lợi thuộc Trung tâm Khoa học Tài nguyên bền vững RIKEN, Nhật Bản 2.1.2 Các chủng khuẩn, nấm men vector Các chủng khuẩn Escherichia coli DH5α, Agrobacteria tumefaciences GV3101, chủng nấm men AH109, vector tách dòng pKS, vector biểu nấm men pGBKT7 vector biểu thực vật pGKX lưu giữ Nhóm nghiên cứu đáp ứng với yếu tố bất lợi thuộc Trung tâm Khoa học Tài nguyên bền vững RIKEN, Nhật Bản 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng cho PCR qRT-PCR Các cặp mồi sử dụng cho PCR qRT-PCR thiết kế dựa phần mềm Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) trích dẫn từ cơng trình nghiên cứu trước [43] Trình tự mồi trình bày Bảng phụ lục 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2.1 Thời gian nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu luận án thực từ tháng 4/2015 đến tháng 12/2018 47 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu luận án thực Nhóm nghiên cứu đáp ứng với bất lợi thuộc Trung tâm Khoa học Tài nguyên bền vững RIKEN, Nhật Bản; phần nhỏ tiến hành Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Việt Nam 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Trồng xử lý đậu tương Hạt giống đậu tương Wiliams 82 trồng chậu lít có chứa đất, dinh dưỡng tưới nước đầy đủ điều kiện nhà kính với cường độ chiếu sáng 80 µmol m-2 s-1, độ ẩm phịng trì 60% nhiệt độ 30 oC Cây đậu tương 12 ngày tuổi tiến hành xử lý nước giấy thấm phịng thí nghiệm Sau 10 xử lý nước, chồi xử lý nước thu cho vào nitơ lỏng bảo quản tủ -80 oC để sử dụng cho tách chiết RNA nhân dòng gen GmNAC085 theo phương pháp mơ tả trước [63] 2.3.2 Tách chiết, tinh RNA tổng hợp cDNA cho tách dòng gen GmNAC085 RNA tổng số tách chiết từ chồi đậu tương Willams 82 xử lý nước thời điểm 10 sử dụng hóa chất TRIZOL theo hướng dẫn nhà sản xuất (Invitrogen, Nhật Bản) Tiếp theo, RNA tổng số xử lý để loại bỏ DNA kít DnaseI (Turbo, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau đó, RNA tổng số xử lý loại bỏ DNA sử dụng để tổng hợp cDNA sợi đơn theo hướng dẫn kít SuperScriptTM III first-strand synthesis system for RT-PCR (Invitrogen, Nhật Bản) Sản phẩm cDNA sau lưu giữ tủ -20 oC 48 2.3.3 Thiết kế cấu trúc vector phân tích khả hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men Vùng điều hòa phiên mã (TRR) đầu C- từ trình tự amino acid 165 – 341 GmNAC085 khuếch đại PCR với cặp mồi GmNAC085FNdeI/GmNAC085R-PstI (Phụ lục bảng 1) sử dụng kít PCR KOD -Plus- Neo (Toyobo, Nhật Bản) có khả đọc sửa q trình PCR từ 1µl cDNA sợi đơn tổng hợp theo chu trình: Biến tính 94 oC, phút; 35 chu kỳ (biến tính 98 oC, 10 giây; gắn mồi 55 oC, 30 giây; kéo dài 68 oC, 60 giây); kéo dài 72 oC, 60 giây; giữ 15 oC, ∞ Sản phẩm PCR vùng TRR GmNAC085 điện di gel agarose 1%; sau đó, sản phẩm điện di tinh sử dụng kít FastGene Gel/PCR Extraction (Nippon Genetics Co.,Ltd, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh chèn vào vector pKS (Phụ lục hình 1) cắt vị trí enzyme giới hạn EcoRV sử dụng kít Ligation high Ver.2 (Toyobo Co., Ltd, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm nối vector pKS đoạn TRR biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Dịch khuẩn cấy trải đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh ampicillin (50 mg/L) ni qua đêm 37 oC Một vài khuẩn lạc mọc đĩa mơi trường LB có chứa kháng sinh ampicillin nuôi tăng sinh khối môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin (50 mg/L) qua đêm 37 oC để tách chiết tinh DNA plasmid sử dụng kít QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Nhật Bản) DNA plasmid tinh gửi giải trình tự sử dụng cặp mồi T3/T7 (Phụ lục bảng 1) Tiếp theo, DNA plasmid cắt enzyme giới hạn NdeI PstI (Takara, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất để kiểm tra việc thu nhận đoạn TRR GmNAC085 phục vụ cho việc gắn vào vector pGBKT7 Đoạn TRR GmNAC085 có trình tự xác cắt từ vector tách dòng 49 pKS gắn vào vector pGBKT7 (Clontech Laboratories, California, Mỹ) (Phụ lục hình 2) cắt enzyme giới hạn NdeI PstI sử dụng kít Ligation high Ver.2 (Toyobo Co., Ltd, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm nối vector pGBKT7 đoạn TRR tiếp tục biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Dịch khuẩn cấy trải đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh kanamycin (50 mg/L) nuôi qua đêm 37 oC Khuẩn lạc mọc đĩa mơi trường LB có chứa kháng sinh kanmycin kiểm tra trực tiếp PCR từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu GmNAC085F-NdeI/GmNAC085R-PstI (Phụ lục bảng 1) cho đoạn TRR sử dụng kít SapphireAmp Fast PCR Master Mix (Takara, Nhật Bản) theo chu trình: Biến tính 94 oC, phút; 30 chu kỳ (biến tính 98 oC, giây; gắn mồi 55 oC, giây; kéo dài 72 oC, 10 giây); kéo dài 72 oC, 10 phút; giữ 15 oC, ∞ Sản phẩm PCR sau kiểm tra điện di gel agarose 1% Tiếp theo, cấu trúc vector tái tổ hợp pGBKT7:TRR vector trống pGBKT7 biến nạp vào chủng nấm men AH109 Để phân tích hoạt động phiên mã vùng TRR GmNAC085, chủng nấm men biến nạp nuôi cấy đĩa môi trường SD/-Trp SD/-Trp/-His/-Ade 30 oC ngày để đánh giá khả sinh trưởng nấm men; đó, chủng nấm men mọc đĩa SD/-Trp ngày sử dụng cho phân tích khả hoạt hóa βgalactosidase theo quy trình cung cấp hãng Clontech Laboratories, California, Mỹ 2.3.4 Thiết kế cấu trúc vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 2.3.4.1 Tách dịng cDNA gen mã hóa yếu tố phiên mã GmNAC085 Trình tự DNA có kích thước 1023 bp mã hóa đầy đủ cho gen GmNAC085 khuếch đại từ khuôn cDNA sợi đơn có kích thước 1612 bp tổng hợp trước giống đậu tương Williams 82 kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc 50 hiệu GmNAC085F-NotI/GmNAC085R-XhoI (Phụ lục bảng 1) sử dụng kít PCR KOD -Plus- Neo (Toyobo, Nhật Bản) có khả đọc sửa trình PCR theo chu trình: Biến tính 94 oC, phút; 35 chu kỳ (biến tính 98 oC, 10 giây; gắn mồi 58 oC, 30 giây; kéo dài 68 oC, 60 giây); kéo dài 72 oC, 60 giây; giữ 15 oC, ∞ Sản phẩm PCR đoạn gen GmNAC085 điện di gel agarose 1%, sau tinh từ gel sử dụng kít FastGene Gel/PCR Extraction (Nippon Genetics Co.,Ltd, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất Đoạn gen GmNAC085 tinh gắn vào vector pKS (Phụ lục hình 1) cắt vị trí enzyme giới hạn EcoRV sử dụng kít Ligation high Ver.2 (Toyobo Co., Ltd, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất Tiếp theo, sản phẩm nối vector tách dòng pKS đoạn gen GmNAC085 biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Dịch khuẩn tái tổ hợp cấy trải đĩa LB có chứa kháng sinh ampicillin (50 mg/L) ni qua đêm 37 oC Khuẩn lạc mọc đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh ampicillin kiểm tra PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu GmNAC085F-NotI/GmNAC085R-XhoI (Phụ lục bảng 1) cho gen GmNAC085 sử dụng kít SapphireAmp Fast PCR Master Mix (Takara, Nhật Bản) theo chu trình: Biến tính 94 oC, phút; 30 chu kỳ (biến tính 98 oC, 10 giây; gắn mồi 58 oC, 30 giây; kéo dài 72 oC, 60 giây); kéo dài 72 oC, 10 phút; giữ 15 oC, ∞ Sau đó, sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Khuẩn lạc PCR dương tính ni tăng sinh khối mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin (50 mg/L) qua đêm 37 oC để tách chiết tinh DNA plasmid sử dụng kít QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Nhật Bản) phục vụ cho giải trình tự cặp mồi T3/T7 (Phụ lục bảng 1) 2.3.4.2 Thiết kế vector biểu mang gen GmNAC085 Đoạn gen GmNAC085 có trình tự xác sử dụng để chuyển vào vector biểu pGKX (Phụ lục hình 3) điều khiển promoter CaMV 51 35S [96] Cụ thể, vector biểu pGKX đoạn GmNAC085 vector tách dòng pKS:GmNAC085 cắt enzyme giới hạn NotI XhoI Sản phẩm cắt gen GmNAC085 sau gắn vào vector biểu pGKX sử dụng Ligation high Ver.2 (Toyobo, Nhật Bản) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau đó, vector tái tổ hợp pGKX:35S:GmNAC085 biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt ni chọn lọc mơi trường LB có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/L) 37 oC qua đêm Các khuẩn lạc mọc môi trường LB có chứa kháng sinh chọn lọc lựa chọn để kiểm tra PCR với cặp mồi 35Spro-F/GmNAC085R-XhoI (Phụ lục bảng 1) sử dụng kít SapphireAmp Fast PCR Master Mix (Takara, Nhật Bản) theo chu trình trình bày trước mục 2.3.4.1 Khuẩn lạc cho kết dương tính lựa chọn để nuôi tăng sinh khối, tách chiết thu nhận DNA plasmid để kiểm tra giải trình tự Sau đó, vector tái tổ hợp pGKX:35S:GmNAC085 chứa trình tự xác gen GmNAC085 biến nạp vào chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens GV3101 phương pháp xung điện Khuẩn biến nạp nuôi cấy môi trường YEB có bổ sung rifampicin (30 mg/L) kanamycin (50 mg/L) 28 oC ngày Các khuẩn lạc dương tính với PCR sử dụng cặp mồi 35Spro-F/GmNAC085R-XhoI lựa chọn lưu giữ sử dụng cho biến nạp vào Arabidopsis 2.3.5 Phương pháp biến nạp sàng lọc Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 Cấu trúc 35S:GmNAC085 biến nạp vào Arabidopsis Col-0 phương pháp nhúng hoa dịch khuẩn lây nhiễm (sử dụng chủng khuẩn A tumefaciens GV3101) [29] dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 ban đầu sàng lọc phân tích phân ly tính trạng theo định luật Mendel từ hệ T2 đĩa mơi trường GM có bổ sung kháng sinh kanamycin (30 mg/L) dựa vào phương pháp mô tả trước [119], để lựa chọn dịng 52 đồng hợp tử riêng biệt mang gen chuyển GmNAC085 Phân tích phân ly tính trạng dòng chuyển gen tiến hành qua hệ liên tiếp 2.3.6 Phương pháp phân tích chuyển gen 35S:GmNAC085 kỹ thuật lai southern blot Hai dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 kí hiệu OE1 OE2 dự đoán mang gen GmNAC085 dựa vào kết phân tích tỷ lệ phân ly mơi trường có kháng sinh chọn lọc tiếp tục kiểm tra kỹ thuật lai southern blot với đối chứng (WT) Cụ thể, hạt WT, OE1 OE2 gieo đĩa môi trường GM (2 % đường, 0.6 % agar) nuôi tủ nuôi với cường độ chiếu sáng 73 µmol m-2 s-1 với chu kỳ 16 sáng/8 tối 23 oC 14 ngày Lá WT, OE1 OE2 14 ngày tuổi thu để tách chiết DNA tổng số sử dụng theo hướng dẫn kít i-genomic Plant DNA Extraction Mini (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) DNA tổng số 35S:GmNAC085 OE1, OE2 WT cắt enzyme giới hạn EcoRI Sản phẩm cắt enzyme giới hạn với vector plasmid 35S:GmNAC085 điện di gel agarose 1% với hiệu điện 25V qua đêm Sản phẩm điện di chuyển lên màng nylon đệm 20X SSC Sau đó, màng nylon lai với đầu dị (là sản phẩm PCR gen GmNAC085 với cặp mồi GmNAC085F-NotI/GmNAC085R-XhoI (Phụ lục bảng 1) để xác định số gen chuyển theo hướng dẫn kít DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche, Đức) 2.3.7 Đánh giá khả sinh trưởng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện thường Để đánh giá khả sinh trưởng phát triển Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2, hạt WT, OE1 OE2 53 gieo trực tiếp cốc nhựa (5 hạt/kiểu gen/cốc, với kích thước đường kính x chiều cao: 10 x cm) có chứa đất (Dio Propagation Mix No.2 for Professional, Dio Chemicals, Tokyo, Nhật Bản), 18 ngày tuổi sau gieo tỉa bớt xuống cây/cốc Các trì chăm sóc phịng ni (nhiệt độ 23 oC, chu kỳ 16 sáng/8 tối, cường độ chiếu sáng 76.6 µmol m-2 s-1), dinh dưỡng (0.1% Hyponex; Osaka, Japan) cung cấp cho tuần lần tuần đầu Bán kính rosette lớn đo thời điểm 18 ngày tuổi Trong đó, chiều cao ghi nhận 50 ngày tuổi Phần mềm Image-J (https://imagej.nih.gov/ij/) sử dụng để đo bán kính chiều cao Sau đó, trọng lượng hạt riêng biệt cân để tính suất trung bình Để phân tích chiều dài rễ chính, hạt WT, OE1 OE2 gieo thẳng đứng đĩa môi trường GM (2 % đường, 1.2 % agar) nuôi tủ ni với cường độ chiếu sáng 73 µmol m-2 s-1 với chu kỳ 16 sáng/8 tối 23 oC ngày Sau đó, hạt nảy mầm có kích thước chiều dài rễ chuyển sang đĩa môi trường GM (2 % đường, 1.2 % agar) tiếp tục nuôi sinh trưởng theo chiều thẳng đứng thêm ngày điều kiện ni cấy Chiều dài rễ WT, OE1 OE2 10 ngày tuổi đo phần mềm Image-J 2.3.8 Phương pháp đo hàm lượng diệp lục Lá WT, OE1 OE2 10 ngày tuổi trồng mô trả phương pháp phân tích chiều dài rễ mục 2.3.5 sử dụng để đo hàm lượng diệp lục theo phương pháp [20] 2.3.9 Đánh giá khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn Để đánh giá chức GmNAC085 trình đáp ứng với hạn 54 hán, phương pháp đánh giá hạn khay (đánh giá tỷ lệ sống sót điều kiện xử lý hạn) [89], phương pháp cân trọng lượng cốc (đánh giá mức độ giảm sinh khối) [46] sử dụng nghiên cứu sửa đổi để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm 2.3.9.1 Phương pháp đánh giá hạn khay Các WT, OE1 OE2 14 ngày tuổi trồng đĩa GM (2% đường, 0.6% agar) chuyển sang khay đất (với kích thước khay rộng × dài × cao: 21 × 30 × cm) ni sinh trưởng điều kiện nhà kính với cường độ chiếu sáng 76.6 µmol m-2 s-1 chu kỳ 16 sáng/8 tối 23 oC thêm tuần trước xử lý hạn Hạn tiến hành xử lý cách rút toàn nước khay, trì 14 ngày sau rút nước quan sát có khác biệt WT OE1 OE2, tưới nước trở lại Số lượng sống chết khay đếm sau ngày tưới nước trở lại Kết khay có từ thí nghiệm độc lập (30 cây/kiểu gen/mỗi thí nghiệm độc lập) sử dụng phân tích đánh giá tỷ lệ sống chết 2.3.9.2 Phương pháp cân trọng lượng cốc Cây 14 ngày trồng đĩa GM (2% đường, 0.6% agar) chuyển sang cốc nhựa (với kích thước, chiều cao × đường kính: × cm) chứa 29 gam đất khơ (Dio Propagation Mix No.2 for Professional, Dio Chemicals, Tokyo, Nhật Bản) bổ sung nước Sau ngày trồng điều kiện chiếu sáng 76.6 µmol m-2 s-1 với chu kỳ 18 sáng/8 tối 23 oC, cốc tiến hành xử lý hạn thời gian 12 ngày tương đương trọng lượng cốc xuống 35% so với trọng lượng ban đầu Trong suốt trình rút nước, cốc cân bổ sung nước hàng ngày để đảm bảo cốc trì trọng lượng Sau 12 ngày xử lý hạn, cốc bổ sung nước để cốc đạt 70% trọng lượng so với ban đầu Sau đó, cốc tiếp tục xử lý hạn 55 ngày đến lượng cốc giảm 35% so với trọng lượng ban đầu Toàn phần thân cắt sấy khô 65 oC ngày để sử dụng cho cân trọng lượng khô (sinh khối) Phần (đã loại bỏ chồi) điển hình chụp ảnh để sử dụng cho kết có luận văn Ba thí nghiệm tiến hành độc lập ba thời điểm khác Tất ba thí nghiệm độc lập (8 cây/kiểu gen/mỗi thí nghiệm độc lập) cho kết giống nhau, số liệu trình bày luận án kết thí nghiệm độc lập 2.3.10 Phương pháp đo nhiệt độ bề mặt WT chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn Đối với thí nghiệm phân tích mức độ nước, phương pháp đo nhiệt độ bề mặt sử dụng Cụ thể, WT, OE1 OE2 trồng đĩa GM (2% đường, 0.6% agar) 14 ngày, sau chuyển sang cốc nhựa có bổ sung đất thiết kế cạnh (20 cây/kiểu gen/cốc; kích thước đường kính x chiều cao cốc 10 x cm) Các sau trồng thêm tuần trước xử lý hạn Nhiệt độ bề mặt quan sát trình xử lý hạn sử dụng hệ thống máy quay cảm biến nhiệt R500EX (Nippon Avionics, Tokyo, Japan), theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3.11 Đo tỷ lệ thành phần nước, mức độ rò rỉ ion độ ẩm đất Tỷ lệ thành phần nước mức độ rò rỉ ion đo phần thân WT, OE1 OE2 thời điểm xử lý hạn đất đo phương pháp mơ tả trước [89] Hệ thống đầu dị đo độ ẩm đất HydroSense (Campbell Scientific, Utah, Mỹ) sử dụng để đo độ ẩm đất vị trí trước rút nước trình xử lý hạn theo mơ tả trước [89] Trước rút nước, độ ẩm đất khay có chứa lượng nước 84% 56 2.3.12 Xác định hàm lượng malondiadehyde khả hoạt động enzyme chống oxy hóa Các WT, OE1 OE2 tuần tuổi trồng đĩa GM (2% đường, 0.6% agar) chuyển sang khay (với kích thước khay rộng, dài cao 21 x 30 x cm) (18 cây/kiểu gen/khay) có chứa đất bổ sung nước Các trồng thêm tuần trước xử lý hạn kéo dài thời gian 12 ngày Các sau loại bỏ chồi tưới nước đầy đủ xử lý hạn thu sử dụng để đo hàm lượng MDA hoạt độ enzyme chống oxy hóa Hàm lượng MDA đo phương pháp thiobarbituric acid mơ tả trước [47] Trong đó, để đo hoạt độ enzyme, mẫu WT chuyển gen tách chiết dựa vào phương pháp cơng bố trước [82] Hoạt độ enzyme SOD tiến hành theo phương pháp [31], hoạt độ CAT tiến hành theo phương pháp [81] hoạt độ enzyme APX xác định pháp [84] 2.3.13 Phương pháp trồng, xử lý thu mẫu đậu gà Hạt giống đậu gà chịu hạn Hashem giống chịu hạn tốt ILC482 trồng chậu có dung tích lít chứa đất dinh dưỡng chăm sóc để sinh trưởng bình thường nhà kính (nhiệt độ 30 oC, chu kỳ 12 sáng/12 tối, cường độ chiếu sáng 150 µmol m-2 s-1 đơn vị chiếu sáng, độ ẩm 60%) [43] Cây đậu gà trồng điều kiện bình thường ngày sau sử dụng cho xử lý nước, xử lý ABA xử lý ngâm nước (đối chứng) Cụ thể, đậu gà ngày tuổi lấy khỏi đất, rửa loại bỏ hoàn toàn đất rễ Đối với xử lý nước, đặt giấy thấm Kim Towel (Nippon Paper Crecia Ltd., Nhật Bản) bàn thí nghiệm để khơ tự nhiên điều kiện phịng Đối với xử lý ABA, phần rễ ngâm 57 tiếp xúc nước có chứa 100 µM ABA Đối với mẫu đối chứng, ngâm nước nhiệt độ phòng Sau thời gian xử lý thời điểm giờ, mẫu rễ thu riêng biệt cẩn thận (3 lần lặp lại/mỗi xử lý/giống), cho vào ni tơ lỏng sau bảo quản -80 oC Mẫu rễ sử dụng cho phân tích mức độ biểu gen CaNAC điều kiện thường, xử lý hạn ABA 2.3.14 Tách chiết RNA, xử lý DNAseI, tổng hợp cDNA cho phân tích qRTPCR Các mẫu Arabidopsis mẫu rễ đậu gà nghiền thành bột mịn sử dụng máy lắc Retsch MM300 chày cối sứ nitơ lỏng RNA tổng số tách chiết sử dụng kít RNeasy Plant Mini hệ thống QIAcube (Qiagen, Nhật Bản) Nồng độ RNA kiểm tra máy đo quang phổ NanoDrop ND-1000 UV-Vis (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, Mỹ) Đối với mẫu RNA tương ứng, µg RNA tổng số xử lý loại bỏ DNA tổng thể tích 25 µl sử dụng Turbo DNA-free DnaseI (Ambion, Austin, TX, Mỹ) Sau xử lý với DNaseI, nồng RNA kiểm tra lại máy đo quang phổ kế NanoDrop Chất lượng RNA mẫu đạt yêu cầu với giá trị A260/A280 A260/A230 khoảng 1,9-2 Tiếp theo, 1µg RNA sau xử lý loại bỏ DNA mẫu sử dụng để tổng hợp cDNA sợi đơn kít ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix (Toyobo, Nhật Bản) tổng thể tích phản ứng 20 µl theo phương pháp mơ tả trước [62] 2.3.15 Phân tích biểu gen kỹ thuật qRT-PCR Để phân tích mức độ biểu gen GmNAC085, mẫu thu nhận từ Arabidopsis đối chứng không chuyển gen chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 18 ngày tuổi trồng trực tiếp đất sử dụng cho phân tích qRT-PCR sử dụng cặp mồi GmNAC085-F/GmNAC085-R 58 (Phụ lục bảng 1) Trong đó, mẫu thu nhận từ WT, 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện tưới nước đầy đủ xử lý hạn tiến hành mục 2.3.12 để sử dụng cho phân tích mức độ biểu gen thị liên quan tới enzyme chống oxy hóa đáp ứng hạn Gen ACT2 sử dụng gen quản gia phân tích mức độ biểu gen Arabidopsis Trình tự mồi gen thị gen quản gia ACT2 trình bày Phụ lục bảng Để phân tích mức độ biểu gen CaNAC mẫu rễ đậu gà sau thời gian xử lý nước ABA, cặp mồi đặc hiệu cho gen CaNAC trình bày Phụ lục bảng sử dụng phân tích qRTPCR mẫu khơng lặp lại/mỗi xử lý để xác định mức độ biểu 19 gen CaNAC đáp ứng với xử lý nước ABA Trong đó, gen IF4α lựa chọn làm gen quản gia phân tích mức độ biểu gen CaNAC đậu gà dựa sở báo công bố trước [43] Trình tự mồi gen CaNAC gen quản gia IF4α trình bày Phụ lục bảng Thông tin chi tiết phản ứng qRT-PCR tiến hành dựa theo phương pháp trình bày trước [62] Các phản ứng qRT-PCR tiến hành hệ thống Stratagene MX3000P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Mỹ) sử dụng kít Thund rbird SYBR qPCR Mix (Toyobo, Nhật Bản) với chu trình sau: 95 oC phút, 40 chu kỳ (với 95 oC 15 giây 60 C phút), 95 oC phút Phương pháp 2-△△Ct sử dụng o phân tích mức độ biểu gen dựa giá trị Ct gen quản gia ACT2 IF4a tương ứng Arabidopsis đậu gà (Phụ lục bảng 4) theo công bố trước [62] 2.3.16 Tiêu chuẩn lựa chọn gen CaNAC đáp ứng hạn tiềm Tiêu chí để lựa chọn gen CaNAC tiềm dựa vào nghiên cứu trước [118] Trong đó, gen ứng viên lựa chọn chia 59 thành nhóm dựa vào số tiêu chí lựa chọn cụ thể sau: (I) Nhóm gen tăng mức độ biểu gen ứng viên xác định có tiềm phát triển chuyển gen có khả cải thiện tính chống chịu hạn sử dụng cách tiếp cận tăng mức độ biểu gen, gen đáp ứng tiêu chí sau: (i) có thay đổi điều kiện xử lý hạn giống chịu hạn tốt ILC482 so với không thay đổi giống chịu hạn Hashem thể mức độ biểu cao giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện bình thường và/hoặc điều kiện xử lý hạn; (ii) có xu hướng tăng mức độ biểu điều kiện xử lý hạn hai giống chịu hạn tốt ILC482 chịu hạn Hashem kết hợp với tăng mức độ biểu cao giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện thường và/hoặc điều kiện xử lý hạn; (iii) tăng mức độ biểu giống chịu hạn tốt ILC482 so với không thay đổi giống chịu hạn Hashem, tăng/không thay đổi giống chịu hạn tốt ILC482 so với giảm giống chịu hạn Hashem (II) Nhóm gen giảm mức độ biểu gen ứng viên: chúng không thay đổi giảm biểu điều kiện xử lý hạn hai giống cho thấy mức độ biểu thấp giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện thường và/hoặc điều kiện xử lý hạn Các gen xác định cách tiếp cận tạo chuyển gen cải thiện khả chống chịu hạn cách làm giảm biểu RNA can thiệp (RNAi) 2.3.17 Phân tích ý nghĩa thống kê Số liệu sử dụng để phân tích ý nghĩa thống kê dựa vào phương pháp Student’s t-test (với khác biệt có ý nghĩa P < 0.05 rõ dấu hoa thị), phương pháp phân tích chiều khác biệt (ANOVA) với khác có ý nghĩa xử lý thỏa mãn điều kiện P < 0.05 dựa vào phương pháp Duncan’s multiple range test 60 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với điều kiện hạn mơ hình Arabidopsis Qua kết phân tích biểu gen GmNAC chồi rễ giống đậu tương Williams 82 điều kiện xử lý nước cho thấy số 38 gen GmNAC đáp ứng với hạn GmNAC085 gen có mức độ biểu cao chồi rễ [63] Kết cho thấy GmNAC085 gen tiềm cho nghiên cứu tạo trồng chuyển gen nhằm tăng cường khả chống chịu hạn đậu tương nói riêng nơng nghiệp nói chung Do vậy, nội dung luận án tiếp tục tiến hành nghiên cứu để làm rõ chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với điều kiện hạn mơ hình Arabidopsis 3.1.1 Kết thiết kế cấu trúc vector phân tích hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men Để kiểm tra liệu GmNAC085 có đóng vai trị hoạt hóa phiên mã hay không, trước tiên tiến hành thiết kế vector pGBKT7 có chứa vùng TRR đầu C- GmNAC085 Cụ thể, đoạn TRR GmNAC085 có kích thước 549 bp khuếch đại từ cDNA giống đậu tương Williams 82 (Hình 3.1A) gắn vào vector tách dòng pKS Sản phẩm tái tổ hợp vector pKS:TRR cho thấy trình tự hồn tồn xác so với trình tự dự đốn ban đầu (Phụ lục bảng 5) Sau đó, DNA plasmid vector tái tổ hợp pKS:TRR cắt enzyme NdeI PstI điện di kiểm tra cho thấy sản phẩm cắt có băng; băng trùng vị trí kích thước TRR băng kích thước vector pKS (Hình 3.1B) Cuối cùng, sản phẩm cắt đoạn TRR ghép nối vào vector biểu pGBKT7 sản phẩm tái tổ hợp pGBKT7:TRR kiểm tra trực tiếp PCR khuẩn lạc (Hình 3.1C) Kết cho thấy, việc ghép nối vùng TRR 61 đầu C- GmNAC085 với vùng liên kết DNA GAL4 vector pGBKT7 thành cơng Hình 3.1 Kết thiết kế vector pGBKT7:TRR cho phân tích biểu nấm men Chú thích: (A) Kết kiểm tra sản phẩm PCR đoạn TRR GmNAC085 từ cDNA (B) Kết cắt vector pKS:TRR enzyme giới hạn NdeI PstI (C) Kết PCR đoạn TRR GmNAC085 trực tiếp từ khuẩn lạc vector pGBKT7:TRR M, thang chuẩn kb plus DNA; c, sản phẩm PCR từ cDNA; (-), đối chứng âm; P12: cắt kiểm tra DNA plasmid pKS:TRR enzyem giới hạn (+), đối chứng dương DNA plasmid pKS:TRR; 1-6, Kết PCR khuẩn lạc vector pGBKT7:TRR; TRR, vùng điều hòa phiên mã GmNAC085 Tiếp theo, cấu trúc vector tái tổ hợp pGBKT7:TRR vector trống pGBKT7 chuyển vào chủng nấm men AH109 để đánh giá biểu chúng Quan sát cho thấy, tất chủng nấm men sinh trưởng bình thường đĩa mơi trường SD/-Trp (Hình 3.2A); nhiên, có chủng nấm men mang cấu trúc pGBKT7:TRR phát triển mơi trường SD/-Trp/-His/Ade (Hình 3.2B) thể hoạt tính β-galactosidase mạnh (Hình 3.2C) Kết chứng tỏ vùng TRR đầu C- GmNAC085 đóng vai trò 62 vùng điều hòa phiên mã cần thiết cho trình hoạt động GmNAC085 Hình 3.2 Kết phân tích khả phiên mã GmNAC085 nấm men Chú thích: Cấu trúc pGBKT7:TRR vector trống (pGBKT7) biến nạp vào chủng nấm men AH109 (A-B) Các khuẩn lạc sau biến nạp đánh giá khả sinh trưởng đĩa (A) SD/-Trp (B) SD/-Trp/-His/-Ade ngày ni cấy (C) Phân tích hoạt động β-galactosidase sử dụng khuẩn lạc nuôi đĩa SD/-Trp ngày TRR, vùng điều hòa phiên mã GmNAC085 3.1.2 Kết phân lập thiết kế vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis Theo nghiên cứu [63] cho thấy gen GmNAC085 biểu mạnh chồi rễ sau 10 xử lý nước giống đậu tương Williams 82 Tuy nhiên, gen GmNAC085 biểu mạnh 390 lần chồi sau 10 xử lý nước Một nghiên cứu khác gen GmNAC085 biểu mạnh chồi chồi rễ giống đậu tương Việt Nam DT51 MTD20 sau thời gian xử lý nước Đặc biệt, gen GmNAC085 biểu mạnh chồi giống đậu tương DT51 sau 10 xử lý nước [3] Các kết cho thấy GmNAC085 gen đáp ứng mạnh với nước sau 10 xử lý chồi Chính vậy, nghiên cứu chúng tơi sử dụng mẫu chồi giống đậu tương Williams 82 xử lý nước lúc 10 làm vật liệu cho nhân dòng gen GmNAC085 thiết kế vector biểu thực vật mang gen GmNAC085 để chuyển vào mơ hình Arabidopsis với mục đích 63 làm rõ chức chế tham gia vào trình đáp ứng với hạn hán Để thiết kế vector biểu mang gen GmNAC085, khuếch đại đoạn gen mã hóa cho gen GmNAC085 từ cDNA giống đậu tương Williams 82 sau 10 xử lý nước PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GmNAC085F-NotI/GmNAC085R-XhoI (Phụ lục bảng 1) Kết cho thấy sản phẩm PCR có kích thước dự đốn khoảng 1000 bp (Hình 3.3A) tương ứng với kích thước dự đốn gen GmNAC085 với đoạn trình tự bổ sung hai enzyme giới hạn NotI XhoI hai đầu 5’ 3’ Tiếp theo, sản phẩm PCR đầu đoạn gen GmNAC085 tinh gắn vào vector tách dòng pKS (Phụ lục hình 1) cắt vị trí enzyme giới hạn EcoRV để tạo vector tái tổ hợp pKS:GmNAC085, sản phẩm vector tái tổ hợp sau biến nạp vào chủng vi khuẩn DH5α chọn lọc đĩa mơi trường LB đặc có bổ sung 50 mg/L kháng sinh ampicinin Các khuẩn lạc mọc đĩa môi trường LB lựa chọn để kiểm tra PCR Kết điện di cho thấy khuẩn lạc dương tính với cặp mồi đặc hiệu gen GmNAC085 có kích thước khoảng 1023 bp (Hình 3.3B) Kết cho thấy, việc ghép nối đoạn gen quan tâm GmNAC085 vào vector tách dòng pKS thành cơng Hình 3.3 Kết nhân dịng gen GmNAC085 từ thư viện cDNA PCR kiểm tra khuẩn lạc vector tái tổ hợp pKS:GmNAC085 Chú thích: (A) Kết điện di sản phẩm PCR gen GmNAC085 từ thư viện cDNA (B) 64 Kết PCR khuẩn lạc vector tái tổ hợp pKS:GmNAC085; M, thang chuẩn kb; cDNA, cDNA tổng hợp từ RNA tổng số mẫu chồi giống đậu tương Williams 82 xử lý nước 10 giờ; 1-6, khuẩn lạc; (-), đối chứng âm Từ kết PCR khuẩn lạc (Hình 3.3B) lựa chọn số khuẩn lạc dương tính để tách chiết tinh DNA plasmid phục vụ cho giải trình tự Kết giải trình tự cho thấy, trình tự nhân dịng gen GmNAC085 từ giống đậu tương Williams 82 khơng có sai khác so với trình tự gen Glyma12g22880.1 từ sở liệu http://soykb.org/ (Phụ lục bảng 5) Như vậy, đoạn gen GmNAC085 khuếch đại thành công từ cDNA giống đậu tương Willams 82 sau xử lý nước Tiếp theo, đoạn gen GmNAC085 có trình tự xác sử dụng cho phản ứng ghép nối với vector biểu pGKX điều khiển promoter biểu liên tục 35S cắt hai enzyme giới hạn NotI XhoI để tạo vector tái tổ hợp pGKX:35S:GmNAC085 Sau đó, vector tái tổ hợp biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli DH5α chọn lọc đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 50 mg/L kháng sinh kanamycin Các khuẩn lạc mọc đĩa môi trường LB lựa chọn để kiểm tra PCR sử dụng cặp mồi 35Spro-F GmNAC085R-XhoI (Phụ lục bảng 1) Một số khuẩn lạc lựa chọn cho kết dương tính với cặp mồi sử dụng có kích thước khoảng 1650 bp trùng với kích thước dự đốn ban đầu bao gồm phần trình tự gen GmNAC085 phần trình tự promoter 35S vector pGKX (Phụ lục hình 4) Để đảm bảo vector tái tổ hợp pGKX:35S:GmNAC085 chứa xác trình tự gen GmNAC085, lựa chọn số khuẩn lạc dương tính để kiểm tra lại giải trình tự, kết giải trình tự cho thấy gen GmNAC085 hồn tồn xác trình tự khuếch đại ban đầu (Phụ lục bảng 5) Như vậy, việc thiết kế vector biểu thực vật pGKX chứa gen GmNAC085 thành công đoạn gen chiều với chiều khởi đầu 65 phiên mã từ đầu promoter 35S Cuối cùng, DNA plasmid vector tái tổ hợp pGKX:35S:GmNAC085 tinh biến nạp vào chủng vi khuẩn A tumefaciens GV3101 nhằm phục vụ cho việc chuyển gen vào mơ hình Arabidopsis 3.1.3 Kết sàng lọc lựa chọn dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 Để phân tích chức sinh học protein GmNAC085 thực vật, tiến hành chuyển gen GmNAC085 vào Arabidopsis phương pháp nhúng hoa dịch khuẩn GV3101 mang cấu trúc vector pGKX:35S:GmNAC085 thu nhận dòng chuyển gen ban đầu Sau sàng lọc đánh giá tỷ lệ phân ly theo mơ tả trước [119] hệ liên tiếp đĩa mơi trường GM đặc có bổ sung 30 mg/L kháng sinh kanamycin, nhận thấy có dịng chuyển gen 35S:GmNAC085 (được ký hiệu OE1 OE2) phân ly tuân theo tỷ lệ 3:1 định luật Mendel (Hình 3.4) Hình 3.4 Kết sàng lọc lựa chọn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 mơi trường GM có chứa kháng sinh kanamycin Chú thích: GM, mơi trường nảy mầm; Km, kháng sinh kanamycin Dựa vào kết phân tích phân ly tính trạng này, chúng tơi sàng lọc 66 dòng OE1 OE2 đồng hợp tử mang chèn gen GmNAC085 Tuy nhiên, để đảm bảo chắn việc sàng lọc Arabidopsis chuyển gen GmNAC085 dựa mơi trường GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc phương pháp tin cậy, tiếp tục tiến hành kiểm tra diện gen GmNAC085 chuyển gen kỹ thuật lai southern blot (Hình 3.5A-B) Kết cho thấy dòng OE1 OE2 xuất có băng vị trí khác màng lai với đối chứng dương DNA plasmid pGKX:35S:GmNAC085 lai với mẫu đầu dị sản phẩm PCR gen GmNAC085 (Hình 3.5B) Hình 3.5 Kết phân tích southern blot Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 Chú thích: (A) Kết kiểm tra sản phẩm cắt enzyme giới hạn EcoRI; (B) Kết lai với mẫu đầu dò M, GeneRuler 1kb Plus DNA ladder; WT, Arabidopsis không chuyển gen; P: DNA plasmid pGKX:35S:GmNAC085; OE1 OE2, 67 Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 Các kết dòng chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 hai dòng đồng hợp tử hoàn toàn riêng biệt mang chèn gen GmNAC085 Do vậy, dòng chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 lựa chọn để tiến hành thí nghiệm nhằm làm rõ chức GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 3.1.4 Kết đánh giá kiểu hình Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện thường Trong số dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 sử dụng nghiên cứu, dịng OE1 cho thấy biểu gen GmNAC085 mạnh so với dịng OE2 (Hình 3.6A) Hình 3.6 Kiểu hình thân Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện bình thường Chú thích: (A) Mức độ biểu gen GmNAC085 OE1 OE2 18 ngày tuổi trồng đất với mức độ biểu cao 100 (Hình bên trên) Kết 68 tính từ riêng biệt dòng (n =3) Gen ACT2 sử dụng gen tham chiếu phân tích qRT-PCR Sản phẩm PCR cuối qRT-PCR sử dụng cho chạy điện di agarose 2% (Hình bên dưới) Gen chuyển GmNAC085 khơng phát WT (B) Bán kính rosette lớn WT, OE1 OE2 trồng đất thời điểm 18 ngày tuổi Biểu đồ thể kích thước sai số chuẩn tính từ 10 dòng (n =10) (C) Chiều cao WT, OE1 OE2 trồng đất thời điểm 50 ngày tuổi Biểu đồ thể chiều cao sai số chuẩn tính từ dòng (n = 7) (D) Năng suất WT, OE1 OE2 Biểu đồ thể số liệu sai số chuẩn tính từ dòng (n =5) Các chữ số khác thể khác có ý nghĩa (P < 0.05) kiểu gen dựa vào phương pháp phân tích Duncan’s Khi đánh giá khả sinh trưởng phát triển Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện thường với đối chứng không chuyển gen Kết cho thấy, hai OE1 OE2 giảm sinh trưởng thân rễ, giảm kích thước lá, chiều cao cây, suất hạt hàm lượng diệp lục thấp so với WT điều kiện bình thường tưới nước đầy đủ (Hình 3.6B-D Hình 3.7A-B) Hình 3.7 Kiểu hình rễ hàm lượng diệp lục Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện bình thường Chú thích: (A) Kiểu hình rễ WT, OE1 OE2 Cây gieo thẳng đứng đĩa môi trường GM ngày sau chuyển sang đĩa mơi trường GM thêm ngày 69 Cây 10 ngày tuổi chụp ảnh chiều dài rễ đo Biểu đồ thể chiều dài rễ sai số chuẩn tính từ 17 dịng (n = 17) (B) Hàm lượng diệp lục WT, OE1 OE2 Cây trồng đĩa GM mơ tả hình (A) Biểu đồ thể hàm lượng diệp lục sai số chuẩn tính từ dịng (n =5) Các chữ số khác thể khác có ý nghĩa (P < 0.05) kiểu gen dựa vào phương pháp phân tích Duncan’s 3.1.5 Kết đánh giá khả kháng hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 Để nghiên cứu chức GmNAC085 trình đáp ứng với stress hạn, Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1, OE2 WT tuần tuổi kiểm tra khả đáp ứng với hạn sử dụng phương pháp quan sát tỷ lệ sống chết khay cách rút nước thời gian 14 ngày, sau tưới nước trở lại ngày (Hình 3.8A-D) Hình 3.8 Kiểu hình chịu hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sử dụng phương pháp phân tích tỷ lệ sống sót Chú thích: (A) Cây WT, OE1 OE2 tuần tuổi trước xử lý hạn (B) Cây WT, 70 OE1 OE2 xử lý hạn 14 ngày sau tưới nước trở lại ngày Ảnh chụp sau chồi loại bỏ từ sống sót (C) Cây WT, OE1 OE2 trồng song song với thí nghiệm hạn điều kiện tưới nước đầy đủ (D) Độ ẩm đất thời điểm Số liệu đo điểm vùng dòng (n = 5) (E) Tỷ lệ sống WT, OE1 OE2 Biểu đồ thể tỷ lệ sống sót sai số chuẩn tính từ khay riêng biệt từ lần thí nghiệm khác (n = 3; 30 cây/kiểu gen/mỗi thí nghiệm) Các dấu hoa thị khác biệt kiểu gen điều kiện thiếu nước tính theo phương pháp Student’s t-test (**P < 0.01; ***P < 0.001) Kết cho thấy, khoảng 93–98% tỷ lệ OE1 OE2 phục hồi sau thời gian tưới nước trở lại, tỷ lệ sống sót WT thấp 40% (Hình 3.8E) Như vậy, biểu GmNAC085 Arabidopsis chuyển gen cải thiện khả chịu hạn tốt chúng so với đối chứng khơng chuyển gen Hình 3.9 Kiểu hình chịu hạn 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sử dụng phương pháp phân tích giảm sinh khối Chú thích: (A) Kiểu hình rosette WT, OE1 OE2 trồng điều kiện tưới 71 nước đầy đủ xử lý hạn (B) Sinh khối WT, OE1 OE2 điều kiện thường xử lý hạn Hình thể sinh khối sai số chuẩn tính từ kiểu gen (n = 8) (C) Trọng lượng cốc WT, OE1 and OE2 thời điểm khác trình xử lý hạn Biểu đồ thể trọng lượng cốc sai số chuẩn tính từ cốc sử dụng kiểu gen (n = 8) Mũi tên đen để thể nước bổ sung thêm vào cốc lúc 12 ngày để tăng trọng lượng cốc lên 70% so với trọng lượng ban đầu Mũi tên đỏ thể thời điểm thu để sử dụng cho đo sinh khối lúc 17 ngày (D) Tỷ lệ giảm sinh khối WT, OE1 OE2 điều kiện hạn so sánh với đối chứng trồng điều kiện tưới nước đầy đủ Đồ thị thể tỷ lệ giảm sinh khối sai số chuẩn tính từ kiểu gen (n = cây) Các chữ số khác thể khác có ý nghĩa (P < 0.05) tất cặp so sánh dựa vào phương pháp phân tích Duncan’s Để có thêm dẫn chứng, chúng tơi tiến hành kiểm tra ảnh hưởng GmNAC085 phát triển 35S:GmNAC085 điều kiện thiếu nước phương pháp cân trọng lượng cốc (Hình 3.9) Kết đánh giá cho thấy, sinh khối OE1 OE2 thấp so với WT điều kiện tưới nước đầy đủ xử lý hạn (Hình 3.9A-B) Quan trọng hơn, tỷ lệ giảm sinh khối hai OE1 OE2 thấp đáng kể so với WT thời điểm đánh giá tỷ lệ nước trình xử lý hạn (Hình 3.9C-D) Những kết nghiên cứu cho thấy GmNAC085 hoạt động TF điều hịa tích cực q trình đáp ứng thực vật với stress hạn 3.1.6 Kết đánh giá mức độ phá hủy tế bào tốc độ thoát nước chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn Tiếp theo, tìm hiểu rõ chế chuyển gen 35S:GmNAC085 trình đáp ứng với hạn Đầu tiên, quan sát thấy tỷ lệ thành phần nước hai OE1 OE2 cao so với 72 WT thí nghiệm đánh giá hạn đất (Hình 3.10A B) Thứ hai, OE1 OE2 có mức độ dị rỉ ion thấp WT thời điểm xử lý hạn (Hình 3.10C) Hình 3.10 So sánh tỷ lệ thành phần nước mức độ dò rỉ ion WT chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện xử lý hạn Chú thích: (A-C) Cây WT, OE1 OE2 trồng xử lý hạn mơ tả Hình 3.8A&B Ở thời điểm hình, (A) % độ ẩm đất (n = 5) độ ẩm khơng khí, (B) Tỷ lệ thành phần nước (n = cây/kiểu gen) (C) Mức độ rò rỉ ion (n = cây/kiểu gen) được đo Biểu đồ thể giá trị sai số chuẩn tính từ số liệu tương ứng Các dấu hoa thị khác biệt kiểu gen điều kiện tưới nước đầy đủ xử lý hạn tính theo phương pháp Student’s ttest (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001) WW, tưới nước đầy đủ; D, xử lý hạn Thứ ba, OE1 OE2 thể nhiệt độ bề mặt cao WT 73 thời gian xử lý hạn phương pháp phân tích nhiệt độ bề mặt (Hình 3.11) Những kết biểu mức GmNAC085 làm tăng cường khả chống chịu hạn Arabidopsis chuyển gen cách giảm tỷ lệ nước thông qua việc giảm tổn thương màng tế bào tốc độ nước Hình 3.11 So sánh nhiệt độ bề mặt WT chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện xử lý hạn Chú thích: Nhiệt độ bề mặt WT, OE1 OE2 thời điểm xử lý hạn [1 – ngày sau xử lý hạn (DAD)] Camera bình thường (bên trái) camera cảm biến nhiệt (bên phải) sử dụng để chụp ảnh 3.1.7 Sự biểu GmNAC085 tăng cường bảo vệ Arabidopsis chuyển gen chống lại phản ứng oxy hóa stress hạn gây Vì Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 cho thấy mức độ tổn thương màng tế bào thấp điều kiện hạn, tiến hành so sánh mức độ tích lũy MDA, biết tới thị sinh học đáng tin cậy liên quan tới phá hủy màng tế bào phản ứng oxy hóa gây stress hạn [93] WT chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 Trong điều kiện tưới nước đầy đủ cho thấy, khơng có khác biệt hàm lượng MDA WT, OE1 OE2 Tuy nhiên, điều kiện xử lý hạn 74 dẫn đến tích lũy đáng kể MDA WT, OE1 OE2, hàm lượng MDA WT cao so với OE1 OE2 (Hình 3.12A-C) Hình 3.12 Hàm lượng Malondialdehyde (MDA) WT 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sau 12 ngày xử lý hạn Chú thích: (A) Tỷ lệ phần trăm độ ẩm đất (n = 5) (B) Tỷ lệ thành phần nước (n = rosette/4 riêng biệt/kiểu gen) (C) Hàm lượng MDA (n = cây/kiểu gen) Biểu đồ thể giá trị sai số chuẩn tính từ số liệu tương ứng Các dấu hoa thị thể khác có ý nghĩa kiểu gen điều kiện thường hay xử lý hạn sử dụng phương pháp Student’t t-test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001) WW, tưới nước đầy đủ; D, xử lý hạn Để xác định giảm tích lũy MDA gây hạn hán chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 việc tăng cường khả chống oxy hóa, chúng tơi tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme tham gia vào q trình chống oxy hóa SOD, CAT APX Trong điều kiện tưới nước đầy đủ, hoạt tính SOD CAT cao đáng kể OE1 OE2 so với WT, đó, điều kiện hạn hán ba enzyme kiểm tra cho thấy hoạt độ cao OE1 OE2 so với WT (Hình 3.13A) Cùng với kết này, mức độ biểu ba gen thị CSD1 75 (COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE 1), CAT1 (CATALASE 1) sAPX (STROMAL ASCORBATE PEROXIDASE) mã hóa cytosolic SOD, peroxisomal CAT chloroplastic APX [45], [78], [128] OE1 OE2 cao so với WT điều kiện xử lý hạn (Hình 3.13B) Hình 3.13 Hoạt tính enzyme chống oxy hóa mức độ biểu gen liên quan WT 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sau 12 ngày xử lý hạn Chú thích: (A) Hoạt động SOD, CAT APX (n = lá/3 riêng biệt/kiểu gen) (B) Mức độ biểu gen CDS1, CAT1 sAPX (n = lá/3 riêng biệt/kiểu gen) Biểu đồ thể giá trị sai số chuẩn tính từ số liệu tương ứng Các dấu hoa thị thể khác có ý nghĩa kiểu gen điều kiện thường hay xử lý hạn sử dụng phương pháp Student’t t-test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001) WW, tưới nước đầy đủ; D, xử lý hạn 76 Hơn nữa, gen thị tìm thấy có chứa vị trí liên kết cốt lõi (CACG) chuỗi trình tự nhận biết NACRS vùng promoter chúng (Bảng 3.1), cho thấy GmNAC085 điều hòa biểu gen Những phát Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 có chứa hệ thống chống oxy hóa cải thiện, góp phần bảo vệ chống lại phản ứng oxy hóa điều kiện hạn hán Bảng 3.1 Kết dự đốn trình tự nhận biết NAC (CACG) vùng promoter 1000 bp số gen thị Tên gen Ký hiệu Số lượng motif CACG AT3G14440 NCED3 AT1G01470 LEA14 AT1G52890 AtNAC019 AT2G33380 RD20 AT5G52300 RD29B AT1G08830 CSD1 AT1G20630 CAT1 AT4G08390 sAPX 3.1.8 Sự biểu GmNAC085 làm tăng mức biểu gen thị Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện stress hạn Các kết cho thấy, biểu GmNAC085 Arabidopsis làm tăng khả chống chịu hạn 35S:GmNAC085 OE1 OE2, vậy, nghiên cứu thay đổi kiểu hình chuyển gen có liên quan với thay đổi biểu số gen thị đáp ứng với hạn gen biết có chứa trình tự liên kết cốt lõi 77 NACRS promoter chúng chức đường trung gian NAC để cải thiện khả đáp ứng trồng với điều kiện hạn hán Các gen bao gồm NCED3 (NINE-CIS-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 3), LEA14, RD20 (RESPONSIVE TO DESICCATION 20), RD29B (RESPONSIVE TO DESICCATION 29B) AtNAC019 (Bảng 3.1) Kết cho thấy, mức độ phiên mã gen NCED3, LEA14 RD20 cao đáng kể OE1 OE2 so với WT điều tưới nước đầy đủ (Hình 3.14) Sau xử lý hạn hán, biểu tất gen cao OE1 OE2 so với WT (Hình 3.14) Kết cho thấy, GmNAC085 làm tăng khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen thông qua việc điều chỉnh gen đáp ứng hạn hán quan trọng Hình 3.14 Mức độ biểu gen liên quan tới bất lợi WT 35S:GmNAC085 OE1 OE2 sau 12 ngày xử lý hạn 78 Chú thích: Mức độ biểu gen thị đáp ứng bất lợi (n = lá/3 riêng biệt/kiểu gen) Biểu đồ thể giá trị sai số chuẩn tính từ số liệu tương ứng Các dấu hoa thị thể khác có ý nghĩa kiểu gen điều kiện thường hay xử lý hạn sử dụng phương pháp Student’t t-test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001) WW, tưới nước đầy đủ; D, xử lý hạn Trong đậu tương, biết có 38 gen GmNAC dự đốn xác định đáp ứng với nước [63]; đó, GmNAC085 biết đến gen có mức độ biểu mạnh điều kiện xử lý nước có tiềm hứa hẹn chúng tơi tiếp tục tiến hành nghiên cứu chức trình đáp ứng với stress hạn đối tượng mơ hình Arabidopsis Khi nghiên cứu khả hoạt động phiên mã nấm men chứng minh GmNAC085 hoạt động chất hoạt hóa phiên mã (Hình 3.2), cho thấy GmNAC085 kích hoạt gen theo sau để điều chỉnh mức độ đáp ứng stress hạn Phần lớn TF NAC xác định trước đóng vai trị chất hoạt hóa phiên mã hoạt động tích cực [73], [121], [134], [138]; nhiên, số TF NAC lại có chức chất ức chế phiên mã việc điều chỉnh phản ứng bất lợi môi trường [44], [127] Kết nghiên cứu luận án cho thấy, GmNAC085 đóng vai trị chất điều hịa tích cực trồng trình đáp ứng với hạn hán thơng qua biểu làm cho chuyển gen 35S:GmNAC085 tăng cường khả đối phó với tình trạng thiếu nước (Hình 3.8 3.9); đó, số hoạt hóa phiên mã lại cho thấy đóng vai trị điều hịa tiêu cực với khả chống chịu với stress hạn, ví dụ SlSRN1 cà chua (Solanum lycopersicum) OsNAC095 lúa [51], [67] Tình trạng thiếu nước biết đến bất lợi mơi trường ảnh hưởng xấu đến tất khía cạnh thực vật, bao gồm 79 kiểu hình q trình chuyển hóa trao đổi chất [115], [131] Để đối phó với thách thức này, thực vật phát triển số chế để thích nghi với stress hạn, bao gồm điều chỉnh trình sinh trưởng, phát triển, ức chế phát triển chồi, để tiết kiệm nguồn nước có hạn [24], [115], [130] Trong nghiên cứu cho thấy, biểu GmNAC085 Arabidopsis làm chậm phát triển chồi rễ, giảm kích thước lá, giảm suất hạt điều kiện bình thường tăng cường khả chịu hạn (Hình 3.6 – 3.9); từ cho thấy GmNAC085 đóng vai trị điều hòa tăng trưởng để giảm mức tiêu thụ nước nước giúp sống sót tốt tình trạng thiếu nước Phát tìm thấy kết nghiên cứu trước cho thấy Arabidopsis chuyển gen biểu cách liên tục gen MlNAC5 làm giảm kích thước lá, giảm chiều dài rễ chiều cao cây; nhiên, tăng cường khả chịu hạn so với đối chứng không chuyển gen [131] Tương tự, biểu OsNAC6/SNAC2 lúa thể chậm phát triển giảm suất điều kiện thường, cải thiện khả chống chịu với tình trạng nước [85] Ngoài ra, chậm phát triển quan sát thấy Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện sinh trưởng bình thường giảm hàm lượng diệp lục dẫn đến giảm khả quang hợp (Hình 3.7B) Để có thêm dẫn chứng cho quan sát chúng tôi, nghiên cứu gần cho thấy biểu mức gen AtNAC046 Arabidopsis chuyển gen làm cho có kiểu hình còi cọc, giảm sinh khối chồi rễ điều kiện trồng bình thường với vai trị điều hịa tích cực dẫn đến giảm sút tích lũy hàm lượng diệp lục [92] Ngồi khả điều chỉnh tăng trưởng, kết nghiên cứu luận án cho thấy cải thiện khả chống chịu với stress hạn 35S:GmNAC085 (Hình 3.8 3.9) có liên quan đến khả trì tỷ lệ thành phần nước cao tình 80 trạng xử lý hạn (Hình 3.10A-B), tính tồn vẹn màng tế bào cải thiện giảm tốc độ (Hình 3.10C Hình 3.11) Cùng quan điểm với chúng tơi, số nghiên cứu cho thấy mối quan hệ tích cực tính tồn vẹn màng tế bào khả chịu hạn, mối tương quan nghịch tốc độ thoát khả chịu hạn trồng [52], [87], [99], [115] Hơn nữa, mức độ MDA thấp đáng kể Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 so với WT (Hình 3.12A-C), cho thấy khả chịu hạn chuyển gen cải thiện khả giải độc loại sản phẩm dư thừa sinh từ phản ứng ROS mạnh chúng để hạn chế oxy hóa màng lipid tác động stress hạn Cùng với phát này, biểu GmNAC085 dẫn đến tăng khả hoạt động enzyme chống oxy hóa SOD, CAT APX, tăng mức biểu ba gen mã hóa chúng, cụ thể CSD1, CAT1 sAPX (Hình 3.13A-B) Phân tích promoter ba gen thị chứng minh tồn trình tự liên kết cốt lõi NACRS (Bảng 3.1), cho thấy GmNAC085 tăng cường sinh tổng hợp SOD, CAT APX thông qua việc điều chỉnh gen mã hóa điều kiện hạn Trước đây, số TF NAC, cụ thể NTL4, MlNAC9, TaNAC29 CsATAF1 chứng minh có tham gia vào q trình đáp ứng trồng với stress hạn thơng qua việc điều hịa chuyển hóa ROS, từ đó, củng cố thêm vai trị hỗ trợ tích cực TF NAC hoạt động xử lý sản phẩm dư thừa phản ứng ROS để làm giảm thiểu thiệt hại oxy hóa gây stress hạn [52], [124], [139] Ngồi ra, tăng cường khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 giải thích tăng mức độ phiên mã số gen thị đáp ứng stress hạn, NCED3, LEA14, RD20, RD29B AtNAC019 (Hình 3.14), gen biết rõ góp phần tham gia làm tăng khả chịu hạn trồng thông qua đường trung gian 81 NAC [73], [74], [131], [137], [138] Việc điều chỉnh gen làm thay đổi số trình trao đổi chất đặc tính sinh lý chuyển gen, cho phép chúng tồn điều kiện hạn Ví dụ, biểu gen NCED3 làm tăng khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen thông qua việc tăng hàm lượng ABA nội sinh [54] Một nghiên cứu trước cho thấy tham gia gen RD20 mã hóa cho caleosin tăng khả chịu hạn thơng qua điều hịa tích cực việc đóng khí khổng màng plasma [21] Trong đó, nghiên cứu khác vai trị điều hịa tích cực gen AtNAC019 q trình đáp ứng với stress hạn liên quan đến tăng cường tham gia hệ thống glyoxalase vào trình giải độc tố aldehyde gây yếu tố bất lợi [49], [121], làm tăng q trình già hóa lá, chế trồng sử dụng để cải thiện khả thích nghi chúng với khan nước [42], [89] Hình 3.15 Cơ chế đáp ứng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 với điều kiện hạn 82 Qua kết nghiên cứu cho thấy, GmNAC085 gen đáp ứng với bất lợi đậu tương, đóng vai hoạt hóa phiên mã Sự biểu GmNAC085 Arabidopsis điều khiển promoter 35S làm tăng cường khả đáp ứng với stress hạn chuyển gen thông qua điều chỉnh tỷ lệ sinh trưởng giảm tỷ lệ thoát nước đồng thời giảm mức độ phá hủy màng tế bào, tăng cường mức độ phân giải sản phẩm ROS tăng mức độ biểu số gen đáp ứng với bất lợi chuyển gen 35S:GmNAC085 (Hình 3.15) Kết nghiên cứu gợi ý chức GmNAC085 gen điều hòa phiên mã tích cực q trình đáp ứng trồng với hạn hán gen có tiềm ứng dụng kỹ thuật di truyền phục vụ cho công tác tạo giống trồng chịu hạn Các promoter gây hạn ví dụ promoter RD29A từ Arabidopsis ABRC3 (ABA RESPONSE COMPLEX 3) từ lúa mạch (Hordeum vulgare) rõ biết chức đậu tương [28], [41], sử dụng để điều khiển biểu gen GmNAC085 nhằm tăng khả kháng hạn giảm thiểu tối đa ảnh hưởng bất lợi tới sinh trưởng đậu tương chuyển gen Từ nội dung nghiên cứu này, làm rõ chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với stress hạn chế giúp Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 chịu hạn tốt so với WT Từ đó, cho thấy gen GmNAC085 gen tiềm ứng dụng cho công tác cải tạo giống đậu tương/cây họ đậu quan trọng chống chịu với stress hạn Tuy nhiên, gen GmNAC085 có tiềm kháng hạn sử dụng cải tạo họ đậu chưa đủ chưa đáp ứng nhu cầu cấp thiết đặt ra, xây dựng nội dung nghiên cứu nhằm phát gen NAC đáp ứng hạn có tiềm khác đối tương đậu gà để phục vụ cho công tác cải tạo họ đậu chống chịu hạn tốt 83 3.2 Đánh giá mức độ biểu gen CaNAC đậu gà điều kiện xử lý hạn ABA 3.2.1 Kết so sánh tỷ lệ thành phần nước hai giống đậu gà Hashem ILC482 điều kiện xử lý nước Theo nghiên cứu trước [104], [105] cho thấy giống đậu gà ILC482 chịu hạn tốt so với giống Hashem dựa kết đánh giá số kháng hạn suất trung bình hai giống đậu gà trồng điều kiện tưới nước đầy đủ xử lý hạn đồng ruộng Trong nội dung nghiên cứu này, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả trì nước đậu gà ILC482 Hashem ngày tuổi sau xử lý làm nước điều kiện phịng thí nghiệm (Hình 3.16A-C) Hình 3.16 So sánh tỷ lệ thành phần nước hai đậu gà ILC482 Hashem trình xử lý nước 84 Chú thích: (A) Cây đậu gà ILC482 Hashem ngày tuổi trước xử lý nước (B) So sánh tỷ lệ thành phần nước ILC482 Hashem thời điểm khác (n = cây/kiểu gen) Biểu đồ thể giá trị sai số chuẩn Các dấu hoa thị khác biệt hai giống thời điểm khác tính theo phương pháp Student’s t-test (*P , 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001) (C) Nhiệt độ phịng độ ẩm khơng khí Kết cho thấy, trì tỷ lệ thành phần nước đậu gà ILC482 cao so với đậu gà Hashem thời điểm xử lý nước (Hình 3.16B) Sự trì tỷ lệ thành phần nước cao giống đậu gà ILC482 so với Hashem điều kiện xử lý nước, nguyên nhân giúp cho đậu gà ILC482 có khả chịu hạn tốt so với giống Hashem trước [104], [105] Qua kết này, muốn đánh giá xem liệu trì nước khác giống chịu hạn tốt ILC482 giống chịu hạn Hashem có liên quan tới biểu khác gen CaNAC hay khơng phân tích đặc trưng biểu gen CaNAC rễ đậu gà ILC482 Hashem sau xử lý nước thời điểm sử dụng kỹ thuật qRT-PCR 3.2.2 Đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý hạn Theo kết nghiên cứu trước [43], dựa vào việc phân tích phát sinh chủng loại có sử dụng số protein AtNAC OsNAC biết rõ chức liên quan đến bất lợi đặc biệt stress hạn, nhận thấy có 23 gen CaNAC dự đốn có liên quan tới bất lợi Để xác định gen CaNAC đáp ứng với nước lựa chọn cho phân tích chức mức độ sâu hơn, [43] sử kiểm tra biểu 23 gen CaNAC rễ giống đậu gà Hashem sau xử lý nước thời điểm qRT-PCR Kết cho thấy có 19 tổng số 23 gen CaNAC thay đổi 85 biểu đáng kể và/hoặc rễ giống Hashem điều kiện xử lý nước, điều cho thấy gen giữ vai trị quan trọng q trình đáp ứng với điều kiện hạn hán đậu gà [43] Với việc tìm 19 gen CaNAC thay đổi mức độ biểu giống đậu gà Hashem, kết hợp với kết so sánh trì nước hai giống đậu gà chịu hạn tốt ILC482 giống chịu hạn Hashem, lựa chọn 19 gen CaNAC để kiểm tra mức độ biểu chúng rễ giống chịu hạn tốt ILC482 sau xử lý nước nào, từ nhằm tìm mối tương quan đặc trưng biểu gen CaNAC giống đậu gà chịu hạn tốt ILC482 giống chịu hạn Hashem điều kiện xử lý nước Bảng 3.2 Mức độ biểu gen CaNAC giống đậu gà chịu hạn tốt ILC482 chịu hạn Hashem điều kiện xử lý nước ILC482 Gene CaNAC02 CaNAC04 CaNAC05 CaNAC06 CaNAC16 CaNAC19 CaNAC21 CaNAC24 CaNAC27 CaNAC40 CaNAC41 CaNAC43 CaNAC44 CaNAC46 CaNAC47 CaNAC50 CaNAC52 CaNAC57 CaNAC67 Fc -1.42 -1.14 3.39 13.61 9.08 1.95 -1.21 -3.83 -1.32 2.62 2.05 2.99 2.00 3.29 7.40 2.59 1.33 1.39 49.29 2h P-value 0.05106 0.26645 0.02610 0.01292 0.00097 0.03314 0.13293 0.00001 0.29991 0.00624 0.00269 0.00494 0.02238 0.00171 0.00055 0.00043 0.00309 0.00088 0.00011 Hashem 5h 2h 5h Fc P-value Fc P-value Fc P-value -9.17 0.00469 -2.07 0.00752 -23.86 0.00157 -4.16 0.00137 -2.38 0.00037 -28.57 0.00121 2.01 0.07635 1.26 0.10376 2.11 0.00344 131.29 0.00006 36.17 0.03415 235.02 0.00580 45.57 0.00099 1.82 0.01889 3.61 0.00135 8.61 0.01979 2.02 0.01411 3.77 0.00045 3.10 0.00052 1.31 0.16347 3.38 0.00018 2.14 0.01024 -3.06 0.00001 1.45 0.14400 5.16 0.02103 1.32 0.12226 2.37 0.00099 5.02 0.00263 1.77 0.02495 2.70 0.00014 4.48 0.00317 1.74 0.01117 3.84 0.00006 5.63 0.00750 1.28 0.19070 2.12 0.00058 1.22 0.24806 1.45 0.03113 -1.45 0.05871 -1.84 0.00992 1.87 0.06866 -2.35 0.04115 6.54 0.00493 3.65 0.00759 1.69 0.29182 2.75 0.02719 2.28 0.01893 2.15 0.00633 6.67 0.00067 1.14 0.16492 4.48 0.00564 12.38 0.00153 2.14 0.03178 8.17 0.00010 330.08 0.00589 26.97 0.0036 319.57 7.9E-07 Chú thích: Giá trị chữ màu xanh đỏ quy định giảm tăng mức độ biểu thỏa mãn với điều kiện mức độ biểu ≥|2| P-value < 0.05; Fc, mức độ biểu tính theo cơng thức 2-△△Ct 86 Trước tiên, chúng tơi phân tích để làm rõ mức độ biểu 19 gen CaNAC mẫu rễ giống đậu gà chịu hạn Hashem sau xử lý nước thời điểm trước [43] Kết phân tích qRT-PCR cho thấy phần lớn CaNAC đáp ứng với nước và/hoặc rễ đậu gà Hashem dựa mức độ biểu chúng bị thay đổi lần với giá trị P-value < 0.05 (Bảng 3.2 3.3; Hình 3.17 3.18) Hình 3.17 Mức độ biểu 19 gen CaNAC giống chịu hạn Hashem giống chịu hạn tốt ILC482 điều kiện xử lý nước Chú thích: Mức độ biểu gen CaNAC giống Hashem 87 ILC482 kết qRT-PCR mẫu sau ngâm nước (đối chứng) xử lý nước thời điểm Mức độ biểu mặc định so sánh với giá trị đối chứng ngâm nước thời điểm Mức độ biểu gen tính từ mẫu riêng biệt/mỗi xử lý Các dấu hoa thị biểu sai khác có ý nghĩa thống kê sử dụng phương pháp Student’s t-test (*P