Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA MƠI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực MSSV: 1151110242 : TRẦN THỊ YẾN NHI Lớp: 11DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đề tài nghiên cứu cá nhân em Những kết số liệu báo cáo tốt nghiệp thực Viện sinh học nhiệt đới phịng thí nghiệm trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, khơng chép nguồn khác Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tất q thầy tận tình dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt q trình học tập trường Đó hành trang quý giá giúp em hòa nhập tốt vào xã hội, góp phần sức lực nhỏ bé vào cơng xây dựng đất nước Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp HCM anh chị phụ trách phịng hoạt chất có hoạt tính sinh học tạo điều kiện hướng dẫn em hồn thành số thí nghiệm q trình nghiên cứu Chân thành cảm ơn thầy phòng thí nghiệm cơng nghệ sinh học tất bạn phịng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ lúc thực đề tài Con xin gửi tình thương u lịng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, người gia đình người bên cạnh sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động viên chỗ dựa tinh thần vững cho bước đường Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ x CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Tình hình nghiên cứu 1.3 Mục đích nghiên cứu 1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu 1.5 Phương pháp nghiên cứu 1.6 Các kết đạt đề tài 1.7 Kết cấu đồ án CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung enzyme 2.1.1 Sơ lược enzyme 2.1.2 Tính chất enzyme 2.1.2.1 Bản chất sinh học 2.1.2.2 Bản chất hóa học 2.2 Giới thiệu sơ lược cellulose 2.3 Giới thiệu sơ lược enzyme cellulase 2.3.1 Định nghĩa 2.3.2 Phân loại 10 2.3.3 Tính chất 10 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.1 Tính đặc hiệu 10 2.3.3.2 Đặc tính vật lý hóa học 10 2.3.3.3 Các chất ức chế 10 2.3.4 Cơ chế tác động enzyme 11 2.3.4.1 Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) 11 2.3.4.2 Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) 11 2.3.4.3 Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) .12 2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 12 2.3.5.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 12 2.3.5.2 Nhiệt độ nuôi cấy 13 2.3.5.3 pH môi trường 14 2.3.5.4 Độ ẩm 14 2.3.5.5 Mơi trường khơng khí 14 2.3.6 Ứng dụng enzyme cellulase 14 2.3.6.1 Cải thiện giá trị dinh dưỡng thức ăn gia súc .14 2.3.6.2 Tăng hiệu suất trích ly chất từ nguyên liệu thực vật 15 2.3.6.3 Thủy phân gỗ phế liệu giàu cellulose 15 2.4 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15 2.4.1 Nấm sợi 15 2.4.2 Nấm mốc Trichoderma koningii 16 2.5 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase 17 2.5.1 Bã mía 17 2.5.2 Cám gạo 17 2.6 Phương pháp lên men bề mặt 19 ii Đồ án tốt nghiệp 2.7 Giới thiệu sơ lược phương pháp tách chiết tinh enzyme 20 2.8 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22 2.8.1 Xác định hoạt tính exoglucanase 23 2.8.2 Xác định hoạt tính endoglucanase 23 2.9 Sơ lược sắc ký lọc gel 24 2.9.1 Bản chất phương pháp 24 2.9.2 Đặc tính gel 25 2.10 Sơ lược phân tách protein điện di gel polyacrylamide 26 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 3.2 Vật liệu 28 3.2.1 Nguồn vi sinh vật 28 3.2.2 Cơ chất 28 3.2.3 Hóa chất 28 3.3 Thiết bị dụng cụ 29 3.3.1 Thiết bị 29 3.3.2 Dụng cụ 30 3.4 Môi trường 31 3.5 Nội dung phương pháp nghiên cứu 31 3.5.1 Phương pháp phân tích độ ẩm chất 31 3.5.2 Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy .32 3.5.3 Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii 32 3.5.3.1 Cấy giống môi trường thạch nghiêng PGA .32 3.5.3.2 Nhân giống môi trường lúa 33 iii Đồ án tốt nghiệp 3.5.3.3 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase 34 3.5.4 Phương pháp mơ tả hình thái T koningii 35 3.5.5 Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu 36 3.5.6 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô 36 3.5.7 Khảo sát khả phân hủy cellulose 36 3.5.8 Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford 37 3.5.9 Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) 40 3.5.10 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase .42 3.5.10.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất 43 3.5.10.2 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm môi trường ban đầu .43 3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu 44 3.5.10.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dinh dưỡng 45 3.5.10.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 45 3.5.10.6 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống 45 3.5.11 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 46 3.5.12 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dịch enzyme dung môi tủa enzyme 47 3.5.12.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dịch enzyme dung môi tủa 47 3.5.12.2 Khảo sát ảnh hưởng loại dung môi tủa enzyme .48 3.5.13 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.3 Hoạt tính enzyme cellulase dịch chiết thô 48 iv Đồ án tốt nghiệp 3.5.14 Phương pháp tinh enzyme cellulase sắc ký lọc gel 49 3.5.14.1 Nguyên tắc 49 3.5.14.2 Hóa chất dụng cụ 49 3.5.14.3 Tiến hành thí nghiệm 49 3.5.15 Phương pháp điện di phân tách protein gel polyacrylamide .51 3.5.16 Phương pháp bố trí xử lý số liệu 55 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1 Khảo sát hình thái đại thể vi thể chủng T.koningii .56 4.2 Khả sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose đĩa thạch 57 4.3 Kết định lượng mốc giống buồng đếm hồng cầu 57 4.4 Kết xác định độ ẩm chất 58 4.5 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase môi trường lên men bán rắn 59 4.5.1 Ảnh hưởng tỷ lệ BM:CG đến khả sinh tổng hợp cellulase 59 4.5.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến khả sinh tổng hợp cellulase 60 4.5.3 Ảnh hưởng pH ban đầu khả sinh tổng hợp cellulase 61 4.5.4 Ảnh hưởng nồng độ dinh dưỡng đến khả sinh tổng hợp cellulase 62 4.5.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase 64 4.5.6 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp cellulase 65 4.6 Quy hoạch thực nghiệm 66 4.7 Khảo sát tỷ lệ tủa chọn loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt 71 v Đồ án tốt nghiệp 4.7.1 Khảo sát tỷ lệ tủa dịch chiết enzyme dung môi ethanol 71 4.7.2 Khảo sát tỷ lệ tủa dịch chiết enzyme dung môi acetone 73 4.7.3 Khảo sát chọn dung môi tủa enzyme tối ưu 74 4.8 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 75 4.8.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase 75 4.8.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 76 4.9 Tinh enzyme cellulase sắc lọc gel 77 4.10 Kết phân tách hệ cellulase phương pháp điện di gel SDS – PAGE 79 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 5.1 Kết luận 82 5.2 Kiến nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC vi Đồ án tốt nghiệp BM:CG CBB CMC CMCase DNS DTT EC FPA HEC HL HT HTR MT MW NĐC OD PGA SDS – PAGE : Electrophoresis T koningii TEMED U VSV vii Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 18 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống kết phụ lục 17 ANOVA Table Source Between groups Within groups Total (Corr.) Summary Statistics Cou Total Phụ lục 19 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy kết phụ lục 17 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan 97 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 20 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm Nghiệm thức 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 98 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 21 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm kết phụ lục 20 ANOVA Table Source Between groups Within groups Total (Corr.) Summary Statistics 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Total 99 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 22 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm kết phụ lục 20 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan 13 10 14 15 16 11 12 18 17 19 100 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 23 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung mơi ethanol đến hoạt tính enzyme cellulase Nghiệm thức (1:1) (1:2) (1:3) (1:4) (1:5) (1:6) (1:7) Phụ lục 24 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi ethanol kết phụ lục 23 ANOVA Table Source Between groups Within groups Total (Corr.) Summary Statistics ty le 1:1 ty le 1:2 ty le 1:3 ty le 1:4 ty le 1:5 ty le 1:6 ty le 1:7 Total 101 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 25 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi ethanol kết phụ lục 23 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan ty le 1:1 ty le 1:2 ty le 1:7 ty le 1:3 ty le 1:6 ty le 1:5 ty le 1:4 Phụ lục 26 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung mơi acetone đến hoạt tính enzyme cellulase Nghiệm thức (1:1) (1:2) (1:3) (1:4) (1:5) (1:6) (1:7) Phụ lục 27 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi acetone kết phụ lục 26 ANOVA Table Source Between groups Within groups Total (Corr.) 102 Đồ án tốt nghiệp Summary Statistics Count ty le 1:1 ty le 1:2 ty le 1:3 ty le 1:4 ty le 1:5 ty le 1:6 ty le 1:7 Total Phụ lục 28 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi acetone kết phụ lục 26 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan ty le 1:1 ty le 1:2 ty le 1:7 ty le 1:6 ty le 1:5 ty le 1:3 ty le 1:4 103 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 29 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase Nghiệm thức (pH 4) (pH 5) (pH 6) (pH7) (pH 8) Phụ lục 30 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 29 ANOVA Table Source Between groups Within groups Total (Corr.) Summary Statistics Count pH pH pH pH pH Total 104 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 31 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 29 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan pH pH pH pH pH Phụ lục 32 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase Nghiệm thức 30°C 40°C 50°C 60°C 70°C Phụ lục 33 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 32 ANOVA Table Source Between groups Within groups Total (Corr.) Summary Statistics 105 Đồ án tốt nghiệp Count 30°C 40°C 50°C 60°C 70°C Total Phụ lục 34 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 32 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan 70°C 30°C 60°C 40°C 50°C 106 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 35 Một số hình ảnh máy móc, thiết bị sử dụng nghiên cứu Hình P1 Máy ly tâm Hình P2 Kính hiển vi quang học Hình P4 Buồng đếm hồng cầu Hình P3 Autoclave Hình P5 Cân phân tích 107 Đồ án tốt nghiệp Hình P6 Kính hiển vi điện tử Hình P7 Bể ủ nhiệt Hình P8 Hệ thống máy sắc ký cột Hình P9 Thiết bị điện di đứng Hình P10 Máy đo quang phổ kế UV – Vis 108 Hình P11 Tủ sấy Đồ án tốt nghiệp Hình P12 Bếp điện Hình P13 Máy đo pH Phụ lục 36 Hình ảnh thí nghiệm a b Hình P14 Mơi trường lên men bán rắn trước cấy nấm T koningii (hình a) sau cấy nấm 48 (hình b) cellulase 109 ... 15 2.4 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15 2.4.1 Nấm sợi 15 2.4.2 Nấm mốc Trichoderma koningii 16 2.5 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase 17... cellulase từ nấm Trichoderma koningii cách tối ưu 1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu - Quan sát đại thể vi thể hình thái nấm mốc Trichoderma koningii - Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma. .. Thu enzyme cellulase - Có thơng số tối ưu trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Trichoderma koningii Đồ án tốt nghiệp - Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase phương pháp kết tủa - Tinh enzyme cellulase