BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC TRICHODERMA SPP Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : KS ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực : LÊ NGỌC MỸ MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02 TP Hồ Chí Minh, 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không chép đồ án/khóa luận tốt nghiệp người khác hình thức Đây nghiên cứu hồn tồn riêng tôi, số liệu đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực chưa cơng bố tác giả Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp em áp dụng lý thuyết học vào thực tế thêm kinh nghiệm bổ ích cho cơng việc sau Em xin chân thành cảm ơn : Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM cho phép em làm đồ án tốt nghiệp Viện, cung cấp thiết bị, máy móc đại giúp ích nhiều cho việc thực đồ án Ks Đỗ Thị Tuyến hướng dẫn, giúp đỡ cho em tận tình, giải thích thắc mắc thực đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ tài liệu để em hoàn thành đồ án cách tốt Các thầy cô khoa Môi trường Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ TP.HCM tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em năm học vừa qua Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đồng hành, chia sẽ, động viên Các bạn Viện bạn Nguyễn Thị Hoài An giúp đỡ em thực tốt đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC TRICHODERMA SPP Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : KS ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực : LÊ NGỌC MỸ MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02 TP Hồ Chí Minh, 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không chép đồ án/khóa luận tốt nghiệp người khác hình thức Đây nghiên cứu hoàn toàn riêng tơi, số liệu đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực chưa cơng bố tác giả Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp em áp dụng lý thuyết học vào thực tế thêm kinh nghiệm bổ ích cho cơng việc sau Em xin chân thành cảm ơn : Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM cho phép em làm đồ án tốt nghiệp Viện, cung cấp thiết bị, máy móc đại giúp ích nhiều cho việc thực đồ án Ks Đỗ Thị Tuyến hướng dẫn, giúp đỡ cho em tận tình, giải thích thắc mắc thực đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ tài liệu để em hoàn thành đồ án cách tốt Các thầy cô khoa Môi trường Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Cơng nghệ TP.HCM tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em năm học vừa qua Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đồng hành, chia sẽ, động viên Các bạn Viện bạn Nguyễn Thị Hoài An giúp đỡ em thực tốt đồ án tốt nghiệp ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ viii LỜI MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Kết cấu Đồ án Tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chất xylan, enzyme xylanase 1.1.1 Cơ chất xylan 1.1.2 Hệ enzyme xylanase 1.1.3 Hệ xylanase Trichoderma spp 1.1.4 Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan 1.2 Giới thiệu chung nấm sợi Trichoderma spp 1.2.1 Phân loại Trichoderma spp 1.2.2 Đặc điểm sinh học Trichoderma spp 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Trichoderma spp 1.2.4 Một số ứng dụng Trichoderma 1.3 Vai trò giống công nghệ sản xuất enzyme 1.4 Yêu cầu giống vi sinh vật công nghệ enzyme 10 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5 2013 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp 1.5.1 Bã mía 1.5.2 Cám mì 1.6 Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận đến sinh tổng hợp xylanase điều kiện nuôi cấy bán rắn 1.6.1 Độ ẩm môi trường nuôi cấy 1.6.2 Sự thông kh 1.6.3 Nguồn carb 1.6.4 Nguồn nitr 1.6.5 pH 1.6.6 Các nguyên tố khoáng 1.7 Phƣơng pháp tách chiết tinh chế 1.8 Sợ lƣợc sắc ký lọc gel 1.8.1 Bản chất phương pháp 1.8.2 Đặc tính gel CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Hóa chất 2.2.2 Thiết bị 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu khả sinh mốc Trichoderma spp 2.3.1 Phương pháp mơ tả hình thái Trichoderma 2.3.2 Xác định số lượng bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu 2.3.3 Phương ph ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3.4 Quy trình khảo sát số yếu tố 21 2.3.5 Thuyết minh quy trình 22 2.4 Bố trí thí nghiệm 24 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase 24 2.4.2 Khảo sát tác nhân tủa enzyme xylanase 26 2.4.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase 30 2.5 Phƣơng pháp xác định tiêu nghiên cứu xử lí kết 34 2.5.1 Phương pháp xác định tiêu nghiên cứu 34 2.5.2 Xử lý số liệu 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38 3.1 Quan sát hình thái Trichoderma spp mơi trƣờng PGA 38 3.1.1 Quan sát đại thể 38 3.1.2 Quan sát vi thể 39 3.2 Định tính enzyme xylanase Trichoderma spp 40 3.3 Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp 41 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase Trichoderma spp 41 3.5.1 3.5.2 Khảo sát dung môi tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase 51 Khảo sát trình tinh enzyme xylanase từ dịch chiết phương pháp kết tủa 53 3.5.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase .58 3.6 Tinh enzyme xyalanse phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel 60 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 4.1 Kết luận 62 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 4.2 Đề nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC A PHỤ LỤC B PHỤ LỤC C iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BM Bã mía CM Cám mì DNS Acid 2-hydroxyl-3,5-dinitrobenzoic DC Dịch chiết HT Hoạt tính HL Hàm lƣợng HTR Hoạt tính riêng IU (UI) Unit Internation, đơn vị quốc tế v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 DANH MỤC BẢNG STT Bảng 1 10 11 12 13 14 15 16 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 17 18 19 20 vii 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC HÌNH STT H 1 3 DANH MỤC ĐỒ THỊ STT Đồ 3 3 viii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 10 11 12 13 14 15 ix ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, cơng nghệ vi sinh – hóa sinh phát triển nhanh chóng tạo điều kiện cho nghiên cứu phát triển, giúp ứng dụng vào thực tế nông nghiệp nhƣ cơng nghiệp thực phẩm có hiệu Việc sử dụng chế phẩm enzyme nông nghiệp công nghiệp thực phẩm đƣợc sử dụng nhiều thực tế sản xuất nhằm nâng cao chất lƣợng nhƣ suất sản phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme chế phẩm enzyme ngày đƣợc quan tâm nhiều Việt Nam nƣớc nhiệt đới có nơng nghiệp phát triển, phong phú đa dạng đà phát triển mạnh Lƣợng phế phẩm phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp dồi nhƣng lại không đƣợc xử lý mức Theo chất thải hữu gia tăng lên khơng ngừng Trong phụ liệu nhà máy mía đƣờng ví dụ điển hình chiếm khoảng 20% mía ngun liệu Theo đánh giá ngành mía đƣờng, cơng suất nhà máy 1000 tấn/ngày ngày nhà máy thải mơi trƣờng khoảng 25 bã mía gây nhiễm nghiêm trọng Chính thế, có nhiều hƣớng giải lƣợng bã mía sau sản xuất số nhà máy sử dụng bã mía làm nhiên liệu đốt lị hơi, cách lãng phí mà lại nhiễm mơi trƣờng sống Cịn nhà máy khác lại cố gắng tận dụng bã mía vào mục đích tốt nhƣ làm ván ép, thức ăn gia súc…Nhƣng biện pháp chƣa khả thi thành phần ván ép từ bã mía chƣa tốt bền nhƣ ván ép từ gỗ, thức ăn gia súc không thực đảm bảo nguồn dinh dƣỡng cho vật ni nhƣ tốn nhiều chi phí cho sản xuất Nếu để lâu bã mía bị vi sinh vật mùn hóa, lúc làm phân bón cho trồng nhƣng phải thời gian lâu để vi sinh vật phân hủy khơng có khả giải đƣợc thực trạng lƣợng bã mía tồn đọng ngày nhiều, hao tốn diện tích Enzyme protein đặc biệt đƣợc sinh vật tổng hợp tham gia phản ứng sinh hóa, thành phần thiếu tế bào sinh vật Chúng đóng vai trị định mối quan hệ thể sống môi trƣờng ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cuối kỷ 19 suốt kỷ 20, ngành công nghệ enzyme phát triển phát triển thành ngành công nghiệp sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống vi sinh vật Công nghệ sản xuất enzyme đem lại thuận lợi to lớn cho nhiều nƣớc Từ lâu, xylanase đƣợc ứng dụng nhiều công nghệ thực phẩm nhƣ: làm bánh mỳ, nƣớc hoa quả, rƣợu vang, bia, thu nhận đƣờng xylose Xylanase đã, ngày đƣợc bổ sung nhiều vào thức ăn chăn nuôi Kết cho thấy, bổ sung xylanase cách độc lập hay kết hợp với enzyme khác vào thức ăn làm tăng đáng kể khối lƣợng giảm thiểu bệnh tật vật ni Xylanase có tác dụng phân giải xylan, thành phần quan trọng hemicellulose có nhiều thức ăn vật ni, giải phóng đƣờng xylose xylooligosaccharide dẫn đến làm giảm độ nhớt thức ăn, giúp cho vật ni tiêu hóa hấp thụ chất dinh dƣỡng tốt hơn, cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi Ở Việt Nam, nguồn vi sinh vật sinh enzyme có Xylanase phong phú, phần lớn có nguồn gốc từ nấm vi khuẩn Đây thuận lợi lớn cho phát triển lĩnh vực nghiên cứu sản xuất Xylanase từ vi sinh vật Mặt khác, nƣớc ta nƣớc nông nghiệp nên hàng năm phế phụ phẩm nông nghiệp nhƣ rơm, lõi ngơ, bã mía, bã sắn, vỏ lạc lớn, nguồn cung cấp chất lên men rẻ tiền dễ kiếm Muốn thu đƣợc enzyme có hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, chọn giống vi sinh vật để chọn chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải lựa chọn chất cảm ứng thành phần môi trƣờng tối ƣu nhƣ tiêu chuẩn hóa điều kiện ni cấy Ở Việt Nam nay, công nghệ enzyme chƣa phát triển, nguồn enzyme hạn chế phụ thuộc vào enzyme nhập từ nƣớc ngồi Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển công nghệ enzyme để ứng dụng vào công nghiệp, đời sống cần thiết ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Từ lý xây dựng đề tài: “Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme xylanase tinh sắc ký lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp.” Mục đích nghiên cứu Tìm môi trƣờng tốt để chủng nấm mốc Trichoderma spp thực tối ƣu hóa mơi trƣờng Tinh enzyme xylanase đƣợc thu nhận từ nấm mốc Trichoderma spp Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát thành phần môi trƣờng cảm ứng để chủng nấm mốc Trichoderma spp cho hoạt lực enzyme cao Các thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt lực enzyme bao gồm: tỷ lệ cám mì : bã mía, độ ẩm, nồng độ dinh dƣỡng, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống Tách chiết tinh enzyme sắc ký lọc gel Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp Bradford dùng để xác định hàm lƣợng protein Phƣơng pháp Xylose dùng để xác định hoạt tính enzyme xylanase Phƣơng pháp tủa enzyme tác nhân khác Phƣơng pháp tinh enzyme xylanase sắc ký lọc gel Kết cấu Đồ án Tốt nghiệp Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Chƣơng 2: Vật liệu phƣơng pháp Chƣơng 3: Kết biện luận Chƣơng 4: Kết luận kiến nghị ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chất xylan, enzyme xylanase 1.1.1 Cơ chất xylan Xylan thành phần hemicelluloses thực vật, đứng thứ hai sau cellulose chiếm khoảng phần ba nguồn carbon hữu phục hồi trái đất (Prade, 1995) Trong đó, hemicelluloses phức hợp polysaccharide gồm xylan, xyloglucan, glucomannan arabinogalactan (Shallom, D Shoham, Y , 2003) Phức hợp với cellulose, pectin lƣợng nhỏ glycoprotein hợp chất phenolic hình thành vách tế bào sơ cấp Sau đó, vách tế bào sơ cấp đƣợc phát triển thành vách thứ cấp Ngoài thành phần cellulose hemicelluloses, vách thứ cấp cịn có thêm lignin – đƣợc hình thành q trình đồng hóa dẫn xuất phenylpropan nhƣ cumaryl alcohol, coniferyl alcohol sinapyl alcohol tạo nên thành phần polymer vách tế bào thực vật (Kulkarni, N et al, 1999) Ba thành phần cấu trúc vách tế bào thực vật kết hợp với nhờ liên kết cộng hóa trị khơng cộng hóa trị Xylan đƣợc tìm thấy điểm giao lignin cellulose, giao điểm quan trọng gắn kết toàn vẹn vách tế bào thực vật (Beg, Q.K., et al 2001) Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Xylan đƣợc tìm thấy lƣợng lớn gỗ cứng thực vật hạt kín (15 – 30%) gỗ mềm thực vật hạt trần (7 – 10%), nhƣ hàng năm (< 30%) (Singh, S, et al., 2003) Xylan polysaccharide phức, có cấu trúc thay đổi loài thực vật khác Thực vật cạn có xylan chuỗi D-xylose đƣợc nối với liên kết β-1,4-glucoside, tảo biển tổng hợp xylan với cấu trúc khác D-glucose nối với liên kết β-1,3-glucoside Nhìn chung, xylan polysaccharide có cấu trúc gồm đơn vị xylose liên kết với liên kết β1,4-glucoside (Whistler Richards, 1970) Phần lớn xylan heteropolysacharide, có nhóm khác khung sƣờn chuỗi bên (Biely, 1995) Các nhóm phổ biến khung sƣờn xylan acetyl, arabinofuranosyl glucuronysyl (Whitsler Richards, 1970) Với nhóm khác nhƣ vậy, xylan đƣợc phân loại thành homoxylan thẳng, arabinoxylan, acetyxylan, glucuronoxylan glucu-arabinoxylan 1.1.2 Hệ enzyme xylanase Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 khung sƣờn xylan Xylanase đƣợc biết thuộc họ 10 11 (hơn 300 trình tự gen đƣợc biết) khoảng 20 gen xylanase đƣợc xếp vào họ 5, 8, 43 (Shallom, Shoham, 2003) Cho đến nay, có 87 xylanase đƣợc xác định cấu trúc lập thể Hầu hết xylanase vi sinh vật protein đơn phân tử Ngày nay, xylanase đa phân tử ngày đƣợc miêu tả nhiều Những enzyme chứa cấu trúc đƣợc coi vùng xúc tác (catalytic domain) số vị trí gắn với carbohydrate Những enzyme xylanase chứa CBDs có hiệu thủy phân cao chất kết tinh nồng độ cao bề mặt chất lỏng 1.1.3 Hệ xylanase Trichoderma spp Vi sinh vật sinh nhiều loại endoxylanase với đặc tính lý hóa, cấu trúc, hoạt tính hiệu suất đa dạng phức tạp Các chủng Trichoderma sản xuất tất enzyme thủy phân xylan Nhiều loài đƣợc phân tách giải trình tự ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Hệ enzyme thủy phân xylan đƣợc sản xuất chủng Trichoderma, chủ yếu T.reesei, enzyme đƣợc xác định rõ nhóm thủy phân vách tế bào 1.1.4 Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan Xylanase enzyme cảm ứng đƣợc vi sinh vật tiết vào mơi trƣờng ni cấy có mặt xylan chất giàu xylan (Balakrishnan cộng sự, 1997) Xylan polymer cao phân tử xâm nhập vào tế bào Do vậy, sinh tổng hợp xylanase đƣợc cảm ứng chủ yếu phân đoạn xylan nhƣ xylose, xylobiose, xylooligosacharide xylose, có trọng lƣợng phân tử thấp đƣợc tạo môi trƣờng nhờ lƣợng nhỏ enzyme xúc tác (Bastawde 1992, Kulkarni cộng sự, 1999) Nhiều nghiên cứu cho rằng, ligocellulose có cám mì, trấu, bã mía…là yếu tố cảm ứng vi sinh vật sinh xylanase (Beg cộng sƣ, 1998, Puchart cộng sự, 1999) Các loại nấm sợi sử dụng xylan nhƣ nguồn carbon để cảm ứng sinh tổng hợp xylanase 1.2 Giới thiệu chung nấm sợi Trichoderma spp 1.2.1 Phân loại Trichoderma spp Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypoceales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Hình 1.2 Trichoderma spp Có lồi chính: Trichoderma Harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma viride ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 1.2.2 Đặc điểm sinh học Trichoderma spp Trichoderma nấm bất toàn, sinh sản vơ tính cách đính bào tử từ khuẩn ty Khuẩn lạc có màu trắng từ lúc trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm Khuẩn ty không màu, cuống sinh bào tử phân nhiều nhánh, cuối nhánh phát triển thành khối tròn mang bào tử khơng có vách ngăn, khơng màu, liên kết thành chùm nhỏ đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử hình cầu, hình elip hình thn, có thành trơn nhám Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc lớn 9cm sau ngày môi trƣờng thạch đĩa OA (oatmeal agaro) 20ºC 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Trichoderma spp Trichoderma phân bố chủ yếu đất phân hủy gỗ, xác thực vật Các loài Trichoderma thành phần chiếm ƣu hệ vi sinh vật đất với môi trƣờng sống biến đổi đa dạng Trichoderma khó tìm thấy thực vật sống khơng sống nội kí sinh thực vật (Gary J Samuels, 2000) Các chủng Trichoderma spp đƣợc tìm thấy nhiều môi trƣờng tự nhiên, đặc biệt môi trƣờng đất, chúng phát triển nhiều loại chất khác (gỗ, loài nấm khác, …), chúng tồn nồng độ CO mức cao (10%) sống đƣợc đất acid base (pH – 8) Hầu hết loài Trichoderma sống hoại sinh, thƣờng gặp xác bã thực vật, nơi ẩm ƣớt… Trichoderma sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác từ carbonhydrate, amino acid đến ammonia Theo Garrett (1956), khả cạnh tranh dinh dƣỡng cao Trichoderma spp Do đặc tính sau: - Sinh trƣởng mạnh bào tử nảy mầm nhanh - Có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân cao - Có khả tạo chất kháng sinh - Chịu đƣợc chất kháng sinh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Các lồi Trichoderma spp khác u cầu nhiệt độ độ ẩm khác Chẳng hạn nhƣ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả sống mơi trƣờng có độ ẩm cao, Trichoderma viride Trichoderma polysporum thích hợp nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum phân bố vùng có khí hậu ấm áp 1.2.4 Một số ứng dụng Trichoderma 1.2.4.1 Bảo vệ thực vật Trichoderma đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân kiểm sốt sinh học Chúng có khả ức chế phát triển nhiều loại nấm gây bệnh thực vật, đồng thời kích thích tăng trƣởng trồng Q trình kiểm sốt sinh học Trichoderma theo chế sau: Sự kí sinh nấm: Trichoderma có khả cảm ứng tiết lƣợng lớn enzyme chitinase, glucanase, cellulose, protease… thủy phân vách tế bào sợi nấm gây bệnh làm cho chúng không phát triển đƣợc bị tiêu diệt Khả tiết kháng sinh: Trichoderma cịn có khả tiết số chất kháng sinh dễ bay không bay số hợp chất ức chế tăng trƣởng Ngoài ra, Trichoderma có khả cạnh tranh chất dinh dƣỡng không gian, làm bất hoạt hệ enzyme nấm gây bệnh 1.2.4.2 Cải thiện suất trồng Ngày nay, nƣớc có cơng nghiệp phát triển có xu hƣớng sử dụng phân bón hữu sinh học hệ mới, thực chất kết hợp phân bón vi sinh thuốc trừ sâu sinh học, dựa sở đấu tranh sinh học để khắc phục hạn chế sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu mà cho xuất trồng Khi khảo sát loài Trichoderma lớp đất sâu, ngƣời ta thấy Trichoderma làm tăng số lƣợng rễ nằm sâu đất, điều góp phần giúp lƣơng thực nhƣ ngơ có khả chống chịu hạn tốt Vài lồi Trichoderma có khả kích thích nẩy mầm hoa Đã có nhiều cơng trình khoa học chứng minh Trichoderma harzianum ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Trichoderma koningii kích thích nẩy mầm tăng trƣởng Đối với hoa đƣợc trồng nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy mạnh hoa cách rút ngắn ngày hoa hay tăng số lƣợng hoa 1.2.4.3 Xử lý nhiễm mơi trường Trichoderma harzianum có khả làm giảm bớt tập trung hợp chất tự 2, 4, 6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol alcohol oxidase mơi trƣờng chứa muối khống Trichoderma harzianum CCT – 4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion đất 24 giờ, tiềm tốt để xử lý sinh học hóa chất nhiễm đất đầm lầy Trichoderma reesei Rut-30 xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn nguồn sản xuất enzyme cellulose rẻ tiền, đồng thời giảm lƣợng rác thải 1.2.4.4 Các lĩnh vực khác Các enzyme ngoại bào đƣợc tổng hợp từ Trichoderma bao gồm cellulase, hemicellulase, đƣợc ứng dụng rỗng rãi nhiều ngành công nghiệp nhƣ: sản xuất thức ăn gia súc, sản phẩm thực phẩm đồ uống, công nghiệp dệt sản xuất giấy… 1.3 Vai trị giống cơng nghệ sản xuất enzyme Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trị định: - Giống vi sinh vật định đến suất enzyme - Giống vi sinh vật ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm sinh học (hay hoạt tính enzyme) - Giống vi sinh vật định vốn đầu tƣ cho sản xuất - Giống vi sinh vật định giá thành cho sản phẩm Nhƣ giống vi sinh vật có ý nghĩa to lớn phát triển công nghệ vi sinh vật ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.4 2013 Yêu cầu giống vi sinh vật công nghệ enzyme Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm cơng nghệ lên men đại đƣợc sản xuất theo quy mô công nghiệp Do giống vi sinh vật ứng dụng cơng nghệ enzyme cần có u cầu chuẩn mực định Đó là: Giống vi sinh vật phải tạo sản phẩm mà ta mong muốn Sản phẩm phải có số lƣợng chất lƣợng cao sản phẩm phụ khác Vì trình trao đổi chất, để chuyển hóa khối lƣợng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần thể khoảng thời gian ngắn thể vi sinh vật cần tổng hợp nhiều chất tạo nhiều loại sản phẩm khác Chính giống vi sinh vật dùng cho sản xuất sản phẩm đó, sản phẩm phải trội sản phẩm khác số lƣợng chất lƣợng Cho suất sinh học cao Có khả thích nghi nhanh phát triển mạnh điều kiện sản xuất cơng nghiệp Có khả đồng hóa nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm địa phƣơng nơi nhà máy hoạt động Giống sử dụng trình sản xuất đại phải vi sinh vật khiết, có tốc độ sinh sản nhanh Có tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo sản phẩm mong muốn, dễ tách sản phẩm khỏi tạp chất Ổn định bảo quản dễ dàng bảo quản Để tạo thuận lợi chủng giống vi sinh vật cung cấp cho trình lên men cơng nghiệp ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật khiết 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5 2013 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase 1.5.1 Bã mía Thành phần hóa học bã mía Bã mía (sản phẩm trình ép mía) phế liệu chiếm nhiều sản xuất đƣờng Từ 100 mía đƣa vào nhà máy, ta có 10 – 12 đƣờng, 23 – 28 bã mía, – rỉ, 1,5 – bùn lọc Bã mía sau ép thƣờng ngậm 45 – 50 % nƣớc Ngoài nƣớc bã mía cịn chứa thành phần chất xơ chủ yếu cellolose Các chất hòa tan nƣớc (nƣớc nƣớc thẩm thấu nƣớc mía nguyên chất) gồm đƣờng chất tạp khác, chất hòa tan chiếm số lƣợng nhỏ từ đến 4% Thành phầ Cellulose Hemicellulo Lipid sá Chất khoán Lignin Silic Bảng 1.1 Thành phần hóa học bã mía (A.G.Keller, 1964) 1.5.2 Cám mì Cám mì sản phẩm phụ cơng nghiệp chế biến bột mì Bảng 1.2 Thành phần hóa học cám mì 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cám mì loại thức ăn tốt cho gia súc So với cám gạo, cám mì có hàm lƣợng protein cao (bình qn 15,5%), dầu (bình qn 4%), – 10% xơ thơ với độ ẩm 11 – 14%, lƣợng trao đổi 2420 Kcal/g Cám mì thƣờng có hai loại: loại có màu vàng nâu nhạt, hoàn toàn cám; loại màu ngà trắng, ngồi vỏ cám cịn lẫn tinh bột 1.6 Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase điều kiện nuôi cấy bán rắn Ngày nay, nuôi cấy vi sinh vật môi trƣờng bán rắn đƣợc quan tâm sử dụng rộng rãi nhằm tăng giá trị cho sản phẩm từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phế liệu nông nghiệp chất thải công nghiệp Canh trƣờng bán rắn sau ngừng nuôi cấy đem nghiền nhỏ, sấy khơ, đơng khơ đến độ ẩm – 12% để sử dụng nhƣ chế phẩm enzyme thô Lên men bán rắn sinh trƣởng vi sinh vật chất ẩm Ở đây, vi sinh vật phát triển bao phủ bề mặt môi trƣờng rắn, nguồn dinh dƣỡng (cám mì, bã mía…) đƣợc làm ẩm dùng làm mơi trƣờng Vi sinh vật sử dụng chất dinh dƣỡng mơi trƣờng oxy khơng khí để tạo hệ sợi nấm phát triển, tổng hợp enzyme hoàn thành say khoảng 36 – 40 giờ, có lâu tùy chủng Để tăng tổng hợp số enzyme ngƣời ta thêm vào canh trƣờng số chất cảm ứng cần thiết Ngoài ra, để cấu trúc đƣợc thoáng, ngƣời ta bổ sung thêm trấu, mùn cƣa… Song, thêm nhiều 15 – 20%, chúng làm nghèo dinh dƣỡng môi trƣờng Vậy cần bổ sung nguồn nitrogen vô cơ, phosphor… 1.6.1 Độ ẩm môi trường nuôi cấy Độ ẩm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng trao đổi chất vi sinh vật mà cịn ảnh hƣởng đáng kể đến đặc tính lý hóa chất Độ ẩm mơi trƣờng lên men bán rắn đƣợc thể qua hàm lƣợng nƣớc chất rắn, ảnh hƣởng đến áp suất thẩm thấu chất tan chất 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Các chất khác có khả giữ nƣớc khác Do đó, trình lên men bán rắn đƣợc thực với hàm lƣợng nƣớc chất khác từ 30 – 80% Độ ẩm thích hợp để thu canh trƣờng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao 53 – 70% tùy thuộc đặc điểm sinh lý chủng giống, thành phần, cấu trúc học môi trƣờng điều kiện nuôi cấy Trong nuôi cấy bán rắn, độ ẩm q cao cản trở thống khí, làm giảm hoạt động sống vi sinh vật Nhiều nghiên cứu cho thấy, nấm mốc xạ khuẩn phát triển tốt mơi trƣờng xốp có độ ẩm từ 60 – 65% 1.6.2 Sự thơng khí Vi sinh vật tổng hợp xylanase thƣờng hiếu khí, độ thơng khí mơi trƣờng ảnh hƣởng lớn đến q trình tổng hợp enzyme chúng Trong nuôi cấy bán rắn, việc cung cấp oxy thƣờng thuận lợi, phụ thuộc độ xốp chất, độ dày môi trƣờng, nhiệt độ độ thống khí phịng ni cấy Trong yếu tố trên, độ xốp chất độ dày lớp môi trƣờng chủ yếu quan trọng 1.6.3 Nguồn carbon Nguồn carbon thành phần dinh dƣỡng sinh trƣởng phát triển vi sinh vật Khi nuôi cấy bán rắn theo hƣớng tận dụng phế phụ liệu nên lựa chọn chất vừa nguồn carbon vừa chất cảm ứng 1.6.4 Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen nguồn dinh dƣỡng bản, thiết yếu vi sinh vật ảnh hƣởng rõ đến sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật Nitrogen vơ dạng muối nitrat amonium Đối với nấm sợi, muối nitrat nguồn nitrogen thích hợp để sinh tổng hợp enzyme Muối làm kiềm hóa mơi trƣờng, tạo điều kiện thuận lợi cho tạo thành enzyme Muối amonium, đƣợc đồng hóa tạo nên aniom vơ làm thấp pH môi trƣờng Điều ức chế vi sinh vật mà cịn làm hoạt tính enzyme sau tạo thành 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Nguồn nitrogen hữu hợp chất hữu phức tạp nhƣ dịch nấm men, nƣớc chiết đậu nành… 1.6.5 pH pH mơi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến phát triển khả sinh tổng hợp xylanase vi sinh vật, lồi vi sinh vật khác có ảnh hƣởng khác Sự sinh trƣởng vi sinh vật làm thay đổi đáng kể pH chất Sự thay đổi phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động trao đổi chất vi sinh vật khả đệm chất rắn Tuy nhiên, pH khó kiểm sốt mơi trƣờng lên men bán rắn Ngƣỡng pH thích hợp cho loại nấm mốc từ – 1.6.6 Các nguyên tố khoáng Nhu cầu chất khoáng vi sinh vật ít, nhƣng thiếu Nhu cầu không giống loài, giai đoạn phát triển vi sinh vật theo nghiên cứu, Nguyễn Lân Dũng, 2007 nhận thấy nồng độ cần thiết chất khoáng vi nấm thƣờng thay đổi phạm vi nhƣ bảng 1.3 Chất khoáng K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O FeSO4.7H2O Na2MoO4 ZnSO4.7H2O CoCl2 CaCl2 CaSO4.5H2O Bảng 1.3 Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm mốc xạ khuẩn 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.7 2013 Phƣơng pháp tách chiết tinh chế phẩm enzyme Trong thể sinh vật, enzyme có tế bào chất tế bào Các phân tử enzyme khơng có khả qua màng tế bào Do để chiết rút enzyme nội bào trƣớc hết cần phá vỡ cấu trúc tế bào Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học (nghiền với bột thủy tinh đồng hóa thiết bị đồng hóa) tác dụng dung mơi hữu (rƣợu butylic, aceton, glycerin…) sóng siêu âm Việc tách enzyme khỏi tế bào gặp nhiều khó khăn, tách chúng phải lƣu ý: - Enzyme có tế bào vi sinh vật với lƣợng không lớn so với thành phần khác Do việc tách để thu nhận thành phần nhỏ việc khó khăn Enzyme chất hữu không bền, chúng dễ bị biến tính chịu tác động bên ngồi - Enzyme protein mà protein enzyme với loại protein khơng phải enzyme nhƣng lại có tính chất lý hóa giống Do việc tách protein enzyme khỏi loại protein lúc đạt đƣợc kết tốt gặp khó khăn định - Đa số ngành sản xuất thực phẩm nhƣ cơng nghiệp nhẹ lại đòi hỏi phải dùng enzyme Để tách chiết enzyme từ môi trƣờng rắn ngƣời ta thƣờng dùng nƣớc, dung mơi trung tính dung dịch đệm thích hơp Trong đó, nƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi cho kết tốt Các enzyme đƣợc chuyển từ tế bào vào nƣớc chênh lệch nồng độ Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzyme đƣợc cô đặc dƣới áp suất thấp cho hàm lƣợng chất khô không nhỏ 50 – 55% Theo phƣơng pháp khuếch tán nƣớc, chiết đƣợc lƣợng enzyme 90 – 95% dịch chiết không chứa tạp chất không tan Nƣớc thƣờng o dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 28 C Dịch chiết thu đƣợc có màu nâu sẫm, trong, chứa 10 – 15% chất khơ hịa tan đƣợc làm lạnh kịp thời xuống 10 – 15 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 o 12 C Trong dịch chiết enzyme chứa protein tạp nhiều chất khác, để loại bỏ chúng cần thực nhiều phƣơng pháp khác Để loại bỏ muối tạp chất có phân tử lƣợng thấp ngƣời ta thƣờng dùng biện pháp thẩm tích nƣớc hay dung dịch đệm loãng cách lọc qua gel Để loại bỏ protein tạp tạp chất có phân tử lƣợng cao khác, thƣờng dùng kết hợp nhiều biện pháp khác Phƣơng pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trƣờng, phƣơng pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung môi hữu cơ, phƣơng pháp sắc ký, điện di, phƣơng pháp lọc gel 1.8 Sợ lƣợc sắc ký lọc gel 1.8.1 Bản chất phương pháp Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh protein, xác định trọng lƣợng phân tử phân tích tƣơng tác phân tử Một số thông số vật lý phƣơng pháp Giới hạn tách (exclution limit): trọng lƣợng phân tử (MW) phân tử nhỏ không chui vào bên hạt gel Ví dụ: giới hạn tách G – 50 có FR từ 1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa phân tử lớn khơng chui vào hạt gel - Phạm vi tách (Fructionation range): ví dụ: sephadex G – 50 có FR từ 1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa phân tử nằm khoảng MW nói đƣợc tách dễ dàng G – 50 Độ ngậm nƣớc (water regain): lƣợng nƣớc mà gam bột gel khô hút nƣớc Ví dụ: G – 50 có WR 0,5 ± 0,3g Giá trị chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt Do khơng thể sử dụng để tính thể tích cột - Thể tích (bed volume): thể tích cuối mà gam gel khô hấp thu trƣơng nở nƣớc G – 50 tích – 11ml/g gel khô 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - 2013 Hạt gel (gel particle): hạt gel hình cầu có nhiều lỗ Kích thƣớc hạt xác định mesh đƣờng kính hạt (bead diameter) tính theo µm Hạt có kích thƣớc lớn (50 – 100 mesh, 100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết tách thấp Ngƣợc lại hạt mịn (400 mesh, 10 – 40 µm) lại cho tốc độ dịng chảy qua cột nhỏ, tách không tốt Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100 – 200 mesh, 50 - 150 µm - Thể tích trống (void volume): tổng thể tích khơng gian bao quanh hạt gel cột Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons - Thể tích thổi (elution volume): thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách khỏi cột 1.8.2 Đặc tính gel Có loại gel thƣờng đƣợc sử dụng - Dextran có chất polysaccharide tự nhiên hãng Pharmacia – LKB (Thụy Điển) cung cấp với tên thƣơng mại Sephadex Giới hạn tách gel dextran 600.000 Daltons, dextran tự nhiên chứa liên kết ngang nên khó giữ ngun vẹn hạt kích thƣớc lỗ to Tuy nhiên dextran đƣợc bổ sung thêm liên kết ngang N,N’ – methylene bisacrylamide dextran có giới hạn tách gia tăng - Gel polyacrylamide: tạo trình đồng hóa polymer acrylamide N,N’ – methylene bisacrylamide (Bio – Rad cung cấp – Biogel – P tên thƣơng mại) - Gel agarose: thành phần polysaccharide tự nhiên agar, cấu tạo từ galactose anhydrogalactose Mạng gel đƣợc ổn định nhờ liên kết hydro nhiều liên kết ngang Hãng Bio – Rad cung cấp agarose với tên thƣơng mại Bio – gel A, Pharmacia – cung cấp tên thƣơng mại sepharose seperose Gel kết hợp polyacrylamide agarose có tên thƣơng mại ultragel, cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc vững agarose cho phép sử dụng 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Ngun liệu - Lúa - Cám mì - Bã mía - Giống mốc Trichoderma 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Hóa chất - Thuốc thử Coomassie - Thuốc thử DNS - Thuốc thử lugol - Dung dịch đệm Citrate - Acetone, acetate pH5, NaCl 2.2.2 Thiết bị Tủ hút Kính hiển vi Máy đo quang phổ Máy vortex Microwave Tủ ủ Autoclave Cân phân tích Buồng đếm hồng cầu Máy khuấy Đo pH Máy ly tâm 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3 2013 Phƣơng pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm mốc Trichoderma spp 2.3.1 Phương pháp mơ tả hình thái Trichoderma 2.3.1.1 Quan sát đại thể - Dùng que cấy móc vơ trùng gạt nhẹ lên bào tử đính sợi nấm, chuyển sang đĩa petri mơi trƣờng PGA, cắm đầu móc xuống mặt thạch - Ủ nhiệt độ phòng thời gian – ngày - Quan sát hình dạng màu sắc khuẩn lạc sợi nấm mặt mặt dƣới khuẩn lạc 2.3.1.2 Quan sát vi thể - Lót giấy thấm mặt đáy đĩa petri, đặt vào miếng lame, gói giấy đem khử trùng - Nhỏ giọt môi trƣờng PGA vào lame chờ đông lại, cấy điểm vào môi trƣờng PGA đậy miếng lamen lên - Làm ẩm góc giấy nƣớc cất vơ trùng - Ni ủ nhiệt độ phịng - Sau 2, ngày lấy miếng lame khỏi đĩa petri, nhỏ vài giọt cồn thấm giấy sau nhỏ tiếp NaOH 10% thấm khơ - Quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x40 2.3.2 Xác định số lượng bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu Cách tiến hành Cân 1g giống bào tử 0,1% vortex ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất bổ sung Tween 80 độ pha loãng 10 buồng đếm hồng cầu -1 tiếp tục pha loãng 10 quan sát X40 đếm bào tử Cơng thức tính số bào tử 1g chất 19 -4 cho vào ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Trong : - N: số lƣợng bào tử 1ml dịch huyền phù - a: số lƣợng bào tử ô lớn (80 ô con) - b: số ô ô lớn (16 x = 80) 3 - 10 : số chuyển mm thành ml (1000 mm = 1ml) - n: độ pha loãng mẫu 2.3.3 Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải Nguyên tắc Khi cho enzyme tác dụng với chất môi trƣờng thạch, hợp chất đƣợc phân giải thành hợp chất đơn giản Có thể định tính định lƣợng sơ hoạt tính xylanase dựa vào vịng phân giải xylan hợp chất không phản ứng màu với thuốc thử Chuẩn bị môi trƣờng dụng cụ - Môi trƣờng định tính hoạt tính xylanase dịch enzyme theo phƣơng pháp cấy điểm: PGA bổ sung xylan - Thuốc thử glugol o - Đĩa petri hấp khử trùng 121 C, atm, 15 phút Cách tiến hành Đổ đĩa mơi trƣờng định tính hoạt tính xylanase Trichoderma vào môi trƣờng dùng que cấy điểm cho thuốc thử glugol vào sau khảo sát 8h ; 16h ; 24h ; 32h ; 40h ; 48h ; 56h ; 64h ; 72h 20 đo vịng phân giải ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.4 Quy trình khảo sát số yếu tố Giống Trichoderma Cấy chuyền (môi trƣờng thạch nghiêng PGA) Cất giữ giống (môi trƣờng lúa) Khảo sát sinh tổng hợp enzyme (môi trƣờng bán rắn) 21 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3.5 Thuyết minh quy trình 2.3.5.1 Giống mốc Trichoderma Viện Sinh học Nhiệt Đới cung cấp đƣợc nuôi môi trƣờng PGA thạch nghiêng nhiệt độ thƣờng thời gian 36h, bào tử đƣợc hình thành đem bảo quản nhiệt độ lạnh 2.3.5.2 Cấy chuyền Chuẩn bị môi trƣờng dụng cụ - Môi trƣờng PGA: khoai tây 200g, agar 20g, glucose 20g, nƣớc cất o 1000ml, hấp khử trùng 121 C, atm, 15 phút - Que cấy mốc, ống nghiệm Cách tiến hành o - Cho môi trƣờng vào 1/3 ống nghiệm hấp khử trùng 121 C, atm, 15 phút, lấy để nghiêng cho thạch khơng bị dính lên nút bông, chờ cho thạch đông lại - Dùng que cấy hấp khử trùng cấy ria bề mặt thạch - Giống sau cấy nuôi nhiệt độ phịng thí nghiệm 2.3.5.3 Cất giữ giống Chuẩn bị môi trƣờng dụng cụ - Môi trƣờng lúa bổ sung (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, o UREA, pepton, hấp khử trùng 121 C, atm, 15 phút - Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, que cấy vịng tất đƣợc trùng Cách tiến hành - Cho 1ml nƣớc cất vào ống giống, dùng que cấy mài nhẹ bề mặt thạch để tách bào tử, cho chúng hoàn toàn nằm pha nƣớc nhƣ dịch huyền phù - Sau đổ tồn nƣớc chứa bào tử vào môi trƣờng nhân giống trộn kỹ 22 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.5.4 2013 Khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma spp Chuẩn bị môi trƣờng dụng cụ - Mơi trƣờng khống Czapeck: KNO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, KCl - Mơi trƣờng bán rắn: 20g cám mì – bã mía bổ sung khoáng Czapeck - Thuốc thử Coomassie - Thuốc thử DNS - Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, nƣớc tinh khiết, bình định mức 50ml, tất đƣợc trùng Cách tiến hành - Cho vào môi trƣờng lúa nhân giống 20ml nƣớc tinh khiết, dùng đũa thủy tinh khuấy để bào tử hòa lẫn vào nƣớc - Dùng pipetman hút ml cho vào môi trƣờng bán rắn - Sau cấy, nuôi nhiệt độ phòng 48h - Đo hàm lƣợng protein: sử dụng thuốc thử Coomassie đo bƣớc sóng 595 nm - Đo hoạt tính enzyme: sử dụng thuốc thử DNS, chất xylan đo bƣớc sóng 540 nm Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ chất đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase tỷ lệ cám mì – bã mía Tỷ lệ Thí nghiệm 2: Khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase Độ ẩm (% Thí nghiệm 3: Khảo sát pH đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase pH 23 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase Thời gian 8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ dinh dƣỡng đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase Nồng độ Thí nghiệm 6: Khảo sát tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase Tỷ lệ giống 2.4 Bố trí thí nghiệm Sau thu nhận kết khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase ta tiến hành thu chế phẩm enzyme nhằm phục vụ cho thí nghiệm khảo sát enzyme sau Mục đích q trình nhằm khảo sát thông số kỹ thuật ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme xylanase trình tách chiết, tinh sơ enzyme 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase Mục đích nhằm chọn tỷ lệ dung dịch đệm tối ƣu để tách chiết enzyme cho thí nghiệm sau Chọn tỷ lệ dung môi tốt để thu nhận dịch chiết enzyme xylanase Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng dung môi để tách chiết enzyme Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, dung môi (nƣớc cất, đệm Citrate, đệm Acetate, muối sinh lý NaCl) 24 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cách tiến hành Cân chế phẩm enzyme Bổ sung dung môi (tỷ lệ chế phẩm : dung môi 1:8) Khuấy 30 phút Lọc Dịch chiết Đo hàm lƣợng Protein Hoạt tính enzyme Thí nghiệm 2: Khảo sát tỷ lệ dung môi tốt để tách chiết thu nhận enzyme Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, dung môi tốt (kết thí nghiệm 1) 25 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cách tiến hành Cân chế phẩm enzyme Tỷ lệ Chế phẩm enzyme (g) Dung môi (ml) Khuấy 30 phút Lọc Dịch chiết Đo hàm lƣợng protein Hoạt tính enzyme 2.4.2 Khảo sát tác nhân tủa enzyme xylanase Mục đích khảo sát: Khảo sát tỷ lệ tác nhân với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt tính hàm lƣợng enzyme tốt 26 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein Cồn 96 50% 55% 60% 65% 70% 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Xác định hoạt tính hàm luợng Chọn lấy tỷ lệ, nồng độ tốt Thí nghiệm Khảo sát tủa cồn 96 o Chuẩn bị: Dịch chiết protein, cồn 96 Cách tiến hành: o Để tránh làm biến tính protein, cồn 96 phải đƣợc làm lạnh trƣớc tiến hành tủa Thể tích dịch chiết protein thể tích cồn tƣơng ứng với tỷ lệ 1:1, 1:2, o 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Lắc hỗn hợp bảo quản lạnh C Sau ly tâm 10.000 vòng/phút thời gian phút Thu tủa đem xác định hoạt tính hàm lƣợng Chọn tỷ lệ cho hoạt tính hàm lƣợng tốt 27 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein Xác định hoạt tính Chọn lấy tỷ lệ tốt Thí nghiệm Khảo sát tủa muối (NH4)2SO4 Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 với dịch chiết để chọn nồng độ cho hoạt tính hàm lƣợng enzyme tốt Vật liệu: Dịch chiết protein, dung dịch muối (NH ) SO 60%, 65%, 70%) Cách tiến hành 4 (50%, 55%, Để tránh làm biến tính protein, dịch chiết protein thô đƣợc cho vào ống ly tâm 5ml đặt chậu nhỏ chứa đá lạnh vụn xung quanh Thể tích dịch chiết protein muối tƣơng ứng với nồng độ 50%, 55%, 60%, 65%, 70% Khuấy hỗn hợp bảo quản lạnh C 30 phút Sau ly tâm 10.000 vịng/phút thời gian phút Thu tủa đem xác định hoạt tính hàm lƣợng Chọn nồng độ cho hoạt tính hàm lƣợng tốt 28 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein 50% 55% 60% 65 % 70% Xác định hoạt tính Chọn lấy nồng độ tốt Thí nghiệm Khảo sát tủa Acetone Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát tỷ lệ cồn với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt tính hàm lƣợng enzyme tốt Chuẩn bị: Dịch chiết protein, dung dịch Acetone Cách tiến hành: Để tránh làm biến tính protein, Acetone phải đƣợc làm lạnh trƣớc tiến hành tủa Thể tích dịch chiết protein thể tích dung dịch Acetone tƣơng ứng với tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Lắc hỗn hợp bảo quản lạnh C 30 phút Sau ly tâm 10.000 vịng/phút thời gian phút Thu tủa đem xác định hoạt tính hàm lƣợng Chọn tỷ lệ cho hoạt tính hàm lƣợng tốt 29 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein Xác định hoạt tính Chọn lấy tỷ lệ tốt Sau khảo sát tác nhân tủa dịch chiết với chất ta so sánh xem tỷ lệ nồng độ cho hoạt tính hàm lƣợng tốt chọn 2.4.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase Mục đích: Khảo sát nhiệt độ pH cho hoạt tính enzyme tốt Thí nghiệm Khảo sát ảnh hƣởng pH đến hoạt tính enzyme dịch chiết Vật liệu: Dịch tủa enzyme, dụng cụ - thiết bị để chạy sắc ký 30 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cách tiến hành Dịch tủa protein pH Xác định hoạt tính Chọn lấy pH tốt Sau khảo sát pH, ta có hoạt tính hàm lƣợng protein ứng với pH Ta chọn pH cho kết hoạt tính hàm lƣợng tốt để thu nhận dịch tủa Thí nghiệm Khảo sát ảnh hƣởng theo nhiệt độ Chuẩn bị: Dịch tủa enzyme Cách tiến hành Dịch tủa enzyme o 30 C o 40 C o 50 C o 60 C Xác định hoạt tính Chọn lấy nhiệt độ tốt 31 70oC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Sau khảo sát nhiệt độ, ta có hoạt tính hàm lƣợng protein ứng với nhiệt độ Ta chọn nhiệt độ cho kết hoạt tính hàm lƣợng tốt 2.4.4 Tinh protein enzyme sắc ký lọc gel - Chuẩn bị cột sắc ký: sử dụng cột sắc ký Bio – Rad - Tốc độ dòng chảy: ml/phút - Cột 50 x 1.5 cm - Phân đoạn: ml - Thể tích: ml Cách tiến hành Bƣớc 1: Chuẩn bị gel Cho 10 g bột gel Biogel P – 100 từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 N, pH đựng cốc, không khuấy, để yên 24 nhiệt độ phòng cho q trình trƣơng nở xảy hồn tồn tạo thể huyền phù đồng hạt, sau q trình trƣơng nở xảy hồn tồn gạn lớp bề mặt bỏ đi, đổ thêm đệm cho ngập phần gel đuổi bọt khí máy đuổi khí Để gel ổn định 90 – 95% số hạt ổn định, gạn loại lớp bề mặt cách hút để loại hạt mịn Lặp lại công việc lần để loại 90% hạt mịn làm cản trở trình lọc gel Bƣớc 2: Nhồi cột Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ cột cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột Rót đều, vừa rót vừa khuấy nhẹ để gel hấp phụ lắng từ từ theo trọng trƣờng Tránh không cho tạo thành bọt khí, phải rót liên tục Dịch đệm thừa cho chảy qua van dƣới cột Khi lớp hình thành cột từ – cm, mở khóa đầu cột cột đƣợc nạp đầy gel Khi cột đƣợc nạp đầy gel, đặt đĩa giấy lọc bơng thủy tinh lên bề mặt cột để bảo vệ mặt cột cho mẫu vào thay đổi dịch rửa trôi, khóa đầu cột gắn adaptor vào 32 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cho chạy máy sắc ký để ổn định cột đệm phosphate pH với lƣợng đệm chạy – lần thể tích cột Sau cột ổn định đóng đầu cột điều chỉnh adaptor xuống sát lớp gel Nạp mẫu vào bề mặt lớp gel qua adaptor Bƣớc 3: Nạp mẫu vào cột Chuẩn bị mẫu: Mẫu chạy sắc ký phải sạch, hòa tan mẫu NaOH 0.1 N Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0.45 micrometre) để làm gia tăng độ bền thời gian sử dụng cột Dùng xi lanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký Bƣớc 4: Thêm dung dịch đệm rửa Sau mẫu thấm hết vào cột, bổ sung vài ml dung dịch đệm rửa, mẫu đọng lại thấm hết vào cột Mẫu dung dịch đệm di chuyển qua cột Các phân tử di chuyển vào lỗ hạt gel Sau nối cột với bình chứa dịch cột thổi Bƣớc 5: Thổi cột Dịch thổi cột đƣợc giữ ổn định tốc độ thích hợp Điều quan trọng tốc độ cột thổi cao cho kết tách mẫu thấp, ngƣợc lại tốc độ thổi cột thấp kéo dài thời gian tách mẫu, peak bị loãng cho kết thấp Thổi cột liên tục dung dịch đệm phosphate Bƣớc 6: Thu mẫu xác định mẫu tách đƣợc Dịch khỏi cột đƣợc đo hấp thụ bƣớc sóng 280 nm detector hệ thống sắc ký đƣợc thể độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ phần mềm LP – Data View máy tính Dịch đƣợc thu tự động máy thu mẫu (collector) Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom phân đoạn thuộc peak Các peak đƣợc phân tích hàm lƣợng protein sau sắc ký theo phƣơng pháp Bradford + Hiệu suất tinh protein Xác định hiệu suất trình tinh hệ thống sắc ký lọc gel Hiệu suất tinh = + Hiệu suất hoạt tính enzyme: 33 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Hiệu suất hoạt tính enzyme = + Hoạt tính riêng enzyme: HTR enzyme = + Độ tinh enzyme Độ tinh enzyme = 2.5 Phƣơng pháp xác định tiêu nghiên cứu xử lí kết 2.5.1 Phương pháp xác định tiêu nghiên cứu 2.5.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm Trong đó: - A: chất ni cấy (g) - B: độ ẩm muốn bổ sung vào môi trƣờng (%) - C: độ ẩm chất A (%) - 100: độ ẩm 100% - F: lƣợng nƣớc cần bổ sung vào mơi trƣờng để đạt độ ẩm thích hợp (ml) 2.5.1.2 Phương pháp Bradford xác định hàm lượng protein Nguyên tắc Phƣơng pháp dựa bƣớc sóng hấp thụ cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức với protein Trong dung dịch mang tính acid, chƣa kết nối với protein thuốc nhuộm hấp thu cực đại bƣớc sóng 595nm Độ hấp thu trực tiếp có liên hệ trực tiếp với nồng độ protein Chuẩn bị hóa chất - Thuốc thử Bradford 34 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 - Albumin: cân xác 10mg albumin, thêm 50 – 60 ml nƣớc cất khuấy tan albumin đến vạch cho vào bình định mức 100ml, dẫn nƣớc cho dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml Cách tiến hành Chuẩn bị 10 ống nghiệm đánh số 9, tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Ống số Nồng độ albumin (µg/ml) Albumin (0,1mg/ml) Nƣớc cất Thuốc thử Bradford (ml) Bảng 3.1 Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford Tính tốn kết Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn mật độ quang mẫu khảo sát ta suy đƣợc nồng độ protein mẫu X (µg/ml) có mg ngun liệu Vậy hàm lƣợng protein có 1g nguyên liệu là: HL (mg/ml) Trong đó: - X (µg/ml): nồng độ protein mẫu khảo sát dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn - n: hệ số pha lỗng mẫu từ 1g chế phẩm protein thơ ban đầu 2.5.1.3 Xây dựng đường chuẩn xylose 35 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Chuẩn bị dung dịch xylose nồng độ 10mM: hòa tan 150mg xylose đệm Na-citrate 0,05M pH 5,3 chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm đến vạch Dung dịch tiếp tục đƣợc pha loãng với dung dịch đệm Na-citrate 0,05M pH 5,3 theo bảng sau: Độ pha loãng Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn + Hút vào ống nghiệm 1,8 ml dung dịch xylan 1% + Thêm ml dung dịch DNS 200 µl dung dịch xylose chuẩn + Chuẩn bị ống đối chứng với 200 µl dung dịch đệm Na-citrate 0,05M pH 3,5 thay cho dung dịch xylose chuẩn + Đo độ hấp thu bƣớc sóng 540 nm máy quang phổ Tiến hành phản ứng + Hút 1,8 ml dung dịch chất cho vào ống nghiệm có dung tích 25ml (hai ống nghiệm cho lần xác định) ống đối chứng + Đặt vào bể ổn định nhiệt có nhiệt độ 50º 5phút + Tại thời điểm 0, bắt đầu tính giờ, thêm 200µl dung dịch enzyme pha loãng vào ống nghiệm thứ nhất, trộn máy vortex, tiếp tục thêm enzyme vào khoảng ống nghiệm trừ ống đối chứng + Sau phút phản ứng, thêm ml dung dịch DNS vào ống lắc + Thêm ml thuốc thử DNS, sau thêm 200µl dung dịch enzyme vào ống đối chứng + Đun sôi cách thủy ống nghiệm thời gian phút, sau làm mát nƣớc lạnh nhiệt độ phòng + Đo độ hấp thu bƣớc sóng 540 nm tính theo đƣờng chuẩn xylose máy quang phổ 36 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Tính tốn kết Một đơn vị hoạt tính xylanase (BXU) lƣợng enzyme thủy phân xylan sinh lƣợng đƣờng khử tƣơng ứng với nmol xylose giây điều kiện phản ứng Một đơn vị hoạt tính xylanase (UI) đƣợc định nghĩa lƣợng enzyme thủy phân xylan sinh đƣờng khử tƣơng ứng với 1µmol xylose phút điều kiện phản ứng Nhƣ UI = BXU ; 1UI = µmol xylose/ml/phút HT (UI) = Trong đó: - X: số µmol xylose suy từ đƣờng chuẩn - K: hệ số pha loãng - v: thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme - t: thời gian phản ứng 2.5.2 Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý phần mềm Excel 37 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Quan sát hình thái Trichoderma spp môi trƣờng PGA 3.1.1 Quan sát đại thể Mặt dư i khẩn lạc Mặt khuẩn lạc Bào tử Hình 3.1 Hình thái đại thể Trichoderma spp Hình thái đại thể sau quan sát thời gian 24h tơ có dạng bơng, cịn non khuẩn lạc có màu trắng, già khuẩn lạc có màu xanh lục, màu 38 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 bào tử đính Trichoderma spp không tiết sắc tố màu vàng môi trƣờng thạch 3.1.2 Quan sát vi thể Sau nuôi ủ nhiệt độ phịng thời gian 24h khuẩn ty có vách ngăn, cuống sinh bào tử có dạng phân nhánh giống nhƣ cành Hình 3.2 Hình thái vi thể Trichoderma spp nuôi ủ 24h Sau ni ủ thời gian 36h khuẩn lạc lên tơ già, nhánh mang nhiều tế bào sinh bào tử đính, mang bào tử đính riêng rẽ, bào tử đính dính thành cụm Hình 3.3 Hình thái vi thể Trichoderma spp ni ủ 36h Sau 48h nuôi cấy, bào tử phát triển mạnh, đính dính thành nút thắt bào tử Hình 3.4 Hình thái vi thể Trichoderma spp ni ủ 48h 39 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2 Định tính enzyme xylanase Trichoderma spp Hình 3.5 Kết vành phân giải xylanase Trichoderma spp 40 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Khi ni ủ thời gian 8h vi sinh vật chƣa phát triển nên chƣa thấy đƣợc vòng phân giải enzyme Bắt đầu từ 16h đến 40h nấm mốc phát triển enzyme xylanase thủy phân chất xylan tạo vòng phân giải lớn dần (11mm đến 34mm) Thời điểm từ 48h đến 56h tơ non phát triển mạnh đạt kích thƣớc 49mm Thời gian sau ni ủ 56h 64h giai đoạn nấm mốc phát triển tiếp tục bắt đầu sinh bào tử Nhƣng thời gian ni cấy 56h 64h nấm mốc sinh bào tử sinh enzyme xylanase không tốt thời gian 48h nấm mốc phát triển tơ non 3.3 Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp Nhằm xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật có giống mốc Trichoderma spp sau nuôi cấy thời gian 48h, ta thu đƣợc kết nhƣ sau: -4 Kết số tế bào đếm đƣợc 1g mốc giống nồng độ pha loãng 10 11 4.48×10 Sau ta tiến hành cấy vào mơi trƣờng lên men bán rắn 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase Trichoderma spp Thí nghiệm 1: Kết khảo sát tỷ lệ chất đến sinh tổng hợp xylanase Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein xác định hoạt tính xylanase Ta có kết bảng 3.1 nhƣ sau: 41 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.1 Kết hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase Trichoderma spp với tỷ lệ chất khác Tỷ lệ CM:BM 6:4 7:3 5:5 3:7 Hàm lƣợng protein (mg/g) 4:6 Hàm lượng protein (mg/g) Hoạt tính Xylanase (IU/g) Đồ thị 3.1 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp với tỷ lệ chất khác Kết đồ thị cho thấy hoạt tính xylanase tỷ lệ 6:4 78,96 UI/g tăng dần lên đạt cao mơi trƣờng có tỷ lệ 4:6 139,48 UI/g Hàm lƣợng protein môi trƣờng 4:6 cao 35,47mg, giảm dần xuống thấp 6:4 21,87 mg 42 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Kết giải thích nhƣ sau: bã mía có khả giữ nƣớc cao có cấu trúc phức tạp cám mì, pha chế mơi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía khác với lƣợng nƣớc, mơi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía 6:4 có độ ẩm lƣợng bã mía thấp mơi trƣờng khác Cịn mơi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía 4:6 có độ ẩm hàm lƣợng bã mía cao nên có độ xốp độ thống khí cao hơn, thích hợp cho sinh trƣởng sinh tổng hợp xylanase Trichoderma Nhƣng tỷ lệ 6:4 hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein giảm xuống 78,96 UI/g 21,87 mg hàm lƣợng bã mía khơng tạo đƣợc độ thơng thoáng cho nấm mốc phát triển Dựa vào kết cho thấy mơi trƣờng có tỷ lệ 4:6 tốt nhƣng phụ thuộc vào yếu tố khác nhƣ độ ẩm, pH… nên cần phải tiếp tục khảo sát Chúng tơi chọn tỷ lệ cám mì : bã mía mơi trƣờng ni cấy cho thí nghiệm Thí nghiệm Kết khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến sinh tổng hợp xylanase Độ ẩm vừa ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vừa ảnh hƣởng đến trao đổi chất vi sinh vật trình lên men bán rắn Trong thí nghiệm chọn tỷ lệ cám mì : bã mía để khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm Thêm nƣớc cất vào môi trƣờng bán rắn điều chỉnh độ ẩm 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% Sau cấy dịch huyền phù từ mơi trƣờng nhân giống cấp (môi trƣờng lúa) Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein xác định hoạt tính xylanase Ta có kết bảng 3.2 nhƣ sau: 43 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.2 Kết hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase Trichoderma spp có độ ẩm mơi trƣờng khác Độ ẩm 45% 50% 55% 60% 65% 70% lƣợng protein(mg/g) Hàm lượng protein (mg/g) Hàm Hoạt tính Xylanase (IU/g) Đồ thị 3.2 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có độ ẩm khác Trong thí nghiệm ta chọn tỷ lệ cám mì : bã mía để khảo sát độ ẩm Theo kết bảng 3.2 đồ thị 3.2 Cho ta thấ y hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein tăng dần từ mơi trƣờng có độ ẩm từ 45 – 55% đạt cao độ ẩm 55% 149,68 UI/g 39,73 mg, sau giảm xuống độ ẩm đạt 60% 44 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Điều tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm phồng chất, tăng độ xốp tạo điều kiện cho Trichoderma tiếp xúc với chất dễ dàng Còn mơi trƣờng có độ ẩm thấp hoạt lực xylan hàm lƣợng protein thấp chất bị khô làm bất lợi cho sinh trƣởng sinh tổng hợp xylanase Trichoderma spp Đối với môi trƣờng có độ ẩm cao 55% hoạt lực xylan hàm lƣợng protein giảm Có thể môi trƣờng ẩm, độ xốp giảm cản trở khuếch tán oxy từ bên ngồi vào mơi trƣờng Thí nghiệm Kết khảo sát pH mơi trƣờng đến sinh tổng hợp xylanase Bảng 3.3 Kết hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có pH khác pH C 4.5 5.5 6.5 45 (mg/g) lƣợng protein Hàm Đồ thị 3.3 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có pH khác Theo kết bảng 3.3 đồ thị 3.3 ta thấy hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein môi trƣờng pH 4.5 thấp (110,20 UI/g 29,33 mg/g), tăng dần pH lên đến 5.5 hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein đạt cao 150,74 UI/g 41,60 mg/g, pH 6.0 6.5 hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein giảm dần Hiện tƣợng mơi trƣờng q kiềm acid, ảnh hƣởng đến ion hóa chất, độ bền bên chất làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme Trichoderma hoạt động môi trƣờng pH thích hợp hoạt tính enzyme tăng theo thời gian ni cấy Thí nghiệm Kết khảo sát nồng độ dinh duỡng đến sinh tổng hợp xylanase Cơ chất mà tất chất dinh dƣỡng cho vi sinh vật chất lý tƣởng Tuy nhiên, nhiều chất nghèo dinh dƣỡng, cần phải bổ sung thêm chất dinh dƣỡng từ bên pha chế mơi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1, x2,….,x5, chỉnh độ ẩm đến 55% pH 5,5 với tỷ lệ cám mì – bã mía 4:6 Sau nuôi cấy 48h, xác định hàm lƣợng protein hoạt tính enzyme xylanase 46 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.4 Kết hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có nồng độ dinh dƣỡng khác Nồng độ dinh dƣỡng x1 x2 x3 x4 Hàm lƣợng protein (mg/g) x5 Hàm lượng protein (mg/g) Hoạt tính Xylanase (IU/g) Đồ thị 3.4 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có nồng độ dinh dƣỡng khác Kết cho thấy, hoạt tính enzyme xylanase hàm lƣợng protein tăng dần lên từ mơi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1 đến x3, Ở nồng độ dinh dƣỡng x4 (170,80 IU/g 42,40 mg) cao nhất, sau giảm dần xuống mơi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x5 hoạt tính enzyme xylanase hàm lƣợng protein 149,47 UI/g 39,47 mg/g 47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thí nghiệm Kết khảo sát thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp xylanase Bảng 3.5 Kết hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có thời gian nuôi cấy khác Thời gian nuôi cấy (h) 8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h 2013 48 50 45 (mg/g) 40 35 30 Hàm lƣợng protein 25 20 15 10 8h 16h Đồ thị 3.5 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có thời gian nuôi cấy khác Theo kết bảng 3.5 đồ thị 3.5 ta thấy hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein tăng rõ rệt từ – 48h, đạt giá trị cao 48h, sau bắt đầu giảm dần xuống Điều giải thích, sau 48h ni cấy Trichoderma spp chúng phát triển mạnh chất bị thủy phân gần hết sau 48h nên hoạt tính hàm lƣợng bắt đầu giảm xuống 49 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm Kết khảo sát tỷ lệ giống đến sinh tổng hợp xylanase Bảng 3.6 Kết hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có tỷ lệ giống khác Tỷ lệ giống (bào (mg/g) tử/g) 1.12x10 11 2.24x10 11 3.36x10 11 4.48x10 11 5.60x10 11 Hàm lượng protein (mg/g) Hàm lƣợng protein Hoạt tính Xylanase (IU/g) Tỷ lệ giống Đồ thị 3.6 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase từ mơi trƣờng ni cấy Trichoderma spp có tỷ lệ giống khác Kết cho thấy, hoạt tính enzyme hàm lƣợng protein đạt cao 11 4.48x10 (212,39 UI/g 49,87 mg/g) Kết mật độ bào tử phải 4.48x10 11 đảm bảo tiểu phần chất đƣợc bảo phủ hệ sợi nấm nhằm hạn chế tạp để 50 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 nhiễm Nếu tỷ lệ giống cao dẫn đến cạnh tranh dinh dƣỡng, oxy diễn mạnh nên chất bị phân hủy hết làm cho hoạt tính enzyme bị giảm xuống Từ nghiệm thức khảo sát sinh tổng hợp enzyme chọn kết tốt để bố trí nghiệm tinh protein enzyme 3.5 Kết bố trí thí nghiệm 3.5.1 Khảo sát dung mơi tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase Thí nghiệm Khảo sát ảnh hƣởng dung môi dung môi để tách chiết enzyme xylanase theo tỷ lệ 1:4 ta có kết sau Bảng 3.7 Kết khảo sát dung môi để tách chiết enzyme xylanase Dung môi H2O Acetate Citrate NaCl Hàm lƣợng protein (mg/g) Hàm lượng protein (mg/g) Hoạt tính xylanase (UI/g) NaCl H2O CitrateAcetate Dung môi Đồ thị 3.7 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính xylanase dung mơi tách chiết enzyme xylanase 51 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Chúng tơi nhận thấy q trình tách chiết enzyme dung môi tỉ lệ 1:4 nƣớc cất thu đƣợc hoạt tính riêng cao 3,006 (UI/mg) Điều với lý thuyết, tách chiết enzyme nƣớc thu đƣợc hàm lƣợng protein enzyme chiếm vào khoảng 90% trở lên Vậy dựa vào bảng kết tiến hành tách chiết ezyme nƣớc cất cho thí nghiệm sau Thí nghiệm Khảo sát tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase Bảng 3.8 Kết tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase Tỷ lệ 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 Hàmlƣợng protein(mg/g) 1:9 Đồ thị 3.8 Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 52 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Sau khảo sát trình tách chiết enzyme nƣớc cất qua tỷ lệ chúng tơi thấy hoạt tính riêng cao 4,602 (UI/mg) tƣơng ứng với tỉ lệ 1:5 Quá trình chiết trình khuếch tán chất tan (enzyme) canh trƣờng vào nƣớc Quá trình khuếch tán tuân theo định luật Flick: “Lƣợng chất khuếch tán tỉ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc dung mơi chất tan với gradient nồng độ thời gian khuếch tán” Khi tỉ lệ canh trƣờng : nƣớc cất tăng, diện tích bề mặt tiếp xúc nƣớc canh trƣờng tăng Lƣợng nƣớc cất làm chênh lệch nồng độ chất tan bề mặt tiếp xúc với lớp nƣớc bên Cả hai yếu tố làm cho lƣợng chất tan chiết đƣợc tăng tỷ lệ nƣớc cất tăng Tuy nhiên, lƣợng nƣớc cất đạt đến giới hạn nồng độ enzyme dịch chiết giảm nhanh, dẫn đến hoạt tính enzyme giảm nhanh Qua kết định chọn chiết enzyme nƣớc cất với tỉ lệ 1:5 3.5.2 Khảo sát trình tinh enzyme xylanase từ dịch chiết phương pháp kết tủa Thí nghiệm Tủa cồn 96 o Bảng 3.9 Kết khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme xylanase DC : Cồn 1:1 1:2 1:3 1:4 53 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 lƣợng protein(mg/g) Hàm lượng protein (mg/g) Hàm Hoạt tính Xylanase (IU/g) Đồ thị 3.9 Biểu diễn hàm lƣợng protein tính enxyme xylanase từ hoạt phân đoạn tủa ccác ồn Từ kết bảng 3.9 ta rút kết luận tủa enzyme cồn tỷ lệ 1:5 ta thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao 6,05 (UI/mg) nên chọn tủa dung môi cồn tỉ lệ 1:5 Khi thể tích dung mơi tăng dần hoạt tính enzyme tăng, số phân tử dung môi hỗn hợp tăng chúng tách triệt để lớp phân tử nƣớc bao xung quanh lớp phân tử protein, làm giảm tính tan protein làm tăng khả kết tủa chúng Nếu ta tiếp tục tăng thể tích dung mơi số điện mơi giảm, phân tử protein tự tháo gỡ trở thành khơng hoạt động, hoạt tính enzyme giảm Ngồi ra, sau, enzyme bị tủa hết, tiếp tục tăng lƣợng dung mơi có nhiều protein tạp khác bị tủa 54 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm 4: Acetone Bảng 3.10 Kết khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme xylanase DC : Acetone 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 lƣợng protein(mg/g) Hàm lượng protein (mg/g) Hàm Hoạt tính Xylanase (IU/g) Đồ thị 3.10 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính enxyme xylanase từ phân đoạn tủa acetone Từ kết bảng 3.10 ta rút kết luận tủa enzyme acetone tỷ lệ 1:4 ta thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao 6,47 (UI/g) nên chọn tủa dung môi muối tỷ lệ 1:4 55 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm Muối Bảng 3.11 Kết khảo sát tỷ lệ muối (NH4)2SO4 dùng để tủa enzyme xylanase Nồng độ muối (%) 50 55 (mg/g) 60 Hàm lượng protein (mg/g) Hàm lƣợng protein Hoạt tính Xylanase (IU/g) Đồ thị 3.11 Biểu diễn hàm lƣợng protein hoạt tính enxyme xylanase từ phân đoạn tủa muối Từ kết bảng 3.11 ta rút kết luận có tủa enzyme muối o nồng độ 65 ta thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao 7,618 o (UI/mg) nên chọn tủa dung dịch muối nồng độ 65 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.12 So sánh kết tủa enzyme xylanase Tác nhân tủa Cồn Acetone Muối Hoạt tính enzyme (UI/g) HT enzyme Cồn Acetone Tác nhân tủa Muối Đồ thị 3.12 Kết tủa enzyme xylanase từ tác nhân tủa Sau tiến hành tủa enzyme với dung môi khác cho đƣợc kết sử dụng dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hịa thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao nên chúng tơi định chọn muối tác nhân tủa cho thí nghiệm 57 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 3.5.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng pH đến chế phẩm enzyme xylanase Bảng 3.13 Kết ảnh hƣởng pH đến chế phẩm enzyme xylanase pH Hoạt tính enzyme (UI/g) 208,13 308,03 238,09 117,54 134,87 350 Hoạt tính enzyme (UI/g) 300 250 200 150 100 50 pH pH Đồ thị 3.13 Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH chế phẩm enzyme xylanase Enzyme nhạy với pH môi trƣờng pH môi trƣờng thƣờng ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa chất enzyme đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền enzyme Chính thế, pH có ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng enzyme Mỗi enzyme thích hợp với vùng pH định, qua thí nghiệm nhận thấy 58 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 hoạt tính enzyme xylanase pH 208,13 UI/g, tăng dần lên cao 308,03 UI/g pH Càng tăng độ pH lên pH 5, 6, hàm lƣợng enzyme giảm dần xuống 117,54 UI/g Từ bảng 3.13 đồ thị 3.12 kết luận pH tối ƣu cho hoạt động chế phẩm enzyme Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến chế phẩm enzyme xylanase Bảng 3.14 Kết ảnh hƣởng nhiệt độ đến chế phẩm enzyme xylanase Hoạt tính enzyme Nhiệt độ (UI/g) 30 158,18 40 377,4 50 421,3 60 407,93 70 374,63 450 Hoạt tính enzyme (UI/g) 400 350 300 250 200 HT enzyme 150 100 50 30o 40o 50o 60o 70o Nhiệt độ Đồ thị 3.14 Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ chế phẩm enzyme xylanase 59 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Nhiệt độ yếu tố vật lý có ảnh hƣởng lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả kết hợp enzyme chất, nâng cao lực enzyme chất Nhiệt độ enzyme khơng cố định mà thay đổi tùy theo chất, tốc độ phản ứng lúc tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Thông thƣờng nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng nhƣng với ngƣỡng tới hạn, vƣợt ngƣỡng tốc độ phản ứng enzyme giảm Từ o kết cho thấy nhiệt độ 30 C hoạt tính enzyme thấp (158,18 UI/g) o tăng nhiệt độ lên 50 C hoạt tính enzyme tăng cao (421,3 UI/g) o o tăng nhiệt độ lên 60 C 70 C hoạt tính enzyme có xu hƣớng giảm từ từ cịn 407,93 374,63 Từ kết chúng tơi kết luận nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động o chế phẩm 50 C 3.6 Tinh enzyme xyalanse phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel Sau tiến hành chiết xuất enzyme dung môi nhƣ nƣớc cất, đệm acetate pH5, NaCl tủa enzyme tác nhân nhƣ cồn, muối, acetone, ta thu đƣợc kết chiết xuất enzyme nƣớc cất tủa enzyme muối cho hoạt tính enzyme cao nên ta chọn tác nhân để thu enzyme tủa tỷ lệ độ hòa tan muối 65% Quá trình tinh đƣợc thực gel Biogel P-100 hàng Bio – Rad, Mỹ Sau ly trích enzyme muối (NH4)2SO4 ta thu đƣợc dịch chiết enzyme, tiến hành chạy sắc ký để tinh sản phẩm Trƣớc chạy sắc ký ta tiến hành loại muối màng thẩm tích Màng cho muối (NH 4)2SO4 qua protein đƣợc giữ lại, ta thu mẫu tiến hành chạy sắc ký Sau chạy sắc ký ta thu đƣợc peak Sau tiến hành xác định hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein peak 60 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 Đồ thị 3.15 Sắc ký đồ excel chạy sắc ký enzyme xylanase Bảng 3.15 Hiệu suất tinh Nghiệm thức Trƣớc sắc ký Sau sắc ký Ta thấy enzyme sau tinh có hoạt tính hàm lƣợng protein thấp so với tổng hoạt tính enzyme hàm lƣợng protein trƣớc tinh Điều xảy thao tác, tủa, ly tâm…trong trình tinh làm thất enzyme Tuy nhiên hoạt tính riêng lại cao nhiêu lần, hiệu suất tinh cao 61 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Các yếu tố Tỉ lệ CM:BM Độ ẩm (%) pH Nổng độ dinh dƣ Thời gian nuôi Tỷ lệ giống Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ sử dụng dung môi để tách chiết enzyme xylanase cho kết sử dụng nƣớc cất để tách chiết enzyme cho hoạt tính enzyme (176,77 UI/g) hàm lƣợng protein (68,8 mg/g) với tỷ lệ tách 1:5 cao Khảo sát trình tinh enzyme xylanase từ dịch chiết thô phƣơng pháp tủa cho kết dùng tác nhân tủa muối ammonisulfate cho hoạt tính enzyme (513,8 UI/g) hàm lƣợng protein (67,44 mg/g) với nồng độ 65% cao Khảo sát ảnh hƣởng pH đến chế phẩm enzyme xylanase cho kết với pH cho hoạt tính enzyme (308,03 UI/g) cao Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm enzyme xylanase cho kết với nhiệt độ phản ứng enzyme chất ứng với o 50 C cho hoạt tính enzyme (421,3 UI/g) cao Hiệu suất độ tinh enzyme xylanase sau tiến hành chạy sắc ký lọc gel là: 62 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 4.2 Đề nghị - Thực phƣơng pháp tối ƣu hóa mơi trƣờng thực nghiệm - Tiếp tục thực phƣơng pháp sắc ký lọc gel với enzyme xylanase đƣợc tủa cồn acetone Thực phƣơng pháp chạy điện di gel SDS để xác định trọng lƣợng phân tử protein 63 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Phạm Thị Trân Châu PGS TS Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học, tập Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục [2] Nguyễn Lân Dũng tác giả (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [3] Nguyễn Đức Lƣợng (2000), Công nghệ vi sinh vật tập – Cơ sở vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Thị Uyên Thảo (2007), Nghiên cứu tạo chế phẩm xylanase từ vi nấm Trichoderma, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên TP.HCM [5] Lê Ngọc Tú cộng (1982), Enzyme vi sinh vật, tập 2, Nxb Khoa Học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 124 – 185 [6] Nguyễn Đức Lƣợng, Công nghệ enzyme protein, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM, 2004 [7] Lê Tú Ngọc tác giả, Hóa sinh cơng nghiệp, NXB KH & KT Hà Nội [8] Nguyễn Thị Thu Thảo, Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ Trichoderma spp tạo chế phẩm bóc vỏ tiêu đen sản xuất tiêu tr ng, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học Trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM [9] Trần Linh Thƣớc, Tài liệu thực tập chuyên đề cao học chuyên ngành vi sinh hóa X, XI, trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM Tài liệu Tiếng Anh [11] Bastawde K B (1998), “Xylanase structure, microbial xylanase, and their mode of action”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, pp 353 – 368 [12] Collins T, Charles Gerday., Georges Feller (2004), “Xylanase, Xylanase families and extremophilic xylanase”, Periodical 29, p3 – 23 64 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 [13] Esposito E., Silva M D., (1998), “Systematics and environmental application of the genus Trichoderma” Crical reviews in Microbiology, 24 (2), pp 89 – 98 [14] solid – Ridder E R., Nokes S E., Knutson B L., (1999), “Optimization of state fermentation parametersfor the production of xylanase bt Trichoderma longibrachiatum on wheat bran in a forced aeration system”, Transactions of The ASABE Vol 42(6): 1785 – 1790, Published by the American Society of Agricultural and Biological Engineers, St Joseph, Michigan [15] Shallom D, Shoham Y (2003), “Microbial hemicellulase”, Current Opinion Microbiol., (3), pp 219 – 228 Tài liệu Internet [16] http://www.biopract.de/html/prod_e_enzyme2.htm [17] www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC [18] [19] http://www.vusta.vn/Temps/Home/template2/?nid=7345 http://www.enzymes.co.uk/answer24.pectinase.htm [20] http://www.doctorfungus.org/thefungi/trichoderma.htm [21].http://vinhphucdost.gov.vn/index.php?mode=14&id=26337&strContent=29&st rShow=410 65 OD Phụ lục A1: Đƣờng chuẩn Bardford Phụ lục A2: Đƣờng chuẩn xylose ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC B Hình B1: Nấm mốc hình thành bào tử mơi trƣờng lúa Hình B2 Nấm mốc mơi trƣờng cám mì : bã mía 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình B3 Chế phẩm enzyme thơ Hình B4 Nấm mốc mơi trƣờng thạch nghiêng 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC C Hình C1 Máy khuấy Hình C2 Cân phân tích Hình C3 Kính hiển vi 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình C4 Máy Vortex Hình C5 Tủ hút Hình C6 Microwave Hình C7 Máy đo quang phổ Hình C8 Tủ ủ 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình C9 Autoclave 2013 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC TRICHODERMA SPP Ngành:... Từ lý xây dựng đề tài: ? ?Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme xylanase tinh sắc ký lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp. ” Mục đích nghiên cứu Tìm mơi trƣờng tốt để chủng nấm. .. 1: Khảo sát tỷ lệ chất đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase tỷ lệ cám mì – bã mía Tỷ lệ Thí nghiệm 2: Khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase Độ ẩm (% Thí nghiệm 3: Khảo