Nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và xác định hoạt tính kháng oxy hóa​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN ANTHOCYANIN TỪ PHẾ LIỆU GẠO ĐEN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN LỆ HÀ Sinh viên thực MSSV: 1151110478 : LÊ TRÍ KIỂNG Lớp: 11DSH05 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm năm cuối Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh, vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học Tơi cam đoan nghiên cứu tơi tiến hành phịng thí nghiệm Khoa Công nghê Sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh Những số liệu hồn tồn trung thực chưa có cơng bố Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 Sinh viên thực Lê Trí Kiểng Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ gian lao nuôi dạy thành người người thầy đầu đời Cha mẹ chỗ dựa vững con, người giúp đứng vững sau lần vấp ngã, nguồn động viên, động lực để tiếp tục phấn đấu sống Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy Cơ Khoa Cơng nghệ sinh học-Thực phẩm-Mơi trường, tồn thể Thầy Cơ Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức quý báo sở ngành chuyên ngành từ ngày em bước chân vào giảng đường đại học Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Lệ Hà, người thầy đáng kính, ln tận tình dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành thầy Nguyễn Trung Dũng tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phịng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Cảm ơn tất bạn lớp 11DSH05 ln khích lệ, động viên giúp đỡ suốt trình học tập trường trình làm đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 SVTH: Lê Trí Kiểng Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG _vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH _ vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Gạo đen _ 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Thành phần hóa học 1.2 Anthocyanin _ 1.2.1 Giới thiệu chung _ 1.2.2 Cấu trúc phân tử _ 1.2.3 Tính chất, đặc điểm _ 12 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc độ bền anthocyanin 13 1.2.4.1 Cấu trúc _ 13 a) Cấu trúc chuyển hóa mơi trường lỏng _ 13 b) Cấu trúc hóa học 15 1.2.4.2 pH _ 17 1.2.4.3 Nhiệt độ 18 1.2.4.4 Oxy 19 1.2.4.5 Enzyme _ 20 1.2.4.6 Ánh sáng 21 1.2.4.7 Đường sản phẩm biến tính chúng _ 21 1.2.4.8 Các ion kim loại 22 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO2) 23 1.2.4.10 Acid ascorbic 24 1.2.5 Sự phân bố anthocyanin 25 1.2.6 Các anthocyanin thương mại hóa 27 1.2.7 Ứng dụng anthocyanin _ 27 1.3 Các thành tựu đạt 28 1.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin _ 28 1.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ dâu Hội An _ 28 1.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím _ 29 1.3.4 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ gạo đen _ 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 2.1.1 Thời gian _ 31 2.1.2 Địa điểm _ 31 2.2 Nguyên liệu– thiết bị - hoá chất _ 31 2.2.1 Nguồn gạo đen _ 31 2.2.2 Một số hóa chất sử dụng nghiên cứu _ 31 2.2.3 Một số dụng cụ thiết bị chủ yếu dùng nghiên cứu 32 2.2.3.1 Dụng cụ. _ 32 2.2.3.2 Thiết bị _ 32 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu nguyên liệu _ 34 2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại anthocyanin từ mẫu gạo đen _ 34 ii Đồ án tốt nghiệp 2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng kích thước hạt đến hiệu trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 35 2.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng xử lý nhiệt sơ cho nguyên liệu đến q trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 37 2.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định tỷ lệ HCl pha chế dung mơi để trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 39 2.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 41 2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 43 2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy anthocyanin 45 2.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thơng số cho q trình quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc 46 2.4 Các phương pháp phân tích sử dụng nghiên cứu 47 2.5 Các phương pháp thống kê xử lý số liệu _ 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN _ 48 3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu nguyên liệu 48 3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại anthocyanin từ mẫu gạo đen 48 3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng kích thước hạt đến hiệu trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 49 3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng chế độ xử lý nhiệt sơ cho ngun liệu đến q trình trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 50 3.5 Thí nghiệm 5: Xác định tỷ lệ HCl pha chế dung mơi để trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 52 3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 53 3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 55 iii Đồ án tốt nghiệp 3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy anthocyanin 56 3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thơng số cho q trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc 58 KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ _ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CƯU _ PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM _ 11 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) EtOH (Ethanol) IC50 (Effective concentration of 50%) MeOH (Methanol) v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học gạo đen Bảng 1.2 Các nhóm anthocyanin có tự nhiên 10 Bảng 1.3 Một số anthocyanin phổ biến 11 Bảng 1.4 Bảng anthocyanin có nguồn gốc thực vật 26 Bảng 3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 48 Bảng 3.2 So sánh giá trị IC50 Ascorbic acid anthocyanin 57 Bảng 3.3 Kết khả kháng DPPH anthocyanin theo thời gian cô quay 61 Bảng 3.4 Đánh giá sơ cảm quan dịch chiết anthocynin .67 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Gạo đen Hình 1.2 Cation Flavylium (R1 R2 OH, H OCH3, R3 glucosyl H, R4 OH glucosyl) Hình 1.3 Sự đổi màu anthocyanin pH khác 12 Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa nước 14 Hình 1.5 Sơ đồ biến tính anthocyanin 3,5-diglucoside pH 3,7 18 Hình 1.6 Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol .20 Hình 1.7 Phản ứng ngưng tụ A: Cyanidin furural; B: Cyanidin ketobase furural 22 Hình 1.8 Sơ đồ Jurd phản ứng thuận nghịch SO2 anthocyanin 23 Hình 1.9 Sự chuyển hóa malvin thành malvone H2O2 tạo thành từ oxy hóa Ascorbic acid 24 Hình 1.10 Fla-2-ene tạo thành từ phản ứng Ascorbic acid anthocyanin 25 Hình 1.11 Quy trình tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím 30 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm 33 Hình 2.2 Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến 34 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định kích thước ngun liệu cho q trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 36 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ cho ngun liệu 38 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl pha chế dung mơi để trích ly anthocyanin từ gạo đen 40 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 42 Hình 2.7 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen 44 Hình 3.1 Quét quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm dung mơi EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v) 48 vii Đồ án tốt nghiệp 60 65 70 16 Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD NhietDoTrichLy_65 NhietDoTrichLy_70 NhietDoTrichLy_50 NhietDoTrichLy_60 NhietDoTrichLy_55 Thí nghiệm Bảng giá trị OD thí nghiệm tối ưu hóa thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen Thời gian trích ly (phút) 50 17 Đồ án tốt nghiệp 18 Đồ án tốt nghiệp 65 70 19 Đồ án tốt nghiệp Bảng 10 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD TgianTLy_70 TgianTLy_50 TgianTLy_65 TgianTLy_55 TgianTLy_60 Thí nghiệm Bảng 11 giá trị khối lượng nguyên liệu trước sau sấy đên khối lượng khơng đổi Coc Coc Coc Thí nghiệm Bảng 12 OD xác định hàm lượng anthocyanin để xác định giá trị IC50 mẫu pH1 535nm 0.649 0.647 0.652 Bảng 13 giá trị OD λ=516nm xác định hoạt tính kháng DPPH anthocyanin Blank Vitamine C Co DF 0.1000 3.08 0.0667 0.0333 0.0222 4.62 1.54 1.026 0.77 0.0167 0.513 0.0111 20 Đồ án tốt nghiệp 0.385 0.308 0.256 0.154 0.102 67 Phần trăm bắt gốc tự DPPH chất nghiên cứu tính theo cơng thức sau: (A − Ac) Q(%) = [1 − (A0 − Ac)]x100 Trong đó: A độ hấp thu dung dịch chứa mẫu thử A0 độ hấp thu DPPH khơng có mẫu thử Ac độ hấp thu dung dịch chứa chất đối chiếu Q % gốc tự bị ức chế Bảng 14 giá trị OD xác định hoạt tính kháng DPPH Ascorbic acid Blank Co (µg/ml) 100.000 50.000 10.000 5.000 1.000 0.500 0.100 0.050 21 Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm Bảng15 khối lượng thể tích dịch trước sau quay Khối lượng cốc dịch cô quay (g) m mo m3 m6 m9 m12 m15 m18 22 Đồ án tốt nghiệp Bảng 16 giá trị OD hàm lượng anthocyanin dịch trước sau cô quay Thời pH1 gian 535nm phút 0.649 0.647 0.652 phút 0.648 0.647 0.649 phút 0.642 0.643 0.643 phút 0.639 0.641 0.639 12 phút 0.637 0.639 0.638 15 phút 0.635 0.634 0.636 18 phút 0.635 0.637 0.638 Bảng 17 OD hiệu suất thu hồi anthocyanin dịch trích ly sau quay Thời p gian m phút 0.649 0.652 phút 0.647 0.642 phút 23 Đồ án tốt nghiệp phút 12 phút 15 phút 18 phút Bảng 18 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD phút phút phút phút 12 phút 15 phút 18 phút Bảng 19 OD khảo sát khả kháng DPPH dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trước sau cô quay Blank Vitamine C Thời gian cô quay (p) phút phút phút phút 24 Đồ án tốt nghiệp 12 phút 15 phút 18 phút Bảng 20 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD 18 phút 15 phút 12 phút phút phút phút phút 25 ... trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định tỷ lệ HCl để pha dung môi tối ưu cho q trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định nhiệt độ tối ưu cho q trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định. .. giới nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng thực phẩm, chúng có tính an tồn cao cho người sử dụng Vì đề tài nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen hoạt tính chống oxy. .. hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 41 2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 43 2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy anthocyanin