Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học hoa sứ vàng (plumeria rubra f tricilor)​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC HOA SỨ VÀNG (PLUMERIA RUBRA F TRICILOR) Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1311100485 : Đinh Vũ Nghị Lớp: 13DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án TP HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực ĐINH VŨ NGHỊ Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để có kiến thức báo cáo tốt nghiệp ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn công nghệ sinh học trường HUTECH giảng dạy kiến thức bổ ích cho em Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến thầy ThS Phạm Minh Nhựt tận tình hướng dẫn, bảo em trình thực đồ án tốt nghiệp Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy phụ trách phịng thí nghiệm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp chúng em hồn thành tốt q trình thực hành Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình chăm sóc, dạy dỗ làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em suốt năm qua trình thực đồ án Em xin cảm ơn đến bạn thực đề tài phịng thí nghiệm quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp Và em xin cảm ơn Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Lời cuối em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cơ Tp Hồ Chí Minh, 27 tháng 07 năm 2016 Sinh viên thực ĐINH VŨ NGHỊ Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Hoa Sứ vàng 1.1.1 Nguồn gốc tên gọi 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Phân bố 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Công dụng 1.1.7 Thành phần hóa học dược chất .6 1.2 Đại cương số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 1.2.1 Khái niệm phân loại 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn hợp chất từ thực vật 1.2.3 Một số hợp chất kháng khuẩn Hoa Sứ vàng .8 1.2.3.1 Alkaloid 1.2.3.2 Flavonoid 10 1.2.3.3 Tinh dầu 11 1.2.3.4 Saponin 12 1.2.3.5 Tannin 13 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.4 Tình hình nghiên cứu Hoa Sứ giới Việt Nam 14 1.3 Giới thiệu số nhóm vi sinh vật gây bệnh 15 1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 15 1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 15 1.3.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Salmonella 16 1.3.1.3 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp 17 1.4.1.4 Nhóm vi khuẩn Shigella spp 18 1.3.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh hội da 20 1.3.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 20 1.3.2.2 Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis 21 1.3.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Staphylococcus 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.1.1 Địa điểm 25 2.1.2 Thời gian 25 2.2 Vật liệu 25 2.2.1 Vật liệu 25 2.2.2 Chủng vi sinh vật 25 2.2.3 Mơi trường ni cấy hóa chất 25 2.2.4 Thiết bị dụng cụ 26 2.2.4.1 Thiết bị 26 2.2.5.2 Dụng cụ 26 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp tách chiết hợp chất từ thực vật 27 2.3.2 Phương pháp tăng sinh 27 2.3.3 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 27 2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 27 ii Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 28 2.3.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào 28 2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu 28 2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn cao chiết .29 2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học 29 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 32 2.4 Bố trí thí nghiệm 32 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết Hoa Sứ vàng 36 2.4.3 Thí nghiệm 3: Định tính số thành phần hóa học loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ vàng 40 3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết Hoa Sứ vàng với loại dung môi tách chiết khác chủng vi khuẩn thị 41 3.2.1 Kết hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Escherichia coli 41 3.2.2 Kết hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Listeria spp 44 3.3.3 Kết hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Salmonella spp 46 3.3.4 Kết hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Shigella spp 48 3.3.5 Kết hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Vibrio spp 50 3.3.6 Kết hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn cịn lại 53 3.3.7 Tổng hợp kết hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết 20 vi khuẩn gây bệnh gây bệnh 55 iii Đồ án tốt nghiệp 3.3 Kết định tính số thành phần hóa học cao chiết Hoa Sứ vàng từ ethanol 70% 59 Kết luận kiến nghị 62 Kết luận 62 Kiến nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Phụ lục iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl Sulfoxide NA: Non activity DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết đường kính vịng ức chế (mm) loại cao chiết khác từ Hoa Sứ vàng 20 chủng vi sinh vật thị 55 Bảng 3.2 Kết định tính số thành phần hóa học cao chiêt Hoa Sứ vàng từ ethanol 70% 59 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hoa Sứ vàng Hình 1.2 Cây Hoa Sứ vàng Hình 1.3 Cơng thức hóa học fulvoplumierin plumierid Hình 1.4 Hình thái E.coli kính hiển vi điện tử 16 Hình 1.5 Hình thái Salmonella kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.6 Hình thái Vibrio kính hiển vi điện tử 18 Hình 1.7 Hình thái Shigella kính hiển vi điện tử 19 Hình 1.8 Hình thái Pseudomonas aeruginosa kính hiển vi điện tử 20 Hình 1.9 Hình thái Enterococcus faecalis kính hiển vi điện tử 22 Hình 1.10 Hình thái Staphylococcus kính hiển vi điện tử 23 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 33 Hình 2.2 Quy trình tách chiết thu cao Hoa Sứ vàng từ loại dung mơi khác 34 Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết Hoa Sứ vàng với chủng vi khuẩn thị 36 Hình 2.4 Quy trình định tính thành phần hóa học cao chiết Hoa Sứ vàng 38 Hình 3.1 Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ vàng với loại dung mơi 40 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết đối chứng nhóm vi khuẩn Escherichia coli 42 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết đối chứng nhóm vi khuẩn Listeria spp 44 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết đối chứng nhóm vi khuẩn Salmonella spp 46 Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết đối chứng nhóm vi khuẩn Shigella spp 49 Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết đối chứng nhóm vi khuẩn Vibrio spp 51 Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết đối chứng nhóm vi khuẩn cịn lại 53 vii Đồ án tốt nghiệp Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A B C C C B.5 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng nhóm vi khuẩn Vibrio spp B.5.1 Chủng V.cholerae Nồng độ 200 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK 16 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A B B B C Nồng độ 100 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A B C C C B.5.2 Chủng V.harveyi Nồng độ 200 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK 17 Đồ án tốt nghiệp Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A B B B C B.5.3 Chủng V.alginolyticus Nồng độ 200 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK 18 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping C C Nồng độ 100 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A B C C C B.5.4 Chủng V.parahaemolyticus Nồng độ 200 mg/ml The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK 19 Đồ án tốt nghiệp Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping B B Nồng độ 100 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A A B B B 20 Đồ án tốt nghiệp B.6 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng nhóm vi khuẩn lại B.6.1 Chủng P.aeruginosa Nồng độ 200 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK Source Model Error Corrected Total The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping B B B Nồng độ 100 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Dependent Variable: VKK Source Model Error Corrected Total 21 Đồ án tốt nghiệp Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A B C C C B.6.2 Chủng S.aureus Nồng độ 200 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A A B C C B.6.3 Chủng E.faecali Nồng độ 200 mg/ml 22 Đồ án tốt nghiệp Bảng The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping B B B Nồng độ 100 mg/ml Bảng The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Bảng The ANOVA Procedure Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A B B C C 23 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục C Kết hình ảnh khảo sát khả kháng khuẩn loại chiết chủng vi khuẩn thị A A E Coli - EtOH 96% A A S.enteritidis - EtOH 96% A A V.cholerae - EtOH 96% B V.harveyi – EtOH 50% (B) 24 Đồ án tốt nghiệp A B A E faecalis - EtOH 96% A A L.innocua – EtOH 96% B L.monocytogenes – EtOH 96% 25 Đồ án tốt nghiệp Phục lục D Kết hình ảnh xác định số thành phần hóa học cao chiết Hoa Sứ vàng từ Ethanol 70% D.1 Kết dương tính thử nghiệm định tính Carbohydrate A B A Thử nghiệm Molisch B Thử nghiệm Barfoed D.2 Kết dương tính thử nghiệm định tính Alkaloid A A Thử nghiệm Mayer B Thử nghiệm Dragendorff 26 Đồ án tốt nghiệp D.3 Kết dương tính thử nghiệm định tính Saponin Thử nghiệm Foam test D.4 Kết dương tính thử nghiệm định tính Cardiac Glycosides Thử nghiệm Legal 27 Đồ án tốt nghiệp D.5 Kết dương tính thử nghiệm định tính Flavonoid Thử nghiệm Ferric chloride test D.6 Kết dương tính thử nghiệm định tính Steroid Thử nghiệm Salkowski 28 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục E Cách pha loại thuốc thử test thành phần hóa học E.1 Thuốc thử Molisch Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml E.2 Thuốc thử Fehling Thuốc thử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O hòa tan hồn tồn vào nước cất, sau tiếp tục định mức đến 500ml Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H 2O vào nước cất định mức 500ml E.3 Thuốc thử Barfoed Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gồm 10 ml acid acetic glacial 1000ml nước cất Hỗn hợp mang đun khuấy đến tan hoàn toàn E.4 Thuốc thử Mayer Hòa tan 1,358g HgCl2 60ml nước cất Tiếp tục cân 5g KI hòa tan 10ml nước cất Sau tiến hành trộn dung dịch lại với định mức nước cất đến100 ml E.5 Thuốc thử Dragendorff: Gồm dung dịch Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan nước cất Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70ml nước cất E.6 Thuốc thử Hager Hòa tan g acid picric vào 100ml nước cất, sau lọc dung dịch thu dịch lọc E.7 Thuốc thử Wagner Hòa tan 2g I2 6g KI vào nước cất định mức đến 100ml Thuốc thử dung dịch tan hoàn toàn, tránh tiếp xúc ánh sáng 29 Đồ án tốt nghiệp E.8 Natri nitro prusside Hòa tan1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nước cất E.9 Thuốc thử Resazurin Resazurin có dạng viên nén, nghiền nhuyễn viên Resazurin hòa tan với 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản tủ lạnh 30 ... dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ Hoa Sứ vàng Xác định sơ thành phần hóa học cao chiết Nội dung nghiên cứu Xác định hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết Hoa Sứ vàng từ dung... Mẫu Hoa Sứ vàng Xử lý mẫu Tách chiết thu hồi cao Cao chiết Hoa Sứ vàng loại cao khác Đánh giá hiệu suất thu hồi loại cao chiết Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết Xác định thành phần hóa. .. đề định chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn số cao chiết bước đầu định tính thành phần hóa học Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F Tricilor)” để thực đồ án tốt nghiệp - Mục tiêu nghiên cứu