Thông tin tài liệu
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Trung tận tình hƣớng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố học, đặc biệt thầy mơn Hố Phân Tích, cho em kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em đƣợc học tập nghiên cứu môi trƣờng đại Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi để đƣợc học tập hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ nhiều q trình làm thực nghiệm Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, năm 2012 Học viên Vũ Thị Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN……………………… ………………………….… 1.1 Giới thiệu kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)…………………………… 1.1.1 Lịch sử phát hiện………………………………………………………… .….3 1.1.2 Phân loại SAs……………………………………………………………… 1.1.3 Cấu tạo SAs……………………………………………………………….4 1.1.4 Tác dụng SAs…………………………………………………………… 1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid 1.1.6 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép SAs thực phẩm 1.2 Các phƣơng pháp xác định SAs 1.2.1 Trong nƣớc 10 1.2.2 Thế giới 10 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng……………………………………… …19 2.2.2 Detector khối phổ………………………………………………………….…21 2.2.3 Phân tích định tính định lƣợng LC/MS…………………………….26 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu…………………… …26 2.3.1 Thiết bị dụng cụ……………………………………………………… .…26 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn…………………………………………………… …27 2.4 Lấy mẫu 28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tối ƣu điều kiện tách xác định Sulfonamid thiết bị LC/MS/MS 29 3.1.1 Tối ƣu điều kiện detector khối phổ (MS)………………………… 29 3.1.2 Lựa chọn cột tách……………………………………………………… …32 3.1.3 Khảo sát chƣơng trình gradient………………………………………… …32 3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động 36 3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic pha động 38 3.2 Tối ƣu q trình xử lý mẫu phân tích SAs 3.2.1 Khảo sát qui trình chiết 3.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic dung môi chiết 3.2.3 Khảo sát thành phần MeOH dung môi chiết 3.2.4 Khảo sát khối lƣợng pha rắn PSA 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đƣờng chuẩn 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) phƣơng pháp 3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) độ (độ thu hồi) 3.3 Phân tích mẫu thực KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic pha động Phụ lục 2: Kết khảo sát qui trình chiết mẫu Phụ lục 3: Kết khảo sát nồng độ acid acetic dung môi chiết Phụ lục 4: Kết khảo sát nồng độ MeOH dung môi chiết khối lƣợng PSA Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi) Phụ lục tế DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học số SAs đƣợc xác định đề tài Bảng 1.2: Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép SAs số thị trƣờng Bảng 3.1: Các thơng số tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu cho nguồn khí 29 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs 38 Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết SAs 44 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi SAs 45 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs 46 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs 48 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs 49 Bảng 3.9 : Cách pha dung dịch chuẩn để lập đƣờng chuẩn có chứa IS 53 Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn SAs (có IS) 53 Bảng 3.11: Đƣờng chuẩn SAs (khơng có IS) 55 Bảng 3.12: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng SAs 56 Bảng 3.13: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi SAs mẫu thịt lợn 5ppb 59 Bảng 3.14: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi SAs mẫu thịt lợn 10ppb 61 Bảng 3.16: Qui định độ chụm phƣơng pháp định lƣợng phụ thuộc nồng độ chất theo 2002/657/EC 65 Bảng 3.17: Kết phân tích mẫu thực 67 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 2.1: Sơ đồ khối khối phổ kế Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI Hình 2.3: Cấu tạo phân tích khối tứ cực MS/MS Hình 3.1: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient Hình 3.2: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient Hình 3.3: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient Hình 3.4: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient Hình 3.5: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,2 ml/phút Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dịng 0,3 ml/phút Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dịng 0,4 ml/phút Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,5 ml/phút Hình 3.10: Sắc đồ SAs nồng độ acid formic 0,15% Hình 3.11: Ảnh hƣởng quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi SIM Hình 3.12: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs Hình 3.13: Sắc đồ 10SAs nồng độ acid acetic 1% Hình 3.14: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs Hình 3.15: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs Hình 3.16: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ STZ khoảng 0,5-500ppb Hình 3.17: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ SDM khoản 49 50 52 52 0,5-500ppb Hình 3.18: Đƣờng chuẩn SMM (R = 1,0000) Hình 3.19: Đƣờng chuẩn SSA (R = 0,9991) Hình 3.20: Đƣờng chuẩn SIM (R = 0,9999) Hình 3.21: Đƣờng chuẩn SSA (R = 0,9998) Hình 3.22: Sắc đồ SMM giới hạn phát LOD 0,025ppb (S/N = 3,5) Hình 3.23: Sắc đồ STZ giới hạn phát LOD 0,025ppb (S/N = 3,3) Hình 3.24: Sắc đồ SP giới hạn định lƣợng LOQ 0,05ppb (S/N = 10,5) Hình 3.25: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 5ppb Hình 3.26: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 10ppb Hình 3.27: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 20ppb Hình 3.28: Sắc đồ mẫu gan lợn khơng nhiễm SAs Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phủ tạng gà nhiễm SDM DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN Aceton CE Collisi EI Electro ESI Eelect EU Europ HPLC High chrom IUPAC Interna Applie LOD Limit LOQ Limit MeOH Metha MRL Maxim PSA Primar RSD Relativ SPE solid p U.S NRP United Progra UPLCMS/MS Ultral chrom spectro UV Ultrav MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm mối quan tâm hàng đầu toàn xã hội An toàn thực phẩm sản phẩm chăn nuôi không đơn sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà cịn chỗ sản phẩm chứa chất gây ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất) Trong vô sốcác nguyê n nhân dâñ đế n viê cc̣ an toàn vê c̣sinh t hƣcc̣ phẩ m , t hì vấn đề dƣ lƣợ ng thuốc kháng sinh tồn dƣ chấ t kíc h t hí ch tă ng trongc̣ t hị t gia súc gia cầm c ũng thực trạng nan giải đáng báo động Với mô ṭl ƣơngc̣ thƣcc̣ phẩm khổng lồtƣƣ̀đ ôngc̣ vâṭđ ang đƣơcc̣ tiê u thu c̣trê n t hi trƣợƣ̀ng , nghĩ đế n viê cc̣ ngày thể đa ng phải dần t ich ́ lũy dƣ lƣơngc̣ c hất ki ch ́ thich ́ tăng trongc̣ vàthuốc kháng sinh Nguyên nhân ngƣời dân sƣƣ̉ dungc̣ tùy tiêṇ loại thức ăn tăng trọng thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh giúp vật ni mau ăn chóng lớn Hâụ quảlàdƣ lƣơngc̣ chất kich́ thich́ vàthuốc kháng sinh thiṭgia súc , gia cầm vƣơṭ ngƣỡng cho phép gấp nhiều lần , không gây ngô c̣ đôcc̣ cấp tinh́ tƣ́c thời , nhƣng se ̃gây nguy haịvềlâu dài cho sƣ́c khỏe ngƣờ i tiêu dùng Sulfonamid (SAs) nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng vai trò quan trọng hiệu việc hạn chế nhiễm trùng vi khuẩn vi sinh vật hệ thống tiêu hóa vật ni Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn điều trị loạt bệnh gia súc gia cầm nhƣ bệnh tiêu hóa hay hơ hấp Song hệ khơng thể tránh khỏi sử dụng nhóm chất kháng sinh tồn dƣ chúng thịt gia súc gia cầm, gây nguy kháng thuốc kháng sinh vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng vật nuôi, gây hại cho sức khỏe ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ kháng thuốc [1] Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy thiếu sót cơng tác kiểm tra, tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, sơ xuất nấu nƣớng, vệ sinh 10 Hình P3.8: Hiệu suất thu hồi SSA phụ thuộc nồng độ acid acetic dung mơi chiết Hình P3.9: Hiệu suất thu hồi SDM phụ thuộc nồng độ acid acetic dung mơi chiết Hình P3.10: Sắc đồ phân tích SAs nồng độ acid acetic 1% Phụ lục 4: Kết khảo sát nồng độ MeOH dung mơi chiết khối lƣợng PSA Hình P4.1: Hiệu suất thu hồi SD phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.2: Hiệu suất thu hồi SM phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.3: Hiệu suất thu hồi SP phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.4: Hiệu suất thu hồi SMM phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.5: Hiệu suất thu hồi SMX phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi) Hình P5.1: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 1) Hình P5.2: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 2) Hình P5.3: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 3) Hình P5.4: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 4) Hình P5.5: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 5) Hình P5.6: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 6) Hình P5.7: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 1) Hình P5.8: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 2) Hình P5.9: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 3) Hình P5.10: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 4) Hình P5.11: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 5) Hình P5.12: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 6) Hình P5.13: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 1) Hình P5.14: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 2) Hình P5.15: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 3) Hình P5.16: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 4) Hình P5.17: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 5) Hình P5.18: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 6) Phụ lục 6: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực tế Hình P6.1: Sắc đồ mẫu thịt bị khơng phát SAs Hình P6.2: Sắc đồ mẫu thịt gà không phát SAs Hình P6.3: Sắc đồ mẫu thận lợn khơng phát SAs ... Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ phƣơng pháp đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh xác Vì vậy, tiến hành đề tài: ? ?Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ( LC -MS/ MS) xác đinh dư lượng số kháng sinh nhóm. .. khác nhóm kháng sinh phù hợp với tách sắc ký lỏng Do vậy, tiến hành xác định dƣ lƣợng 10 kháng sinh nhóm SAs thịt gia súc gia cầm phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS/ MS) Đây phƣơng pháp đại,... - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC- MS/ MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.29 LUẬN VĂN
Ngày đăng: 20/11/2020, 09:37
Xem thêm:
