Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS HỒ HỮU THỌ TS MAI THỊ ĐÀM LINH Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Hồ Hữu Thọ - Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học Viện Quân Y người thầy tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS Mai Thị Đàm Linh – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN người hướng dẫn, bảo tận tình, truyền đạt kiến thức giúp đỡ suốt thời gian học tập thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn đồng nghiệp Phòng Công nghệ gen Di truyền tế bào giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tơi xin trân trọng cảm ơn tồn thể thầy, cô giáo Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019 Học viên Lê Thị Thúy MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 10 ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1.1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh sốt mò 1.1.1 Dịch tễ học 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng 1.1.3 Điều trị 1.1.4 Phòng bệnh sốt mò 10 1.2 Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi 10 1.2.1 Đặc điểm sinh học 10 1.2.2 Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò 14 1.2.3 Cơ chế gây bệnh sốt mò 18 1.3 Các phương pháp chẩn đốn bệnh sốt mị 22 1.3.1 Phương pháp huyết học 22 1.3.2 Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR .24 1.3.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) 24 CHƯƠNG : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 34 2.2 Thiết kế mồi probe cho phản ứng RPA 34 2.2 Tổng hợp chứng dương nhân tạo 35 2.3 Kiểm tra khả khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa nhóm nghiên cứu thiết kế 35 2.4 Tối ưu quy trình RPA thiết lập 37 2.4.1 Tối ưu điều kiện phản ứng 37 2.4.2 Tối ưu thành phần phản ứng 38 2.5 Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại) 39 2.6 Đánh giá ngưỡng phát 40 2.7 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu so sánh với kit thương mại có thị trường 41 2.7.1 Đánh giá độ nhạy 41 2.7.2 Đánh giá độ đặc hiệu 41 CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 Thiết kế mồi probe đặc hiệu gen đích 47-kDa 43 3.2 Kiểm tra khả khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa 44 3.3 Kết tối ưu quy trình RPA 45 3.4 Quy trình RPA phát O tsutsugamushi 52 3.5 Ngưỡng phát quy trình RPA 55 3.6 Đánh giá so sánh độ nhạy với kit thương mại có thị trường (PrimerDesign) 57 3.7 Đánh giá so sánh độ đặc hiệu với kit thương mại có thị trường 59 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 84 Phụ lục 1: Danh sách mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi 84 Phụ lục 2: Kết tách chiết chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đoán phân biệt sốt mò 85 Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng kit khuếch đại đẳng nhiệt phát O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) nhóm nghiên cứu chế tạo 86 Phụ lục 4: Hình ảnh kit khuếch đại đẳng nhiệt phát O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) nhóm nghiên cứu chế tạo 87 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh sốt mò giới [141] Hình 1.2 Hình ảnh nốt lt mị đốt Hình 1.3 Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập ký sinh tế bào nội mô mạch máu Hình 1.4 Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense Hình 1.5 Mơ hình q trình hấp thu vận chuyển nội bào O tsutsugamushi [62] Hình 1.6 Chu trình phản ứng RPA [53] Hình 1.7 Sơ đồ mơ tả cấu trúc exo probe [53] Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng nghiên cứu Hình 3.1 Kết so sánh mức độ tương đồng trình tự gen 47-kDa O tsutsugamushi Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) mồi ngược (C) nghiên cứu nhóm nghiên cứu nghiên cứu công bố Chao cs [38] 44 Hình 3.2 Kết kiểm tra khả khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa trình mồi probe nghiên cứu Hình 3.3 Kết tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát O tsutsugamushi Hình 3.4 Kết tối ưu nồng độ mồi phản ứng RPA phát O tsutsugamushi 49 Hình 3.5 Kết tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O tsutsugamushi Hình 3.6 Kết tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O tsutsugamushi 51 Hình 3.7 Kết đánh giá ngưỡng phát quy trình RPA phát O tsutsugamushi 55 Hình 3.8 Kết đánh giá ngưỡng phát quy trình realtime PCR (PrimerDesign) phát O tsutsugamushi 56 Hình 3.9 Đánh giá độ nhạy quy trình RPA quy trình realtime PCR mẫu dương tính giả định với O tsutsugamushi (tp1-tp10) 59 Hình 3.10 Kết đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) mẫu âm tính chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đoán phân biệt sốt mò 60 Hình 3.11 Kết đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi mẫu âm tính chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đoán phân biệt 62 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Dịch sốt mò số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] Bảng 1.2: Tóm tắt thành phần, nồng độ vai trò thành phần phản ứng RPA 26 Bảng 1.3: Bảng so sánh số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt 32 Bảng 2.1: Nồng độ thành phần ban đầu sử dụng phản ứng RPA .36 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR 39 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt 40 Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát O tsutsugamushi 43 Bảng 3.2: Bảng kết tối ưu thành phần phản ứng RPA 52 Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix 52 Bảng 3.4: So sánh thời gian phát tương ứng nồng độ quy trình phát O tsutsugamushi 57 Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu quy trình 62 DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TT Phần viết tắt bp DNA kb LAMP NAT PCR RNA RPA 77 97 Lillis, Lorraine, Dara Lehman, Mitra C Singhal, Jason Cantera, Jered Singleton, Paul Labarre, Anthony Toyama, Olaf Piepenburg, Mathew Parker, and Robert Wood, (2014),"Non-instrumented incubation of a recombinase polymerase amplification assay for the rapid and sensitive detection of proviral HIV-1 DNA" PloS one, 9(9): p e108189 98 Liu, Y X., N Jia, J J Suo, Y B Xing, G Liu, H J Xiao, N Jia, Z T Zhao, J S Min, P T Feng, S B Ma, J H Richardus, and W C Cao, (2009),"Characteristics of pediatric scrub typhus in a new endemic region of northern China" Pediatr Infect Dis J, 28(12): p 1111-4 99 Luce-Fedrow, A., M L Lehman, D J Kelly, K Mullins, A N Maina, R L Stewart, H Ge, H S John, J Jiang, and A L Richards, (2018),"A Review of Scrub Typhus (Orientia tsutsugamushi and Related Organisms): Then, Now, and Tomorrow" Trop Med Infect Dis, 3(1) 100 Lutz, S., P Weber, M Focke, B Faltin, J Hoffmann, C Muller, D Mark, G Roth, P Munday, N Armes, O Piepenburg, R Zengerle, and F von Stetten, (2010),"Microfluidic lab-on-a-foil for nucleic acid analysis based on isothermal recombinase polymerase amplification (RPA)" Lab Chip, 10(7): p 887-93 101 Mahajan, S K., (2005),"Scrub typhus" J Assoc Physicians India, 53: p 954-8 102 Mahajan, S K and S K Mahajan, (2017),"Neuropsychiatric Manifestations of Scrub Typhus" J Neurosci Rural Pract, 8(3): p 421-426 103 Martinez, J J., S Seveau, E Veiga, S Matsuyama, and P Cossart, (2005),"Ku70, a component of DNA-dependent protein kinase, is a mammalian receptor for Rickettsia conorii" Cell, 123(6): p 1013-23 104 McHugh, T D., C F Pope, C L Ling, S Patel, O J Billington, R D Gosling, M C Lipman, and S H Gillespie, (2004),"Prospective evaluation of 78 BDProbeTec strand displacement amplification (SDA) system for diagnosis of tuberculosis in non-respiratory and respiratory samples" J Med Microbiol, 53(Pt 12): p 1215-9 105 Morgan, M R., M J Humphries, and M D Bass, (2007),"Synergistic control of cell adhesion by integrins and syndecans" Nat Rev Mol Cell Biol, 8(12): p 957-69 106 Mori, Y and T Notomi, (2009),"Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases" J Infect Chemother, 15(2): p 62-9 107 Murali, N., S Pillai, T Cherian, P Raghupathy, V Padmini, and E Mathai, (2001),"Rickettsial infections in South India - how to spot the spotted fever" Indian Pediatr, 38(12): p 1393-6 108 Nadjm, B., P T Thuy, V D Trang, D Ha le, N V Kinh, and H F Wertheim, (2014),"Scrub typhus in the northern provinces of Vietnam: an observational study of admissions to a national referral hospital" Trans R Soc Trop Med Hyg, 108(11): p 739-40 109 Niemz, A., T M Ferguson, and D S Boyle, (2011),"Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases" Trends Biotechnol, 29(5): p 24050 110 Okazaki, T and A Kornberg, (1964),"Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid Xv Purification and Properties of a Polymerase from Bacillus Subtilis" J Biol Chem, 239: p 259-68 111 Paris, D H., S D Blacksell, P N Newton, and N P Day, (2008),"Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi by loop-isothermal DNA amplification" Trans R Soc Trop Med Hyg, 102(12): p 1239-46 112 Paris, D H., T R Shelite, N P Day, and D H Walker, (2013),"Unresolved problems related to scrub typhus: a seriously neglected life-threatening disease" Am J Trop Med Hyg, 89(2): p 301-7 79 113 Park, S W., N Y Ha, B Ryu, J H Bang, H Song, Y Kim, G Kim, M D Oh, N H Cho, and J K Lee, (2015),"Urbanization of scrub typhus disease in South Korea" PLoS Negl Trop Dis, 9(5): p e0003814 114 Piepenburg O, Armes endonuclease NA, (2011),"DNA glycosylase/lyase and ap http://www google.com/patents/US20110053153 substrates" (Accessed February2016) 115 Piepenburg, O., C H Williams, D L Stemple, and N A Armes, (2006),"DNA detection using recombination proteins" PLoS Biol, 4(7): p 1115-21 116 Piepenburg, O., C H Williams, D L Stemple, and N A Armes, (2006),"DNA detection using recombination proteins" PLoS Biol, 4(7): p e204 117 Piepenburg, Olaf, Colin H Williams, Derek L Stemple, and Niall A Armes, (2006),"DNA detection using recombination proteins" PLoS biology, 4(7): p e204 118 Prakash, J A., M L Kavitha, and E Mathai, (2011),"Nested polymerase chain reaction on blood clots for gene encoding 56 kDa antigen and serology for the diagnosis of scrub typhus" Indian J Med Microbiol, 29(1): p 47-50 119 Rikihisa, Y and S Ito, (1982),"Entry of Rickettsia tsutsugamushi into polymorphonuclear leukocytes" Infect Immun, 38(1): p 343-50 120 Riley, S P., K C Goh, T M Hermanas, M M Cardwell, Y G Chan, and J J Martinez, (2010),"The Rickettsia conorii autotransporter protein Sca1 promotes adherence to nonphagocytic mammalian cells" Infect Immun, 78(5): p 1895-904 121 Rodkvamtook, W., T Ruang-Areerate, J Gaywee, A L Richards, P Jeamwattanalert, D Bodhidatta, N Sangjun, A Prasartvit, A Jatisatienr, and C Jatisatienr, (2011),"Isolation and characterization of Orientia tsutsugamushi 80 from rodents captured following a scrub typhus outbreak at a military training base, Bothong district, Chonburi province, central Thailand" Am J Trop Med Hyg, 84(4): p 599-607 122 RPA Assay Design, https://www.twistdx.co.uk/en/support/ rpa- assay-design-2, (accessed Oct 4th, 2018)" 123 Salje, J., (2017),"Orientia tsutsugamushi: A neglected but fascinating obligate intracellular bacterial pathogen" PLoS Pathog, 13(12): p e1006657 124 Sarma, N and S Chakraborty, (2017),"Scrub Typhus in Southern Districts of West Bengal" Indian J Dermatol, 62(5): p 512-514 125 Sasaki, Y., D Miyoshi, and N Sugimoto, (2007),"Regulation of DNA nucleases by molecular crowding" Nucleic Acids Res, 35(12): p 408693 126 Shamoo, Y., A M Friedman, M R Parsons, W H Konigsberg, and T A Steitz, (1995),"Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA binding protein (T4 gp32) complexed to DNA" Nature, 376(6538): p 362-6 127 Singhsilarak, T., W Leowattana, S Looareesuwan, V Wongchotigul, J Jiang, A L Richards, and G Watt, (2005),"Short report: detection of Orientia tsutsugamushi in clinical samples by quantitative real-time polymerase chain reaction" Am J Trop Med Hyg, 72(5): p 640-1 128 Tamura, A., H Urakami, and N Ohashi, (1991),"A comparative view of Rickettsia tsutsugamushi and the other groups of rickettsiae" Eur J Epidemiol, 7(3): p 259-69 129 Tamura, A., N Ohashi, H Urakami, and S Miyamura, (1995),"Classification of Rickettsia tsutsugamushi in a new genus, Orientia gen nov., as Orientia tsutsugamushi comb nov" Int J Syst Bacteriol, 45(3): p 58991 130 Tantibhedhyangkul, W., E Wongsawat, S Silpasakorn, D Waywa, N Saenyasiri, J Suesuay, W Thipmontree, and Y Suputtamongkol, (2017),"Use 81 of Multiplex Real-Time PCR To Diagnose Scrub Typhus" J Clin Microbiol, 55(5): p 1377-1387 131 Tantibhedhyangkul, Wiwit, Ekkarat Wongsawat, Saowaluk Silpasakorn, Duangdao Waywa, Nuttawut Saenyasiri, Jintapa Suesuay, Wilawan Thipmontree, and Yupin Suputtamongkol, (2017),"Use of multiplex real-time PCR to diagnose scrub typhus" Journal of clinical microbiology, 55(5): p 1377-1387 132 Taylor, A J., D H Paris, and P N Newton, (2015),"A Systematic Review of Mortality from Untreated Scrub Typhus (Orientia tsutsugamushi)" PLoS Negl Trop Dis, 9(8): p e0003971 133 Tris, https://en.wikipedia.org/wiki/Tris, (accessed Oct 4th, 2018)" 134 U.S Food and Drug Administration Nucleic Acid Based Tests List of Microbial Tests 2015 [cited 2015 08-04-2015]; Available from: http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitro Diagnostics/ucm330711.htm 135 Valbuena, G and D H Walker, (2012),"Approaches to vaccines against Orientia tsutsugamushi" Front Cell Infect Microbiol, 2: p 170 136 Van Ness, J., L K Van Ness, and D J Galas, (2003),"Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides" Proc Natl Acad Sci U S A, 100(8): p 4504-9 137 Vincent, M., Y Xu, and H Kong, (2004),"Helicase-dependent isothermal DNA amplification" EMBO Rep, 5(8): p 795-800 138 Watt, G and P Parola, (2003),"Scrub typhus and tropical rickettsioses" Curr Opin Infect Dis, 16(5): p 429-36 139 Wongprompitak, P., W Anukool, E Wongsawat, S Silpasakorn, V Duong, P Buchy, S Morand, R Frutos, P Ekpo, and Y Suputtamongkol, 82 (2013),"Broad-coverage molecular epidemiology of Orientia tsutsugamushi in Thailand" Infect Genet Evol, 15: p 53-8 140 Xian, X., S Gopal, and J R Couchman, (2010),"Syndecans as receptors and organizers of the extracellular matrix" Cell Tissue Res, 339(1): p 31-46 141 Xu, G., D H Walker, D Jupiter, P C Melby, and C M Arcari, (2017),"A review of the global epidemiology of scrub typhus" PLoS Negl Trop Dis, 11(11): p e0006062 142 Yan, L., J Zhou, Y Zheng, A S Gamson, B T Roembke, S Nakayama, and H O Sintim, (2014),"Isothermal amplified detection of DNA and RNA" Mol Biosyst, 10(5): p 970-1003 143 Zhao, X., L R Hilliard, S J Mechery, Y Wang, R P Bagwe, S Jin, and W Tan, (2004),"A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles" Proc Natl Acad Sci U S A, 101(42): p 15027-32 83 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh sách mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi (Nhóm người khỏe mạnh) Ký STT hiệu 10 tn1 tn2 tn3 tn4 tn5 tn6 tn7 tn8 tn9 tn10 84 Phụ lục 2: Kết tách chiết chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đốn phân biệt sốt mị STT Vi khuẩn Leptospira Patoc Leptospira serovar Pomona Leptospira serovar Australis Dengue virrus Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Proteus mirabiles Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae 10 E.coli 85 Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng kit khuếch đại đẳng nhiệt phát O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) nhóm nghiên cứu chế tạo (Chứng nhận cấp Viện Kiểm định Quốc Gia Vắc xin Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế, Việt Nam) 86 Phụ lục 4: Hình ảnh kit khuếch đại đẳng nhiệt phát O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) nhóm nghiên cứu chế tạo 87 ... đề tài ? ?Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát tác nhân gây bệnh sốt mò? ?? với hai mục tiêu chính: 1) Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt. .. HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số... dụng phát acid nucleic chẩn đoán bệnh thực địa khu vực hạn chế nguồn lực Hiện nay, giới có nghiên cứu thiết lập quy trình RPA nhằm phát nhanh xác tác nhân gây bệnh sốt mị -O tsutsugamushi Các quy