Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất kết hợp curcumin với diacid

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM NGỌC VĂN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT KẾT HỢP CURCUMIN VỚI DIACID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM NGỌC VĂN MÃ SINH VIÊN: 1501548 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT KẾT HỢP CURCUMIN VỚI DIACID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hải NCS Phạm Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải NCS-ThS.Phạm Thị Hiền, người thầy, cô trực tiếp định hướng, tận tình hướng dẫn, bảo cho kiến thức, kinh nghiệm, động viên tạo điều kiện cho tơi q trình thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Đình Luyện TS Nguyễn Văn Giang nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ, khích lệ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập trường Trong trình thực khóa luận tơi nhận giúp đỡ cán thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, cán khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên, xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình người bạn bè tơi Nguyễn Hịa Bình, Phạm Thị Mát, Trần Bá Hiến anh chị, bạn bè thực khóa luận phịng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược, Bộ mơn Cơng nghiệp Dược ln giúp đỡ, động viên tơi q trình thực khóa luận tốt nghiệp Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Phạm Ngọc Văn MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 1.1.1 Cấu trúc hóa học 1.1.2 Tính chất lý hóa, độ ổn định 1.1.3 Hoạt tính sinh học: 1.2 PHẢN ỨNG HYDROXYETHYL HÓA MỘT SỐ THUỐC VÀ CURCUMIN 1.2.1 Phản ứng hydroxyethyl hóa số thuốc 1.2.2 Phản ứng hydroxyethyl hóa curcumin 1.3 VAI TRÒ CỦA DIACID TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN MỘT SỐ THUỐC, HOẠT CHẤT VÀ CURCUMIN 1.3.1 Vai trò diacid nghiên cứu phát triển số thuốc, hoạt chất 1.3.2 Vai trò diacid nghiên cứu phát triển curcumin 13 1.4 LỰA CHỌN HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN LIỆU – THIẾT BỊ 16 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Tổng hợp hóa học 18 2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 19 2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học 19 2.3.4 Thử hoạt tính sinh học 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 24 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 24 3.1.1 Tổng hợp (A-1) 24 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2,2’-(curcumin-di-O-yl) diethyl diglutarat (A-2) 25 3.1.3 Tổng hợp dẫn chất 2,2’-(curcumin-di-O-yl) diethyl disuccinat (A-3) 28 3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 31 3.2.1 Kết phân tích phổ di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (A-1) 32 3.2.2 Kết phân tích phổ 2,2’-(curcumin-di-O-yl) diethyl diglutarat (A-2) 34 3.2.3 Kết phân tích phổ 2,2’-(curcumin-di-O-yl) diethyl disuccinat (A-3) 37 3.3 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 40 3.3.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH 40 3.3.2 Thử hoạt tính ức chế sinh NO 40 3.3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 41 3.4 BÀN LUẬN 42 3.4.1 Về q trình tổng hợp hóa học 42 3.4.2 Về xác định cấu trúc sản phẩm 48 3.4.3 Về hoạt tính sinh học hai sản phẩm 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic resonance) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) α-TS α-tocopheryl succinat A-1 Di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin A-2 2,2’-(curcumin-di-O-yl) diethyl diglutarat A-3 2,2’-(curcumin-di-O-yl) diethyl disuccinat AR Tinh khiết phân tích (analytical reagent) ACTH Hormon kích thích vỏ thượng thận (adrenocorticotropic hormon) AR Androgen receptor Bcl-2 B-cell lymphoma COX Cyclooxygenase CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DG Dexamethason-21-hemiglutarat DMM Môi trường nuôi cấy Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DS Dexamethason-21-hemisuccinat ĐvC Đơn vị carbon FBS Huyết bào thai bò (Fetal bovine serum) g Gam h Giờ Hela Tế bào ung thư tử cung người (Human cervix carcinoma) HepG2 Tế bào ung thư gan người (Human hepatocellular carcinoma) HL-60 Tế bào ung thư bạch cầu cấp người (Human acute leukemia) HIV Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus) HPV Virus gây ung thư cổ tử cung (Human papillomavirus) HPLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao iNOS Enzyme nitric oxide synthase IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at 50%) IL Interleukin IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) IFN Các protein tự nhiên giúp điều chỉnh hoạt động hệ thống miễn dịch JAK/STAT Janus kinase/signal transducer and activator of transcription MAPK Mitogen-activated protein kinases MCF7 Tế bào ung thư vú người (Human breast carcinoma) MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) OD Mật độ quang học PANC-1 Tế bào ung thư tuyến tụy người PC-3 Tế bào ung thư tuyến tiền liệt người RAW 264.7 Dòng đại thực bào chuột 264.7 Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) ROS Gốc tự oxy hóa (Reactive Oxygen Species) RNOS Gốc tự oxid nito hóa SC50 Nồng độ trung hòa 50% gốc tự (Scavenging concentration at 50%) SKBR-3 Tế bào ung thư vú người SKLM Sắc ký lớp mỏng SMAD Protein chuyển đổi tín hiệu cho thụ thể biến đổi yếu tố tăng trưởng SRB Sulforhodamin B STAT3 Signal transducer and activator of transcription t°nc Nhiệt độ nóng chảy TCA Acid tricloracetic TNF Yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) TGF-β Yếu tố thay đổi tăng trưởng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục nguyên liệu – hóa chất 16 Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ - thiết bị 17 Bảng 3.1: Khảo sát ảnh hưởng xúc tác đến phản ứng tạo A-2 26 Bảng 3.2: Khảo sát tỷ lệ mol anhydrid glutaric : A-1 đến phản ứng tạo A-2 .26 Bảng 3.3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến phản ứng tạo A-2 27 Bảng 3.4: Khảo sát lượng dung môi đến thời gian phản ứng tạo A-2 28 Bảng 3.5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến phản ứng tạo A-3 30 Bảng 3.6: Khảo sát tỉ lệ mol anhydrid succinic : A-1 đến phản ứng tạo A-3 .30 Bảng 3.7: Khảo sát ảnh hưởng xúc tác đến phản ứng tạo A-3 31 Bảng 3.8: Kết đo MS A-1 32 Bảng 3.9: Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) A-1 32 Bảng 3.10: Kết phân tích phổ 1H-NMR (DMSO) A-1 33 Bảng 3.11: Kết phân tích phổ 13C-NMR (DMSO) A-1 33 Bảng 3.12: Kết đo phổ MS A-2 .34 Bảng 3.13: Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) A-2 35 Bảng 3.14: Kết phân tích phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) A-2 .35 Bảng 3.15: Kết phân tích phổ 13C-NMR (DMSO) A-2 36 Bảng 3.16: Kết đo MS A-3 37 Bảng 3.17: Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) A-3 38 Bảng 3.18: Kết phân tích phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) A-3 .38 Bảng 3.19: Kết phân tích phổ 13C-NMR (DMSO) A-3 39 Bảng 3.20: Kết thử hoạt tính chống oxy hóa 40 Bảng 3.21: Kết đo hoạt tính sinh học ức chế sinh NO 40 Bảng 3.22: Tác động mẫu nghiên cứu đến sống sót tế bào RAW 264.7 .41 Bảng 3.23: Kết thử nghiệm gây độc tế bào Hela HL-60 41 Bảng 3.24: Kết thử nghiệm gây độc tế bào HepG2 MCF7 41 Bảng 3.25: Hoạt tính chống oxy hóa 55 Bảng 3.26: Hoạt tính chống viêm ức chế NO 55 Bảng 3.27: Hoạt tính ức chế tế bào Hela HL-60 .55 Bảng 3.28: Hoạt tính ức chế tế bào HepG2 MCF-7 55 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo curcumin .3 Hình 1.2: Dạng hỗ biến diceton - enol curcumin dung dịch Hình 1.3: Phản ứng cộng Michael curcumin với protein thiol thể .4 Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp troxerutin từ rutin Hình 1.5: Sơ đồ tổng hợp everolimus từ rapamycin .8 Hình 1.6: Dẫn chất hydroxyethyl hóa curcumin .8 Hình 1.7: Cơng thức diacid .9 Hình 1.8: Sơ đồ tổng hợp artesunat .10 Hình 1.9: Cấu trúc α-tocopheryl succinat 10 Hình 1.10: Sơ đồ tổng hợp ester diacid với dẫn chất acid ursolic 11 Hình 1.11: Sơ đồ tổng hợp piroxicam maleat 11 Hình 1.12: Sơ đồ tổng hợp metronidazol monosuccinat .12 Hình 1.13: Sơ đồ tổng hợp dexamethason-21-hemisuccinat 12 Hình 1.14: Sơ đồ tổng hợp dexamethason-21-hemiglutarat 13 Hình 1.15: Sơ đồ tổng hợp curcumin monosuccinat curcumin disuccinat .14 Hình 1.16: Sơ đồ tổng hợp acid curcumin di-glutaric 15 Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp diester di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin 19 Hình 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp A-1 .24 Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng tổng hợp A-2 .25 Hình 3.3: Các vết SKLM phản ứng tổng hợp A-2 25 Hình 3.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp A-3 .29 Hình 3.5: Các vết SKLM phản ứng tổng hợp A-3 29 Hình 3.6: Cơ chế phản ứng tổng hợp A-1 .42 Hình 3.7: Các sản phẩm phụ phản ứng tạo A-1 43 Hình 3.8: Phản ứng kiềm hóa loại tạp curcumin A-1a .44 Hình 3.9: Cơ chế phản ứng acyl hóa tạo A-2 44 Hình 3.10: Các tạp phản ứng tạo A-2 .45 Hình 3.11: Cơ chế phản ứng acyl hóa tạo A-3 46 Hình 3.12: Các tạp phản ứng tạo A-3 .47 ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin hợp chất phenolic chiết xuất từ củ nghệ thể hoạt tính sinh học bao gồm: chống oxy hóa, chống viêm đặc tính hóa trị liệu tiềm curcumin nghiên cứu rộng rãi sử dụng curcumin lâu dài chứng minh an toàn [36], [18] Curcumin ức chế tăng sinh tế bào gây apoptosis giúp ức chế phát triển dòng tế bào khối u [33] Tuy nhiên, phát triển curcumin tác nhân trị liệu bị cản trở khả hòa tan nước thấp, hấp thu kém, chuyển hóa loại bỏ nhanh chóng, tất dẫn đến sinh khả dụng đường uống Do đó, cấu trúc curcumin sửa đổi theo phương pháp hóa học sử dụng khắc phục rào cản độ hòa tan nước kém, khơng ổn định hóa học, hấp thu kém, chuyển hóa nhanh chóng, tác dụng chỗ kéo dài thời gian tác dụng [27] Năm 2010, Changtam tổng hợp dẫn chất di-O-(2-hydroxylethyl)curcumin thể khả chống ký sinh trùng tốt số loài thuộc chi Trypanosoma Leishmaina [7] Năm 2016, tác giả Hoàng Thị Thùy Dung tổng hợp dẫn chất thử tác dụng kháng tế bào ung thư gan HepG2, kết thu tốt curcumin [1] Năm 2011, Wisut Wichitnithad tổng hợp curcumin diethyl disuccinat thể khả ổn định hệ đệm phosphat hoạt động chống ung thư tế bào ung thư biểu mô đại trực tràng [40] giúp tăng cường hoạt động kháng tế bào ung thư gan HepG2 so với curcumin [26] Năm 2018, Chawanphat Muangnoi cộng tiến hành nghiên cứu tổng hợp thử tác dụng sinh học acid curcumin di-glutaric giúp cải thiện độ tan tăng khả chống nhiễm trùng chuột [27] Từ định hướng trên, tiến hành tổng hợp dẫn chất dạng ester glutarat ester succinat curcumin (di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin) với hi vọng cải thiện độ tan, khả hấp thu, từ cải thiện hoạt tính sinh học curcumin Chúng thực đề tài “Tổng hợp thử tác dụng sinh học số dẫn chất kết hợp curcumin với diacid” với hai mục tiêu: Phụ lục 15.2: Phổ dãn 13C-NMR A-3 Phụ lục 15.3: Phổ dãn 13C-NMR A-3 Phụ lục 16: Hoạt tính chống oxy hóa Phụ lục 16: Hoạt tính chống oxy hóa Phụ lục 16: Hoạt tính chống oxy hóa Phụ lục 17: Hoạt tính ức chế NO Phụ lục 17: Hoạt tính ức chế NO Phụ lục 17: Hoạt tính ức chế NO Phụ lục 17: Hoạt tính ức chế NO Phụ lục 18: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Phụ lục 18: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Phụ lục 18: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Phụ lục 18: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Phụ lục 18: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư ... tài ? ?Tổng hợp thử tác dụng sinh học số dẫn chất kết hợp curcumin với diacid? ?? với hai mục tiêu: 1 Tổng hợp hai dẫn chất ester glutarat ester succinat di-O-(2- hydroxyethyl) -curcumin (A-2; A-3) Thử. .. ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM NGỌC VĂN MÃ SINH VIÊN: 1501548 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT KẾT HỢP CURCUMIN VỚI DIACID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ... 24 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 24 3.1.1 Tổng hợp (A-1) 24 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2,2’- (curcumin- di-O-yl) diethyl diglutarat (A-2) 25 3.1.3 Tổng hợp dẫn chất 2,2’- (curcumin- di-O-yl)