Bài viết nhiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá, khảo sát môi trường cải tiến Zarrouk NPK (ZN) và Zarrouk rỉ mật (ZR) từ môi trường Zarrouk lên sinh trưởng và phát triển của tảo Athrospira platensis.
TẠP KHOA JOURNAL OF SCIENCE AND TECHNOLOGY TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀCHÍ CƠNG NGHỆHỌC VÀ CƠNG NGHỆ Tập 19, Số (2020): 69-75 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG HUNG VUONG UNIVERSITY Tập 19, Số (2020): 69-75 Vol 19, No (2020): 69-75 Email: tapchikhoahoc@hvu.edu.vn Website: www.hvu.edu.vn NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẢO XOẮN (Athrospira platensis) QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Trần Anh Tuấn1*, Nguyễn Xn Việt2, Phan Thị Yến2, Hồng Thị Phương Thúy2 Phịng Khoa học Công nghệ, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ Ngày nhận bài: 16/4/2020; Ngày chỉnh sửa: 10/6/2020; Ngày duyệt đăng: 12/6/2020 Tóm tắt N ghiên cứu thực nhằm đánh giá, khảo sát môi trường cải tiến Zarrouk NPK (ZN) Zarrouk rỉ mật (ZR) từ môi trường Zarrouk lên sinh trưởng phát triển tảo Athrospira platensis Kết thu được: Trong nuôi cấy môi trường Zarrouk thời điểm sinh khối cực đại thời gian 14 ngày, giá trị OD 2,68; pH 8,25; Nuôi cấy môi trường ZN thời điểm sinh khối cực đại thời gian 14 ngày, giá trị OD 2,65; pH 8,3; Nuôi cấy môi trường ZR thời điểm sinh khối cực đại thời gian 14 ngày, giá trị OD 2,62; pH 8,5 Như vậy, mơi trường ZN ZR có giá trị OD tương đồng mơi trường Zarrouk chi phí rẻ hơn, có tiềm lớn ứng dụng làm mơi trường ni cấy thay Zarrouk quy mơ thí điểm Từ khóa: Athrospira platensis, Zarrouk, NPK, rỉ mật, OD, pH Đặt vấn đề Athrospira platensis loài tảo lam giàu dinh dưỡng với hàm lượng protein chiếm tới 56-77% khối lượng khơ, giàu vitamin, chất khống, axít amin axít béo thiết yếu Bên cạnh đó, khả thích ứng tốt với yếu tố mơi trường, điều kiện kỹ thuật nuôi đơn giản lợi ni sinh khối lồi tảo Do đó, tảo A platensis nghiên cứu, sản xuất ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống; làm thực phẩm chức năng, nguồn dinh dưỡng bổ sung thiết yếu, thuốc chữa bệnh (ung thư, HIV/AIDS, viêm gan, tiểu đường, ), mỹ phẩm (chăm sóc da tóc), thức ăn chăn ni xử lý nước thải Ngồi ra, tảo A platensis *Email: trananhtuan091294@gmail.com cịn tách chiết thành chế phẩm giàu dinh dưỡng giàu sắc tố có tác dụng tăng khả đề kháng, tăng miễn dịch, tăng hàm lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng máu, nâng cao thể trạng bệnh nhân, hạn chế phát triển ung thư Môi trường Zarrouk nuôi tảo phát triển tốt Tuy nhiên, dạng môi trường dinh dưỡng phức tạp tốn chi phí cao Với sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao tảo A platensis tiềm lớn lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, y học, nên năm gần đây, cơng trình nghiên cứu nước thiên nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nuôi tảo A platensis dựa môi trường Zarrouk, nghiên cứu 69 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ nhằm mục đích giảm bớt hàm lượng dinh dưỡng môi trường thay thành phần khác vào để giảm giá thành sản xuất Theo nghiên cứu Lê Quỳnh Hoa (2013) tiến hành khảo sát việc thay hàm lượng NaHCO3 NaCl môi trường nuôi tảo A platensis để giảm hàm lượng muối dinh dưỡng NaHCO3, kết cho thấy giảm NaHCO3 đến mức định, thay hồn tồn kết ni tảo khơng đạt suất, nghiên cứu thêm số hàm lượng khác nằm khoảng thích hợp để chọn giá trị tốt Một nghiên cứu khác Thạch Thị Mộng Hằng (2015) “Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng số yếu tố mơi trường thích hợp ni tảo A platensis” Đề tài sử dụng 50% mơi trường Zarrouk có bổ sung thêm muối iot Kết cho thấy mật độ tảo đạt cao so với nghiệm thức đối chứng mơi trường Zarrouk chuẩn Từ cho thấy tảo xoắn sống phát triển tốt mơi trường có hàm lượng dinh dưỡng thấp có bổ sung khống chất thay điều kiện nhân tạo Như vậy, đánh giá mơi trường dinh dưỡng có bổ sung khống chất hữu ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển tảo xoắn Các nghiên cứu có ý nghĩa lớn, giúp hạ giá thành sản phẩm trình nuôi cấy tảo A platensis Nghiên cứu hướng tới cải tiến môi trường nuôi cấy tảo xoắn A platensis quy mơ phịng thí nghiệm, nhằm xác định mơi trường dinh dưỡng rẻ tiền phù hợp với việc nuôi cấy loài tảo xoắn Phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Giống tảo A platensis có nguồn gốc Trung tâm Nghiên cứu chuyển giao công 70 Trần Anh Tuấn ctv nghệ sinh học Minh Thiên - Đại Phúc, TP Bắc Ninh, tỉnh Bắc Ninh Môi trường Zarrouk (hãng sản xuất hóa chất, nước), NPK (hãng sản xuất hóa chất, nước), rỉ mật (hãng sản xuất hóa chất, nước) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Bổ sung mô tả cách thức tạo mơi trường ZN, ZR, cách bố trí thí nghiệm cơng thức thí nghiệm, điều kiện ni cấy chung (thể tích bình ni cấy, ánh sáng, nhiệt độ ) 2.2.1 Quan sát hình dạng giống tảo Athrospira platensis hoạt hóa Các mẫu tảo sau thời gian hoạt hóa đem quan sát hình thái KHV quang học hiệu Model Olympus CX23LEDRFS1 vật kính 4X, 10X, 40X vật kính 100X Sau chụp ảnh lại mơ tả đặc điểm hình thái 2.2.2 Khảo sát, cải tiến môi trường nuôi cấy cho khả nhân sinh khối tảo Athrospira platensis Thí nghiệm đơn yếu tố bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên gồm ba nghiệm thức, nghiệm thức tiến hành ni bình tam giác 1000 ml, tiến hành lặp lại lần Tiến hành cấy tảo giống A platensis vào bình tam giác đạt mật độ ban đầu 104tb/ml Khảo sát ảnh hưởng môi trường Zarrouk, môi trường cải tiến ZN, môi trường cải tiến ZR lên tăng sinh khối tảo A platensis Sục khí liên tục q trình nuôi, chế độ chiếu sáng 30003500 lux (Ánh sáng tự nhiên cửa sổ phịng thí nghiệm), nhiệt độ 30-38oC, chiếu 12/24h Môi trường nuôi cấy hấp khử trùng autoclave 121oC 15 phút Tiếp giống tảo A platensis 30% vào 700 ml môi trường nuôi cấy bình tam giác 1000 ml điều kiện mơi trường có chứa thành phần theo Bảng Bảng Tập 19, Số (2020): 69-75 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Bảng Khảo sát mơi trường nuôi cấy tảo xoắn A platensis STT 10 11 12 Thành phần K2HPO4 NaCl MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O FeSO4.7H2O NaNO3 K2SO4 EDTA NaHCO3 NPK-10:26:26 Rỉ mật Vi lượng A5 Môi trường Zarrouk Khối lượng (g/l) 0,5 1,00 0,20 0,04 0,01 2,50 1,00 0,08 16,8 1ml Môi trường cải tiến ZN Khối lượng (g/l) 0,5 1,00 0,20 0,04 0,01 1,5 0,5 10 0,76 1ml Môi trường cải tiến ZR Khối lượng (g/l) 0,5 1,00 0,20 0,04 0,01 2,5 1,00 4,5 0,4 1ml Bảng Thành phần vi lượng A5 STT Thành phần H3BO3 MnSO4.7H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O Các tiêu theo dõi: Theo dõi yếu tố mơi trường q trình nghiên cứu: Nhiệt độ, pH, hình thái, sinh khối tảo ngày, ngày đo OD lần theo dõi 16 ngày ni cấy, sau so sánh khối lượng tảo mơi trường thí nghiệm Phương pháp xác định mật độ tảo xác định thông qua mật độ quang (optical density-OD) Tại bước sóng 560 nm chuyển đổi thành mật độ (g/lit) ứng với đường chuẩn tảo giá trị đường chuẩn tảo dựa công thức: Mật độ sinh khối = 0,826 × OD (r2 = 0,9999) Thời gian nuôi cấy: 16 ngày 2.3 Xử lý số liệu Các số liệu ghi chép xử lý phần mềm Excel (2010) phương pháp Liều lượng mg/100ml 286 250 22,2 7,9 2,1 thống kê sinh học Nguyễn Văn Thiện (2008) Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Kết hoạt hóa giống tảo A platensis bảo quản Glycerol điều kiện lạnh sâu phịng thí nghiệm Giống hoạt hóa ống nghiệm lắc máy lắc khô hiệu Biosan Biovortex V1 chế độ 35oC, 150 vòng/phút khoảng thời gian khác 24 48 Kết thu dung dịch tảo có màu xanh (Hình 1) Mẫu hoạt hóa lắc 48h thu có màu xanh đậm 71 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Trần Anh Tuấn ctv 3.2 Quan sát hình dạng, kích thước giống tảo A platensis kính hiển vi quang học Mẫu tảo sau thời gian hoạt hóa đem quan sát hình thái KHV quang học vật kính 4X, 10 X, 40X vật kính 100 X Khi quan sát mẫu kính hiển vi quang học vật kính 10X 40X thấy cụm tế bào màu xanh có di chuyển, dạng hình trịn Bên cạnh cịn có nhiều tế bào hình que ngắn chuyển động nhanh Hình Mẫu tảo A platensis hoạt hóa 24 48 a c A platensis có dạng sợi đơn, trơi nổi, màu xanh lam khơng có vỏ bao, eo thắt vách tế bào khơng rõ ràng Có nhiều vịng xoắn nhau, vịng xoắn hẹp phía cuối sợi Tế bào dài khoảng 1,5-3µm, rộng 4-5,5µm với nhiều khơng bào chứa khơng khí Mỗi sợi có khoảng 40-45 tế bào b d Hình Hình thái tảo Athrospira platensis KHV a Vật kính 4X b Vật kính 10X c Vật kính 40X d Vật kính 100X 72 Tập 19, Số (2020): 69-75 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 3.3 Khảo sát, cải tiến mơi trường ni cấy cho khả nhân sinh khối tảo Athrospira platensis Khảo sát nuôi cấy tảo môi trường Zarrouk thời gian nuôi cấy 16 ngày với pH ban đầu Kết thu thể bảng Khảo sát môi trường Zarrouk từ ngày đến ngày 12, giá trị OD tăng dần (0-2,0) giá trị pH không thay đổi nhiều (88,23) Tuy nhiên, đến ngày thứ 14 giá trị OD 2,68, giá trị pH 8,25 đạt cực đại đồng nghĩa lượng sinh khối tảo thu lớn Điều cho thấy giá trị pH 8,25 thời gian 14 ngày sinh khối tảo A platensis đạt cực đại Kết nghiên cứu phù hợp với kết Zarrouk, C [1] khoảng pH mà tảo xoắn phát triển mơi trường Zarrouk Ngồi ra, theo nghiên cứu Mustafa cộng năm 2016, giá trị pH thu tiệm cận với giá trị pH ghi nhận để tảo xoắn có giá trị clorophil cao nhất, giá trị cho thấy khả quang hợp đạt cực đại tảo xoắn mức pH Tại thời điểm 16 ngày, pH môi trường nuôi cấy 8,25 mật độ OD (2,66) thu giai đoạn giảm dần Bảng Kết tiêu theo dõi pH OD môi trường nuôi cấy tảo A platensis Môi trường (Zarouk) Môi trường cải tiến (Zarouk + NPK) Môi trường cải tiến (Zarouk + rỉ mật) OD pH OD pH OD 8,00 ± 0,12 0,12 ± 0,004 8,00 ± 0,12 0,12 ± 0,012 8,00 ± 0,05 0,12 ± 0,001 8,07 ± 0,08 0,40 ± 0,002 8,09 ± 0,06 0,40 ± 0,013 8,19 ± 0,03 0,42 ± 0,003 8,12 ± 0,10 0,60 ± 0,004 8,16 ± 0,05 0,60 ± 0,016 8,26 ± 0,06 0,62 ± 0,016 8,15 ± 0,05 0,80 ± 0,012 8,21± 0,03 0,80 ± 0,014 8,31 ± 0,05 0,85 ± 0,023 Thời gian (giờ) pH 8,17 ± 0,04 1,20 ± 0,015 8,24± 0,02 1,20 ± 0,023 8,39 ± 0,08 1,12 ± 0,013 10 8,19 ± 0,06 1,62 ± 0,013 8,26 ± 0,01 1,60 ± 0,021 8,46 ± 0,06 1,71 ± 0,016 12 8,23 ± 0,03 2,02 ± 0,024 8,29 ± 0,05 2,00 ± 0,016 8,49 ± 0,06 2,23 ± 0,014 14 8,25 ± 0,08 2,68 ± 0,063 8,3 ± 0,08 2,65 ± 0,056 8,5 ± 0,04 2,62 ± 0,019 16 8,25 ± 0,07 2,66 ± 0,029 8,3 ± 0,07 2,63 ± 0,082 8,5 ± 0,07 2,61 ± 0,016 So sánh kết nuôi cấy môi trường cải tiến 1-ZN, giai đoạn từ đến ngày đầu giá trị OD tăng không mạnh (0,12-1,2), giá trị pH dao động (8-8,24) thời gian để tảo xoắn thích nghi với mơi trường ni cấy ZN, sau phát triển mạnh tuân theo định luật đường cong sinh trưởng Giai đoạn ngày thứ đến 12 giá trị pH đo dược dao động (8,24-8,29), giá trị OD từ 1,2-2,0 điều cho thấy sinh trưởng tảo giai đoạn logarit Tại ngày thứ 14, mật độ OD đo cao 2,65, xấp xỉ với mật độ OD cao thời điểm 14 ngày với đối chứng môi trường Zarrouk Khảo nghiệm môi trường có sử dụng nguồn NPK dựa giá trị OD có hiệu tương đồng với mơi trường Zarrouk cải tiến bổ sung thêm NPK Raoof năm 2006, Madkour năm 2012 Angelina năm 2019 [2-4] Điều khẳng định quan trọng nguyên tố N việc phát 73 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ triển tảo xoắn điều kiện phịng thí nghiệm Ngồi ra, xét giá trị kinh tế, lựa chọn mơi trường ZN có khả tối ưu giảm thành phần chất đắt tiền NaHCO3, giá thành giảm 1,52 lần Dựa theo Laven Sorgeloth FAO [5], việc sử dụng NPK có ảnh hưởng đến phát triển loài tảo giai đoạn ni dưỡng Sử dụng hàm lượng NPK thích hợp gia tăng khả phát triển tảo số môi trường định Nghiên cứu Kumari năm 2014 cho thấy việc sử dụng nồng độ NPK thích hợp giúp cho khả trao đổi CO2 pha giảm oxy hóa, tăng tích lũy protein, lipid diệp lục sinh khối tảo A platensis Việc kết hợp sử dụng phân bón phức hợp NPK có ưu điểm (1) giảm lượng độc tính ammoniac chất có mơi trường (2) tính kinh tế so với chất khác có mơi trường ni cấy Ngồi ra, nhiều nghiên cứu sử dụng nhiều nguồn N khác sử dụng thay cho NaNO3 môi trường Zarrouk bản, sử dụng NPK nguồn chất tiềm khả quan Khảo sát việc sử dụng môi trường cải tiến 2-ZR cho thấy thời điểm 14 ngày, nuôi cấy môi trường ZR đạt giá trị OD pH lớn 2,62 8,5 pH môi trường nuôi cấy ZR cao Zarrouk nguồn carbon bổ sung nhiều hơn, dẫn đến q trình chuyển hóa CO2 pha sinh trưởng tiến hành cao Tại giai đoạn từ 4-6 ngày đầu tiên, giá trị OD tăng lên khơng đáng kể (từ 0,4-0,6) q trình tảo xoắn thích nghi với mơi trường nuôi cấy Do thành phần carbon giảm nhiều so với môi trường Zarrouk 74 Trần Anh Tuấn ctv (thành phần NaHCO3 giảm từ 16,8g xuống 4,5g) cho thấy rỉ mật trở thành chất phát triển tảo A platensis Giá trị OD 2,62 ngày thứ 14 nuôi cấy môi trường ZR so với 2,68 nuôi cấy môi trường Zazouk thấp không đáng kể Rỉ mật sản xuất đường cơng nghiệp, có hàm lượng cao 50% so với đường thông thường, coi nguồn carbon tiềm để sử dụng bổ sung để nuôi cấy cho nhiều loại tảo Các kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu sử dụng rỉ mật để môi trường Zarrouk theo Andrade Costa (2007), Borasi (2007) Dineshkumar (2015) Trong đó, rỉ mật nguồn nguyên liệu dễ tìm rẻ so với NHCO3 Do đó, nghiên cứu đề xuất sử dụng môi trường ZR cho nghiên cứu [6-8] Tóm lại: Khi ni tảo A platensis loại môi trường cải tiến ZN ZR đối chứng với môi trường Zarrouk cho thấy hàm lượng sinh khối tương đương nhau, giá trị OD 2,68; 2,65; 2,62 Tuy nhiên, với hàm lượng NaHCO3 giảm đến 4,5 gram/lit so với 16,8 gram/lit so với môi trường cho thấy khả giảm chi phí việc sử dụng nguồn vật liệu thay dễ kiếm rỉ mật khả quan Nghiên cứu đề xuất việc sử dụng nuôi trường cải tiến ZR cho nghiên cứu Kết luận A platensis có dạng sợi xoắn, màu xanh lam Sau 24h ni cấy, tế bào có kích thước dài khoảng 1,5-3 µm, rộng 4-5,5 µm, nhiều khơng bào chứa khơng khí Mỗi sợi có khoảng 40-45 tế bào Tập 19, Số (2020): 69-75 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Sử dụng mơi trường ZN ZR điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm cho hiệu tương đồng với môi trường Zarrouk bản, nguyên liệu dễ kiếm giá thành giảm từ 1,5-2 lần giảm hàm lượng NaHCO3 NaNO3 Do đó, việc sử dụng hai mơi trường ZN ZR đề xuất cho nghiên cứu Tài liệu tham khảo [1] Zarrouk C (1966) Contribution a l’etude d’une cyanobacterie: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthese de Spirulina maxima (Setchell et Gardner) Geitler Ph.D Thesis, University of Paris, France [2] Raoof B (2006) Formulation of a lowcost medium for mass production of Spirulina Biomass and Bioenergy, 30, 537-542 [3] Kumari A (2014) Cultivation of Spirulina platensis using NPK-10:26:26 complex fertilizer and simulated flue gas in sintered disk chromatographic glass bubble column Journal of Environmental Chemical Engineering, 2(3), 1859-1869 [4] Angelina M (2019) Biomass and nutritive value of Spirulina (Arthrospira fusiformis) cultivated in a cost-effective medium Annals of Microbiology, 69, 1387-1395 [5] Lavens P & Sorgeloos P (1996) Manual on the production and use of live food for aquaculture FAO Fisheries Technical Paper No 361, Rome [6] Andrade M.R & Costa J.A.V (2007) Mixotophic cultivation of microalga Spirulina plantesis using molasses as organic substrate Aquaculture, 264,130-134 [7] Dineshkumar M (2015) Enhance the growth of Spirulina planetesis using molasses as organic additives World Journal of Pharmaceutical Research, 1(5), 1057-1066 [8] Borsari R R J (2007) Mixotophic growth of Nostoc sp on glucose, sucrose and sugarcane mollases for phycobiliprotein production Acta Scientiarum Biological Sciences, 29(1), 9-13 RESEARCH ON OPTIMIZATION OF Athrospira platensis GROWTH IN PILOT SCALE Tran Anh Tuan1, Nguyen Xuan Viet2, Phan Thi Yen2, Hoang Thi Phuong Thuy2 Department of Science and Technology, Hung Vuong University, Phu Tho Faculty of Agro-forestry and Aquaculture, Hung Vuong University, Phu Tho Abstract T his research was conducted to evaluate and investigate the Zarrouk NPK (ZN) medium and Zarrouk molasse (ZR) medium that changed from Zarrouk media and the growth of Athrospira platensis The results show that in Zarrouk media, the maximum biomas was recorded at 14th day with OD = 2,65 and pH=8,3; In ZR media, the maximum biomas was recorded at 14th day with OD = 2,62 and pH=8,5 Thus, the growths in ZN media and ZR media had the same OD result with the growth in Zarrouk with cheaper price, so that using ZN and ZR media is potential to culture Athrospira platensis in pilot scale Keywords: Athrospira platensis, Zarrouk, NPK, molasse, OD, pH 75 ... pH môi trường nuôi cấy 8,25 mật độ OD (2,66) thu giai đoạn giảm dần Bảng Kết tiêu theo dõi pH OD môi trường nuôi cấy tảo A platensis Môi trường (Zarouk) Môi trường cải tiến (Zarouk + NPK) Môi trường. .. triển tảo xoắn Các nghiên cứu có ý nghĩa lớn, giúp hạ giá thành sản phẩm q trình ni cấy tảo A platensis Nghiên cứu hướng tới cải tiến môi trường nuôi cấy tảo xoắn A platensis quy mơ phịng thí nghiệm, ... ml, tiến hành lặp lại lần Tiến hành cấy tảo giống A platensis vào bình tam giác đạt mật độ ban đầu 104tb/ml Khảo sát ảnh hưởng môi trường Zarrouk, môi trường cải tiến ZN, môi trường cải tiến