Nghiên cứu ứng dụng môi trường nuôi thành thục trứng lợn in vitro phù hợp với điều kiện Việt Nam

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá tỷ lệ thành thục của trứng lợn nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau để lựa chọn môi trường nuôi trứng hiệu quả, tiết kiệm, phù hợp điều kiện Việt Nam.

Vietnam J Agri Sci 2020, Vol 18, No 7: 504-509 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(7): 504-509 www.vnua.edu.vn NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MÔI TRƯỜNG NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG LỢN IN VITRO PHÙ HỢP VỚI ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Đỗ Thị Kim Lành1*, Hoàng Thị Kim Chi1, Nguyễn Thị Ngọc Anh1, Nguyễn Thị Hồng Nhung1, Kazuhiro Kikuchi2, Takeshige Otoi3, Nguyễn Thị Thu Trang4, Sử Thanh Long1 Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện nghiên cứu NARO, Nhật Bản Đại học Tokushima, Nhật Bản Khoa Thú y, Đại học Lâm nghiệp, Việt Nam * Tác giả liên hệ: dtklanh@vnua.edu.vn Ngày chấp nhận đăng: 21.06.2020 Ngày nhận bài: 22.05.2020 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm đánh giá tỷ lệ thành thục trứng lợn nuôi điều kiện môi trường khác để lựa chọn môi trường nuôi trứng hiệu quả, tiết kiệm, phù hợp điều kiện Việt Nam Tế bào trứng lợn nuôi môi trường porcine oocyte maturation (POM) môi trường tissue culture media 199 (TCM199), so sánh nguồn nước pha môi trường từ nước tinh khiết (Sigma) nước khử ion sản xuất phịng thí nghiệm (MQW), so sánh hiệu bổ sung hormone q trình ni trứng Kết cho thấytỷ lệ thành thục trứng lợn nuôi trưởng thành môi trường POM (73,45 ± 2,61%) cao đáng kể so với tỷ lệ thành thục trứng lợn ni mơi trường TCM199 (58,84 ± 2,49) Khơng có khác biệt đáng kể tỷ lệ thành thục trứng lợn nuôi môi trường POM pha từ nước Sigma (87,16 ± 4,74%) hay nước khử ion (83,20 ± 6,93%) Bổ sung hormone 22 đầu trình IVM cho tỷ lệ thành thục cao đáng kể so với bổ sung hormone suốt trình ni trứng (90,88 ± 2,33% 84,93 ± 2,78%) Như vậy, sử dụng nước khử ion để pha môi trường POM nuôi trứng lợn in vitro bổ sung hormone 22 đầu ni cấy có hiệu cao nâng cao tỷ lệ thành thục nhân tiết kiệm chi phí nghiên cứu Từ khóa: Trứng lợn, thành thục, hormone Optimization of Porcine Oocyte in Vitro Maturation Medium for Application in Vietnam ABSTRACT The present study was conducted to evaluate the maturation rate of porcine oocytes matured in POM or TCM199 medium; in maturation, medium made from Sigma pure water or MQW and effects of hormone supplementation in the first 22 hours or during IVM Maturation rate of porcine oocyte matured in POM (73.45 ± 2.61%) medium was significantly higher than that of TCM199 medium (58.84 ± 2.49) There was no significant difference in the maturation rate of porcin oocyte matured in POM medium made from Sigma pure water (87.16 ± 4.74%) or MQW (83.20 ± 6.93%) The supplementation of hormone in 22 hours could help to improve the maturation rate (90.88 ± 2.33%) compared to that of 46 hours (84.93 ± 2.78%) MQW can be used to prepared porcine oocyte matured medium Supplementation of hormones during IVM1 has potential to improve the maturation rate of porcine oocytes Keywords: Porcine oocytes, maturation, hormones ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nëm gæn đåy, việc sử dụng động vêt làm mơ hình nghiên cứu y sinh bệnh người thu hút quan tâm nhiều nhà nghiên cứu giới Trong đò, nghiên cứu sử dụng lợn làm mơ hình thử nghiệm 504 ngày tëng nhờ có tương đồng lớn với người giâi phéu sinh lý học (Critser & cs., 2009) Đåy thuên lợi để nghiên cứu cơng nghệ tế bào gc, k thuờt cỗy ghộp mụ hay cụng ngh protein tái tổ hợp lợn Hơn nữa, ứng dụng kỹ thuêt sinh học phân tử, công nghệ gen cơng nghệ phơi để täo Đỗ Thị Kim Lành, Hồng Thị Kim Chi, Nguyễn Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Kazuhiro Kikuchi, Takeshige Otoi, Nguyễn Thị Thu Trang, Sử Thanh Long lợn biến đổi gen có giá trð lớn nghiên cứu bệnh người (Luo & cs., 2012; Prather & cs., 2013) Do đò, lợn coi mơ hình động vêt có giá trð cung cỗp ngun t bo v c quan thớch hp cho cỗy ghộp mụ (Ramsoondar & cs., 2009), cng động vêt chuyển gen để täo protein đặc biệt liên quan đến y sinh học người (Takahagi & cs., 2005; Pan & cs., 2010; Tanihara & cs., 2016) Mặt khác, lợn nguồn thực phèm cung cỗp protein cng nh chỗt bộo nờn ngnh chởn nuụi ln ang rỗt phỏt trin trờn nhiu quc gia giới Việt Nam Buồng trứng lợn thu täi sở giết mổ gia súc, gia cỉm Cơng ty cổ phỉn Thðnh An täi xã Vän Phúc, Huyện Thanh Trì, Hà Nội rửa säch bâo quân dung dðch nước muối sinh lý 0,9%; giữ nhiệt độ 33-35C vên chuyển phịng thí nghiệm trước sau giết mổ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi trưởng thành POM TCM199 đến khả thành thục trứng lợn nuôi cấy in vitro PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tế bào trứng thu nuôi trưởng thành môi trường POM (Yoshioka & cs., 2008) chứa 10 ng/ml epidermal growth factor EGF (Sigma), 0,6mM cysteine, 1mM dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma), 10 IU/ml eCG (PMS 1000 Tani NZ; Nihon Zenyaku Kogyo, Koriyama, Japan), 10 IU/ml hCG (Puberogen, 500U; Sankyo, Tokyo, Japan) ùa cỗy bn ging (Nunclon Multidishes; Nalge Nunc International, Denmark) môi trường TCM199 (25mM HEPES tissue culture medium 199 with Earle's salts (TCM 199; Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) bổ sung 10% (v/v) dðch nang trứng, 0,6mM cysteine (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 50mM sodium pyruvate (Sigma-Aldrich), mg/mL Dsorbitol (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan), mg/mL 17b-estradiol (SigmaAldrich), 10 IU/mL equine chorionic gonadotropin (Kyoritu Seiyaku, Tokyo, Japan), 10 IU/mL human chorionic gonadotropin (Kyoritu Seiyaku), 50 mg/mL gentamicin (Sigma–Aldrich), thời gian từ 20-22 Sau ũ, trng c cỗy chuyn sang mụi trng nuụi cỗy tng ng khụng cha dbcAMP v hormone 24 Q trình ni trưởng thành trứng tiến hành tủ nuôi 5% CO2 38,5C, độ èm khơng khí bão hịa 2.1 Vật liệu 2.2.2 Ảnh hưởng nguồn nước sử dụng Đối tượng nghiên cứu l trng ln nuụi cỗy ng nghim nhỡm ỏnh giỏ hiu quõ ca tng loọi mụi trng nuụi cỗy Qua đị, lựa chọn mơi trường ni trứng phù hợp, cú hiu quõ cao v giõm chi phớ sõn xuỗt in vitro Täo phôi ống nghiệm (IVP) động vêt cò vú lợn bao gồm ba kỹ thuêt chính: (i) Sự trưởng thành ống nghiệm (IVM) noãn bào phục hồi trực tiếp từ nang trứng, (ii) Thụ tinh ống nghiệm (IVF) (iii) Nuụi cỗy in vitro (IVC) ca hp t giai độn phơi nang Trong đị, IVM bước đỉu tiên có vai trị đðnh đến kết q täo phơi lợn ống nghiệm Ở giai độn này, tên dụng tế bào trứng lợn chưa thành thục thu từ nang trứng buồng trứng sau đò ni tế bào trứng đến giai độn trưởng thành đưa vào thụ tinh ống nghiệm sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu chuyên såu khác nhån bân vơ tính hay vi tiêm tinh Vì vêy, q trình ni thành thục tế bào trứng khơng cỉn thiết cho thành cơng q trình thụ tinh phát triển phơi mà cịn l ngun cung cỗp nguyờn liu nghiờn cu quan trng Việc lựa chọn môi trường nuôi thành thục tối ưu điều kiện tiên dén đến thành công thụ tinh ống nghiệm lợn công nghệ hỗ trợ sinh sân khác nhån bân vơ tính, vi tiêm tinh (ICSI) hay chỵnh sửa gen, từ đò phục vụ cho nghiên cứu y sinh người pha môi trường nuôi trưởng thành đến khả thành thục trứng lợn ni cấy Từ thí nghiệm 1, lựa chọn môi trường POM TCM199 môi trường nuôi thành thục tế 505 Nghiên cứu ứng dụng môi trường nuôi thành thục trứng lợn in vitro phù hợp với điều kiện Việt Nam bào trứng lợn Môi trường nuôi trứng chuèn bð tương tự thí nghiệm 1, sử dụng hai nguồn nước khác nước tinh khiết mua sẵn (Sigma) nước khử ion sõn xuỗt tọi phũng thớ nghim (MQW) Quỏ trỡnh nuôi trưởng thành trứng tiến hành tủ ni 5% CO2 38,5C, độ èm khơng khí bão hòa 2.2.3 Ảnh hưởng việc bổ sung hormone môi trường nuôi thành thục trứng đến khả thành thục trứng lợn ni cấy in vitro Từ thí nghiệm 2, lựa chọn nguồn nước pha môi trường nuôi trưởng thành tế bào trứng để thực nghiên cứu thí nghiệm để đánh giá ânh hưởng việc bổ sung hormone (eCG hCG) trình nuôi thành thục trứng đến tỷ lệ thành thục trứng lợn điều kiện in vitro Các tế bào trứng loäi A B chọn lọc ngéu nhiên chia làm hai lô trứng khác Với lơ thí nghiệm có không 50 tế bào trứng ni 500µL mơi trường ni trưởng thành trứng POM có chứa 10 ng/ml epidermal growth factor EGF (Sigma), 0,6mM cysteine, 1mM dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma), 10 IU/ml eCG (PMS 1000 Tani NZ; Nihon Zenyaku Kogyo, Koriyama, Japan) 10 IU/ml hCG (Puberogen, 500U; Sankyo, Tokyo, Japan) ùa cỗy bốn giếng (Nunclon Multidishes; Nalge Nunc International, Denmark) 20-22 gi Sau ũ, c chuyn sang mụi trng nuụi cỗy khụng cha dbcAMP ùa cỗy bn ging 24 gi chuyn sang mụi trng nuụi cỗy khụng cha dbcAMP v hormone ùa cỗy bn ging (Nunclon Multidishes; Nalge Nunc International, Denmark) 24 Q trình ni trưởng thành trứng tiến hành tủ nuôi 5% CO2 38,5C, độ èm khơng khí bão hịa 2.3 Xử lý số liệu Chỵ tiêu đánh giá: tỷ lệ tế bào trứng phát triển đến giai độn đỉu giâm phân II (tỷ lệ thành thục) Số liệu phân tích phương sai (ANOVA), sử dụng mơ hình tuyến tính chung (GLM) SAS dành cho Windows, phiên bân 9.1, (Hoa Kỳ) Khi tương tác đáng kể không quan sát hai tham số, chúng lội trừ khói mơ hình Các khác biệt với giá trð P ≤0,05 xem cò ý nghïa thống kê 506 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi trưởng thành POM TCM199 tới thành thục trứng lợn nuôi in vitro Ni thành thục trứng lợn bước khởi đỉu cho nghiên cứu chuyên sâu thụ tinh ống nghiệm, nhân bân vơ tính, vi tiêm tinh hay täo dịng tế bào mỉm gốc phơi„ chỵ tế bào trứng thành thục có khâ nëng tham gia vào trình tái tổ hợp để hình thành nên hợp tử q trình thụ tinh hay kích hột quỏ trỡnh tỏi cỗu trỳc ca nhõn quỏ trỡnh nhân bân Như vêy, q trình ni trưởng thành trứng ũng vai trũ quan trng, cung cỗp ngun nguyờn liu cho nghiên cứu công nghệ sinh sân nâng cao Tế bào trứng lợn thu từ nang trứng cị kích thước từ 3-6mm bề mặt buồng trứng T bo trng sau thu c phõn loọi chỗt lng, chợ cú t bo trng cú nguyờn sinh chỗt ng u ti mu c bao bc bi ớt nhỗt hai lớp tế bào cumulus nguyên vẹn trở lên đưa vào sử dụng Môi trường nuôi thành thục yếu tố quan trọng ânh hưởng tới khâ nëng thành thục phát triển tế bào trứng lợn sau thụ tinh ống nghiệm (Wang, 1997; Margot & Charles, 2001) Đã cị nhiều lội mơi trường sử dụng thành công nuôi thành thục tế bào trứng lợn (Hatirnaz & cs., 2018; Yuan Y & Krisher R L., 2011) Nhìm lựa chọn mơi trường ni trứng phù hợp, qua đị nång cao hiệu q ni trưởng thành in vitro trứng lợn, tiến hành so sánh hai môi trường nuôi trứng TCM199 môi trường POM Kết quâ thể bâng Tỵ lệ trứng thành thục nuôi môi trường POM 73,45 ± 2,61% (P