Nghiên cứu sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp luận án TS sinh học 62 42 30 15

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Phương Liên NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG LECTIN ĐỂ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ VÀ KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ BỆNH UNG THƯ THƯỜNG GẶP Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Đỗ Ngọc Liên PGS TS Nguyễn Thị Chính HÀ NỘI - 2008 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Trần Thị Phương Liên LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án xin gửi lời cảm ơn tới: - GS.TS Đỗ Ngọc Liên, người thầy tận tâm hướng dẫn tơi suốt q trình làm luận án - PGS.TS Nguyễn Thị Chính, người giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập, làm việc Các Thầy cô cán Bộ mơn Sinh lý Thực vật Hố sinh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giúp đỡ cho tơi hồn thành tốt luận án - Phịng xét nghiệm Hoá sinh bệnh viện Quân đội Trung ương 108, bệnh viện E Trung ương, viện Ung bướu Hà Nội, viện Huyết học Truyền máu Trung ương, bệnh viện Bạch Mai giúp đỡ, tạo điều kiện cho hoàn thành luận án Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt chương trình học Gia đình, người thân bạn bè, đồng nghiệp động viên, chia sẻ, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu MỤC LỤC Trang CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁNG THỂ DỊCH THỂ 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cấu trúc chung kháng thể 1.1.3 Chức sinh học kháng thể 1.1.4 Lớp phân lớp kháng thể 1.1.5 Biểu bất thường kháng thể bệnh lí 1.2 AFP UNG THƯ 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu biến đổi sinh lí AFP huyết .7 1.2.2 Tính khơng đồng chuỗi đường loại AFP 1.2.3 Chức AFP 1.2.4 Hàm lượng AFP huyết bệnh gan mạn tính số bệnh khác 10 1.3 LECTIN 11 1.3.1 Lược sử nghiên cứu lectin 11 1.3.2 Sự phân bố lectin sinh giới 14 1.3.3 Một số tính chất lí hố lectin 15 1.3.4 Một số tính chất sinh học miễn dịch lectin 18 1.3.5 Ứng dụng lectin 20 1.3.6 Vài nét nghiên cứu lectin Việt Nam 24 Chương NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 NGUYÊN LIỆU 26 2.1.1 Hạt mít 26 2.1.2 Hạt đậu 27 2.1.3 Huyết thanh, hồng cầu người 27 2.2 HOÁ CHẤT THIẾT BỊ 28 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Xác định hoạt độ lectin 28 2.3.2 Xác định hàm lượng protein 29 2.3.3 Tinh chế lectin 30 2.3.4 Điều chế cột sắc kí lực 31 2.3.5 Tinh chế kháng thể 32 2.3.6 Kỹ thuật ELISA 33 2.3.7 Kỹ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 36 2.3.8 Kỹ thuật điện di 37 Chương KẾT QUẢ BÀN LUẬN 38 3.1 TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LỒI MÍT (A heterophyllus Lamk; A chempeden Gagn A masticata Gagn.), LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima Aublet) LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 38 3.1.1 Tinh chế lectin jacalin từ ba lồi mít (A heterophyllus Lamk; A chempeden Gagn A masticata Gagn.) 38 3.1.2 Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) .43 3.1.3 Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 50 3.2 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA1 TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI 53 3.2.1 Tinh chế IgA1 cột Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo 54 3.2.2 Thiết kế sinh phẩm định lượng IgA1 kỹ thuật LECTIN-ELISA .59 3.2.3 Định lượng IgA1 HT người kỹ thuật LECTIN-ELISA 68 3.3 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN ConM ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgG TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI 70 3.3.1 Nghiên cứu khả bắt giữ kháng thể IgG từ huyết ConM 70 3.3.2 Tinh chế kháng thể IgG từ huyết người cột ConM-Sepharose-4B tự tạo 72 3.3.3 Thiết kế sinh phẩm định lượng IgG từ huyết kỹ thuật LECTIN- ELISA 77 3.3.4 Sử dụng lectin ConM xác định hàm lượng KT IgG kỹ thuật LECTIN-ELISA 85 3.4 ỨNG DỤNG LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ĐỂ BẮT GIỮ, PHÂN BIỆT CÁC LOẠI KHÁNG NGUYÊN AFP TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI UNG THƯ GAN, VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VÀ THAI PHỤ 3.4.1 Nghiên cứu khả bắt giữ AFP lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 3.4.2 Nghiên cứu khả bắt giữ kháng thể huyết ConG 88 3.4.3 Sử dụng lectin ConG để nhận dạng kháng nguyên AFP bệnh lí 3.5 BÀN LUẬN KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Sự đáp ứng miễn dịch thể người bình thường bệnh nhân nhiễm trùng, đặc biệt bệnh nhân ung thư đa dạng phức tạp Khả đáp ứng miễn dịch thể biểu tăng cường tổng hợp kháng thể xuất số kháng nguyên thị bệnh nhiều nhà khoa học Y học quan tâm nghiên cứu Mục đích nghiên cứu theo hướng xác định biểu bất thường số kháng thể kháng nguyên thị bệnh nhằm chẩn đoán bệnh sớm, theo dõi điều trị giúp cho chữa bệnh kịp thời hiệu Kháng thể bệnh lí xuất đáp ứng miễn dịch thường lớp kháng thể riêng biệt kháng thể bị cải biến sau tổng hợp bệnh lí tăng cường thối hố khả glycosyl hoá (gắn thêm loại bỏ gốc đường), chí có thay đổi thối hố cấu trúc phân tử kháng thể tạo mảnh protein Bence-Johns chuỗi nhẹ bệnh ung thư đa u tuỷ xương dòng tế bào B…Tất thay đổi đáp ứng miễn dịch hoá sinh cần phải xét nghiệm kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu để phát sớm biểu bệnh Lectin, dạng glycoprotein tự nhiên có mặt phổ biến nhiều nguồn tài nguyên sinh vật động vật, thực vật vi sinh vật nhà khoa học phát nghiên cứu từ 100 năm (từ năm 1888) Trong nhiều năm nghiên cứu, nhà khoa học chứng minh lectin có nhiều ứng dụng Y dược học Đặc biệt năm cuối thể kỉ XX, người ta sử dụng tương tác đặc hiệu đường tinh vi lectin với kháng thể kháng nguyên (do chất hoá học lectin protein liên kết đặc hiệu với gốc đường nhiều loại kháng thể kháng nguyên có cấu trúc đường riêng biệt) để nghiên cứu biểu kháng thể, kháng nguyên đáp ứng miễn dịch Mục tiêu đề tài Lựa chọn, tinh chế số loại lectin từ thực vật tương tác đặc hiệu với kháng thể, kháng nguyên để xác định biểu kháng thể IgA 1, IgG kháng nguyên AFP từ huyết người bình thường, số bệnh nhân: Ung thư vòm họng, đa u tuỷ xương, ung thư gan viêm gan siêu vi trùng Nội dung đề tài Tinh chế lectin (jacalin) từ lồi mít (Artocarpus heterophyllus Lamk; Artocarpus masticata Gagn Artocarpus champeden Gagn.) Việt Nam sử dụng jacalin để thiết kế sinh phẩm định lượng kháng thể IgA1 từ huyết người Xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ loại đậu (Canavalia maritima Aublet Canavalia gladiata Jacq D.C.) Việt Nam để thiết kế sinh phẩm định lượng kháng thể IgG từ huyết người, phân biệt kháng nguyên AFP (Alpha Feto Protein) từ huyết bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng thai phụ Những đóng góp luận án Lần phát lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) có khả bắt giữ liên kết đặc hiệu với kháng thể IgG từ huyết người Lần phát lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq D.C.) có khả liên kết phân biệt loại kháng nguyên AFP từ huyết bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng thai phụ Bước đầu nghiên cứu tạo hai sinh phẩm để định lượng kháng thể IgA 1, IgG từ huyết người nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh phẩm thời gian tháng cho giá trị sử dụng Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) đặc tính liên kết đặc hiệu lectin ConM với kháng thể IgG từ huyết người Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq D.C.) chứng minh isolectin ConG liên kết, nhận biết riêng biệt dạng kháng nguyên AFP bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng thai phụ Đã bước đầu thiết kế sinh phẩm LECTIN-ELISA (Jacalin-ELISA ConM-ELISA) để định lượng kháng thể IgA1 IgG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁNG THỂ DỊCH THỂ VÀ KHÁNG THỂ BIẾN ĐỔI BỆNH LÍ Trong q trình đáp ứng miễn dịch thể, tế bào bạch cầu lympho B tiếp xúc với kháng nguyên sản xuất kháng thể đặc hiệu hay globulin miễn dịch (Immuno globulin, viết tắt Ig) chống lại kháng nguyên Loại kháng thể thứ đổ vào dịch nội mơi dịch tuần hồn máu hệ bạch huyết, kháng thể dịch thể Loại kháng thể thứ hai nằm màng tế bào sinh nó, biến thành thụ thể tế bào B trưởng thành Phản ứng kháng thể với kháng nguyên có tính đặc hiệu cao Chức sinh học phân tử Ig hệ thống miễn dịch nhận biết "cái lạ" gọi chung kháng nguyên ngoại lai, liên kết đặc hiệu với kháng nguyên lạ, trung hoà loại bỏ chúng khỏi thể Ở số bệnh nhiễm trùng ung thư kháng thể tế bào B tiết bị cải biến cấu trúc gắn thêm loại bỏ số gốc đường cải biến nhận biết đặc hiệu số lectin có nguồn gốc tự nhiên 1.2 AFP VÀ UNG THƯ Năm 1963, Abelev G.I tìm thấy AFP chuột nhắt bị ung thư gan thực nghiệm Một năm sau, Tatarinov Y.S tìm thấy AFP bệnh nhân ung thư gan từ trở AFP trở thành kháng nguyên thị ung thư ứng dụng rộng rãi giúp chẩn đoán ung thư gan viêm gan AFP người glycoprotein có cấu trúc phân tử chuỗi polypeptide khối lượng khoảng 70 kDa chứa 4% carbohydrate thành phần đường bị cải biến bệnh lí nhận biết đặc hiệu lectin 1.3 LECTIN Lectin, dạng glycoprotein tự nhiên có mặt phổ biến nhiều nguồn tài nguyên sinh vật động vật, thực vật vi sinh vật nhà khoa học phát nghiên cứu từ 100 năm (từ năm 1888) Đặc biệt năm cuối thể kỉ XX, người ta sử dụng tương tác đặc hiệu đường tinh vi lectin với kháng thể kháng nguyên để nghiên cứu biểu kháng thể, kháng nguyên Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Hạt mít Các hạt từ mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk), mít chay nhung (mít dại) (Artocarpus masticata Gagn.) mít tố nữ (Artocarpus champeden Gagn.) dùng nguyên liệu để tách lectin 2.1.2 Hạt đậu Hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet), hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) dùng để tách lectin ConM ConG 2.1.3 Huyết thanh, hồng cầu người Huyết người bình thường viện Huyết học Truyền máu Trung ương cung cấp Huyết bệnh nhân đa u tuỷ xương xác định mắc bệnh viện Huyết học Truyền máu Trung Ương cung cấp Huyết bệnh nhân ung thư gan, bệnh nhân viêm gan siêu vi trùng xác định mắc bệnh viện Quân đội Trung ương 108, bệnh viện E Trung ương bệnh viện Ung bướu Hà Nội cung cấp Huyết bệnh nhân ung thư vòm họng xác định mắc bệnh bệnh viện Bạch Mai cung cấp Huyết thai phụ bệnh viện E Trung ương cung cấp 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sử dụng số phương pháp Hoá sinh Miễn dịch như: Định lượng protein theo Lowry, kỹ thuật đo quang phổ, điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE), sắc kí, ELISA thẩm tách miễn dịch (Western blotting) Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LỒI MÍT (A heterophyllus Lamk; A chempeden Gagn A masticata Gagn.), LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima Aublet) LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 3.1.1 Tinh chế lectin jacalin từ ba lồi mít (A heterophyllus Lamk; A chempeden Gagn A masticata Gagn.) * Quy trình tinh chế lectin jacalin hồn thiện sau: Chúng tơi sử dụng quy trình dùng cột sắc kí trao đổi ion CM-cellulose tiến hành thí nghiệm điều kiện lựa chọn pH tối ưu: rửa cột đệm PB pH 5,6 giải hấp phụ đệm PBS pH 8,0 Quy trình tinh chế lectin mít hồn thiện sau: Hạt mít nghiền khơ - Chiết rút đệm PBS 0,02M, pH7,4 - Li tâm 8000 v/p/15 phút, lấy dịch - Tủa (NH4)2SO4 65% bão hoà - Li tâm 8000 v/p/15 phút, thu tủa, đệm PBS pH 7,4 Thẩm tích Nạp cột - Rửa cột đệm PB pH 5,6 - - Giải hấp phụ đệm PBS pH 8,0 - Thu phân đoạn đỉnh Thẩm tích ConM hồn thiện sau: * Đánh giá độ tinh chế phẩm lectin ConM Chú thích: Cột 1: Protein chuẩn Cột 2, 3: Chế phẩm lectin ConM Cột 4: Dịch chiết thô Hình 3.6 Điện di SDS-PAGE chế phẩm lectin ConM từ hạt đậu dao biển Nạp cột Cột Jacalin- Sepharose-4B - Rửa cột đệm PBS pH 7,4 - Giải hấp phụ glycine 0,2M pH 2,6 có trung hồ phân đoạn Tris- HCl pH 8,8 - Thu phân đoạn đỉnh * Xác định hàm lượng IgA1 sau tinh chế phương pháp Lowry (mg/ml) 14.00 12.00 IgA 10.00 8.00 l-ợng 5.84 6.00 Hàm 4.00 2.00 0.00 HTUTVH (n=10) Hàm lượng IgA1 huyết bệnh nhân ung thư vòm họng dao động từ 4,75 đến 7,00 mg/ml; trung bình 5,84  0,59 mg/ml, cao khoảng 1,6 lần so với người bình thường Qua xử lí thống kê chúng tơi thấy mức độ tăng có ý nghĩa (P = 2,08 x 10 -6 nhỏ nhiều so với 0,05) Hàm lượng IgA1 huyết bệnh nhân ung thư gan dao động từ 7,29 đến 13,64 mg/ml; trung bình 11,32  1,44mg/ml, cao khoảng 3,14 lần so với người bình thường Qua xử lí thống kê chúng tơi thấy mức độ tăng có ý nghĩa (P = 1,4 x 10-7 nhỏ nhiều so với 0,05) * Đánh giá độ tinh chế phẩm IgA1 tinh chế cột Jacalin-Sepharose-4B Chú thích: Cột Protein chuẩn Cột IgA1 người bình thường Cột IgA1 bệnh nhân ung thư gan Cột 4, IgA1 bệnh nhân ung thư vịm họng Hình 3.15 Điện di SDS-PAGE đánh giá độ tinh chế phẩm IgA1 Kết điện di SDS-PAGE cho thấy chế phẩm IgA tinh khiết cao, khơng có biểu sai khác khối lượng phân tử chuỗi IgA1 huyết bệnh nhân ung thư gan bệnh nhân ung thư vịm họng so với người bình thường, có băng protein băng có khối lượng phân tử khoảng 56kDa băng khoảng 23kDa, tương ứng với chuỗi nặng chuỗi nhẹ IgA1 3.2.3 Bước đầu thiết kế sinh phẩm định lượng IgA1 kỹ thuật Jacalin-ELISA 0.9 490nm 0.8 0.7 OD 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 định lượng * Thăm dị độ pha lỗng huyết nồng độ jacalin gắn Với loại jacalin nồng độ pha lỗng huyết 100 lần nồng độ jacalin 10 g/ giếng cho kết tốt Ở hai điều kiện kết mật độ quang học đo khả bắt giữ IgA trung bình lectin mít dại 0,453; mít dai 0,451; lectin mít tố nữ 0,456 Như khả bắt giữ IgA loại jacalin tương đương * Quy trình tạo sinh phẩm xác định IgA1 - Bước : Hoạt hoá giếng (Microplate, Nunc Norway) 100 l dung dịch glutaraldehyde 0,25% pha đệm PBS 0,02M pH 7,4; 370C; Rửa lần đệm PBS pH 7,4 Làm khô - Bước Gắn : Thêm vào giếng hoạt hoá 50l jacalin tinh đệm PBS pH 7,4 có nồng độ 10g/giếng, bịt kín giờ, 370C - Bước Phủ bản: Thêm vào giếng gắn 250 l đệm blocking, bịt kín ; 370C Rửa lần đệm PBS pH 7,4 Làm khô - Bước : Tráng giếng dung dịch đệm PBS pH 7,4 có chứa glycerol 15%; 0,02% azit 370C ; Làm khô, bảo quản 40C vòng tháng Khi sử dụng, giếng rửa lại đệm PBS pH 7,4 để loại bỏ hết glycerol, làm khơ Thêm vào 50 l huyết cần phân tích, tiếp tục tiến hành phản ứng ELISA * Xác định độ nhạy mức độ tin cậy kỹ thuật Jacalin-ELISA Độ nhạy kỹ thuật Jacalin - ELISA xuống đến nồng độ