Phân Lập Một Số Dòng Tảo Lục Trên Địa Bàn Thành Phố Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG TẢO LỤC TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGs-Ts NGUYỄN HỮU HIỆP TRẦN ĐỨC TÍN MSSV: 3064486 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 06/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Hữu Hiệp Trần Đức Tín DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình có cơng sinh thành nuôi dạy đến ngày hôm Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc Thầy Nguyễn Hữu Hiệp tận tình giúp đỡ, hướng dẫn truyền đạt kinh nhiệm q báu để tơi hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Xuân Mai - cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học K32 quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập trường thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trường Đại học Cần Thơ năm qua truyền đạt kiến thức quý báu để tơi bước vào đời cách tự tin, để làm việc phấn đấu tốt sau Xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Tâm cán phịng thí nghiệm Viện NC&PT Công nghệ Sinh học giúp đỡ, bảo tơi kinh nghiệm thân, thao tác thí nghiệm q trình làm thí nghiệm Xin cảm ơn tập thể lớp Công nghệ Sinh học K32 tất bạn bè cổ vũ, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối cho gởi lời cảm ơn đến người bạn đặc biệt tôi, người quan tâm, cảm thông chia với tơi lúc khó khăn Một lần nữa, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất người! TP.Cần Thơ, ngày 03 tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực Trần Đức Tín TĨM TẮT Trong năm gần đây, nhà khoa học khám phá giá trị to lớn tảo lĩnh vực sản xuất nhiên liệu sinh học Trong đó, tảo Lục - với hàm lượng lipid cao, tốc độ sinh trưởng nhanh dễ thích nghi với môi trường - hứa hẹn nguồn sản xuất nhiên liệu tương lai Mục tiêu đề tài phân lập dòng vi tảo thuộc ngành tảo Lục (chlorophyta) địa bàn thành phố Cần Thơ Các dòng tảo phân lập kỹ thuật hút tế bào sử dụng Pasteur pipette xử lý vi khuẩn tạp nhiễm hỗn hợp loại kháng sinh: penicillin G, dihydrostreptomycin, neomycin với nồng độ khác Kết nghiên cứu phân lập dòng vi tảo thuộc ngành tảo Lục: Scenedesmus sp., Pediastrum sp., Actinastrum sp., Chlamydomonas sp., Crucigenia sp Ankistrodesmus sp Hỗn hợp chất kháng sinh nồng độ thấp (62,5 µg/mL penicillin G; 31,25 µg/mL dihydrostreptomycin 31,25 µg/mL neomycin) cho kết xử lý tốt mẫu tảo Scenedesmus sp Sau tuần xử lý, mật số vi khuẩn tạp nhiễm mẫu tảo giảm từ 5x104 tế bào/mL xuống 17 tế bào/mL có 4% tế bào bị biến dạng Tuy nhiên, hỗn hợp kháng sinh không phù hợp để xử lý cho dòng tảo Pediastrum sp mức độ biến dạng tế bào nồng độ thí nghiệm 100% i MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG GIỚI THIỆU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu .1 CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đại cương ngành tảo Lục .2 2.1.1 Cấu tạo tế bào 2.1.2 Cấu tạo tản 2.1.3 Sinh sản .3 2.1.4 Sự phân bố 2.1.5 Phân loại 2.1.6 Vai trò tảo Lục .4 2.2 Thu mẫu, phân lập xử lý vi sinh vật tạp nhiễm .5 2.2.1 Thu mẫu .5 2.2.2 Phân lập .5 2.2.3 Xử lý vi sinh vật tạp nhiễm 2.3 Nuôi cấy tảo .9 2.3.1 Môi trường nuôi cấy 2.3.2 Ánh sáng 10 2.3.3 pH 11 2.3.4 Độ mặn 11 2.3.5 Khuấy đảo 11 ii 2.3.6 Nhiệt độ .11 2.4 Nhiên liệu sinh học từ tảo .11 2.4.1 Ưu tảo việc sản xuất lipid .12 2.4.2 Các loài tảo có tiềm sản xuất lipid 13 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Phương tiện nghiên cứu 14 3.1.1 Thời gian địa điểm 14 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị 14 3.1.3 Hóa chất 14 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Thu mẫu kiểm tra mẫu 16 3.2.2 Phân lập tảo .16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Thu mẫu kiểm tra mẫu 21 4.1.1 Kết thu mẫu .21 4.1.2 Kiểm tra mẫu .22 4.2 Phân lập tảo phương pháp hút tế bào 22 4.2.1 Scenedesmus sp 23 4.2.2 Pediastrum sp .24 4.2.3 Actinastrum sp 25 4.2.4 Chlamydomonas sp .25 4.2.5 Crucigenia sp 26 4.2.6 Ankistrodesmus sp 27 4.3 Xử lý vi khuẩn tạp nhiễm chất kháng sinh 27 4.3.1 Kết xử lý kháng sinh mẫu tảo Scenedesmus sp 27 4.3.2 Kết xử lý kháng sinh mẫu tảo Pediastrum sp .33 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 37 iii TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 iv DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: So sánh khả sản xuất dầu đậu nành tảo 12 Bảng 2: Năng suất sinh khối (g/L/ngày), hàm lượng lipid (%) sản lượng lipid thu (mg/L/ngày) dịng tảo sau tuần ni cấy 13 Bảng 3: Môi trường BBM cải tiến 15 Bảng 4: Môi trường LB 16 Bảng 5: Các nghiệm thức xử lý kháng sinh với nồng độ khác 19 Bảng 6: Mức độ sống sót vi khuẩn tạp nhiễm mẫu tảo Scenedesmus sp sau xử lý kháng sinh ngày ngày 14 28 Bảng 7: Ảnh hưởng kháng sinh lên phát triển tảo Scenedesmus sp 31 Bảng 8: Mức độ sống sót vi khuẩn tạp nhiễm mẫu tảo Pediastrum sp sau xử lý kháng sinh ngày ngày 14 33 v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Các loại nhiên liệu sản xuất từ tảo 12 Hình 2: Các bước chuẩn bị Pasteur pipette 17 Hình 3: Thu mẫu khu Hiệu 21 Hình 4: Ao nuôi cá Trại thực nghiệm 21 Hình 5: Hồ nước Trung tâm học liệu 21 Hình 6: Mẫu tảo thu địa điểm 22 Hình 7: Scenedesmus sp 23 Hình 8: Pediastrum sp 24 Hình 9: Actinastrum sp 25 Hình 10: Chlamydomonas sp 26 Hình 11: Crucigenia sp 26 Hình 12: Ankistrodesmus sp 27 Hình 13: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Scenedesmus sp ngày 28 Hình 14: Các dạng khuẩn lạc nghiệm thức đối chứng 29 Hình 15: Các dạng khuẩn lạc nghiệm thức 1, 2, 29 Hình 16: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Scenedesmus sp ngày 14 30 Hình 17: Khuẩn lạc nghiệm thức (mũi tên) nghiệm thức bị nhiễm vi khuẩn với mật số cao 30 Hình 18: Biểu đồ biểu diễn gia tăng mật số tảo Scenedesmus sp ngày 14 sau xử lý kháng sinh 31 Hình 19: Sự biến dạng tảo Scenedesmus sp kháng sinh 32 Hình 20: Biểu đồ so sánh tỉ lệ biến dạng tảo Scenedesmus sp xử lý với nồng độ kháng sinh khác 33 Hình 21: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Pediastrum sp ngày 34 Hình 22: Các dạng khuẩn lạc nghiệm thức đối chứng 34 Hình 23: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Pediastrum sp ngày 14 35 Hình 24: Các dạng khuẩn lạc nghiệm thức đối chứng ngày 14 35 Hình 25: Sự biến dạng tảo Pediastrum sp kháng sinh 36 vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG GIỚI THIỆU - 1.1 Đặt vấn đề Xã hội ngày tiến bộ, nhu cầu người ngày cao với phát triển vũ bão ngành công nghiệp đại dẫn đến việc tiêu thụ lượng ngày tăng nhanh Vì phải đối mặt với thách thức mới, nguy thiếu nguồn nguyên - nhiên liệu, giá thành sản phẩm cao… Theo dự báo nhà khoa học, đến khoảng năm 2050 - 2060, khơng tìm nguồn lượng thay thế, giới lâm vào khủng hoảng lượng nghiêm trọng Bên cạnh đó, việc sử dụng nguồn nhiên liệu hố thạch làm mơi trường tự nhiên ngày xấu Quá trình đốt cháy nhiên liệu tạo lượng lớn khí thải (CO2, NOx, SOx…) gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người mơi trường sinh thái Hiện tượng khí hậu tồn cầu nóng dần lên thách thức lớn toàn nhân loại kỷ Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng nguồn nhiên liệu mới, sạch, tái tạo có khả thay nguồn xăng dầu ngày trở nên cấp thiết Nhiên liệu sinh học nguồn nhiên liệu đáp ứng tất địi hỏi Trong đó, nguồn nhiên liệu từ vi tảo xem nguồn nhiên liệu ưu đầy hứa hẹn cho tương lai Nước ta nước nhiệt đới, lượng ánh sáng mặt trời dồi dào, nhiệt độ cao quanh năm Thêm vào nguồn tài nguyên nước phong phú với hệ thống sơng ngịi, ao hồ chằng chịt, đường bờ biển dài vùng biển rộng bao la Vì thế, Việt Nam có hệ vi tảo đa dạng phong phú Đây điều kiện thuận lợi cho việc khám phá, nghiên cứu nuôi trồng lồi vi tảo có giá trị sản xuất nhiên liệu Tuy nhiên, nghiên cứu vi tảo nước ta cịn hạn chế Do đó, thực đề tài “Phân lập số dòng tảo Lục địa bàn thành phố Cần Thơ” nhằm giải vấn đề 1.2 Mục tiêu Phân lập, mơ tả định danh số dịng tảo Lục Xử lý kháng sinh để thu mẫu tảo thuần, hạn chế vi khuẩn tạp nhiễm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 4.2.3 Actinastrum sp Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Senedesmaceae Mô tả: Tản dạng tộc đoàn gồm tế bào, tế bào có khả sống đơn độc Các tế bào dính đầu đầu tỏa theo nhiều hướng Sự liên kết tế bào lỏng lẽo Tế bào kéo dài nhọn đầu (hình 9) a b Hình 9: Actinastrum sp (a) Mẫu tảo Actinastrum sp nuôi ống nghiệm (bên trái) mẫu nước cất làm đối chứng (bên phải) (b) Actinastrum sp chụp vật kính E40 4.2.4 Chlamydomonas sp Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Monadophycidae Bộ: Volvocales Họ: Chlamydomonadaceae Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 25 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Mơ tả: Tản đơn bào, có hình trịn Tế bào có roi đầu với kích thước nên tảo có khả bơi lội nhanh nước Hạch lạp trịn, nhỏ (hình 10) a b Hình 10: Chlamydomonas sp chụp vật kính E40 (a) E100 (b) 4.2.5 Crucigenia sp Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Scenedesmaceae Mơ tả: Tản dạng tộc đồn với tế bào xếp mặt phẳng Liên kết với vách tế bào có chừa khoảng trống trung tâm Tế bào có hình trịn (Hình 11) a b c Hình 11: Crucigenia sp (a) (b) Crucigenia sp chụp vật kính E40 E100 (c) Mẫu tảo Crucigenia sp nuôi ống nghiệm (bên trái) mẫu nước cất làm đối chứng (bên phải) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 26 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 4.2.6 Ankistrodesmus sp Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Ankistrodesmaceae Mô tả: Tản dạng đơn bào Tế bào kéo dài với đầu nhọn, dạng thẳng Các tế bào khơng có roi nên khơng có khả di động (Hình 12) b a c Hình 12: Ankistrodesmus sp (a) (b) Ankistrodesmus sp chụp vật kính E40 E100 Mẫu tảo Ankistrodesmus sp nuôi ống nghiệm (bên trái) mẫu nước cất làm đối chứng (bên phải) 4.3 Xử lý vi khuẩn tạp nhiễm chất kháng sinh Hai dòng tảo lựa chọn để xử lý kháng sinh Scenedesmus sp Pediastrum sp 4.3.1 Kết xử lý kháng sinh mẫu tảo Scenedesmus sp  Mức độ sống sót vi khuẩn tạp nhiễm sau xử lý kháng sinh Mật số vi khuẩn sau xử lý kháng sinh 24 cao Tuy nhiên, qua 14 ngày, mật số vi khuẩn tạp nhiễm nghiệm thức có xử lý kháng sinh (ngoại trừ nghiệm thức bị nhiễm vi khuẩn trở lại) giảm rõ rệt (bảng 6) Nguyên nhân khả sản sinh chất diệt khuẩn tảo (antibacterial compound) Nhiều loài tảo có khả tổng hợp chất kháng sinh Dịch trích tế bào hay dịch trích từ mơi trường ni cấy nhiều loài tảo đơn bào (Chlorella vulgaris, Chlamydomonas pyrenoidosa) có hoạt tính kháng khuẩn, có tác dụng vi khuẩn G+ G- Cũng có báo cáo cho thấy dịch trích từ tảo Lục, tảo Silic tảo Giáp có hoạt tính kháng nấm Chun ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 27 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT (antifungal activities) (Borowitzka, 1992) Theo Jorgensen (1962) dẫn xuất chlorophyll ly trích từ lồi tảo Lục (Chlamydomonas reinhardi, Chlorella vulgaris, Scendesmus quadricauda) có hoạt tính kháng lại vi khuẩn G+, ví dụ Bacillus subtilis Trong nghiên cứu Abedin Taha (2008) cho thấy dịch trích tảo Scendesmus quadricauda có khả ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis Staphyllococcus aureus Sau xử lý kháng sinh, vi khuẩn tồn trở nên yếu Thêm vào đó, mật số chúng lúc thấp Do đó, chúng trở nên nhạy cảm với chất kháng sinh tảo tạo Bảng 6: Mức độ sống sót vi khuẩn tạp nhiễm tảo Scenedesmus sp sau xử lý kháng sinh ngày ngày 14 Mật số vi khuẩn ban đầu (tế bào/mL) Ngày thứ 14 Ngày Mật số vi khuẩn (tế bào/mL) 5x104 Tỉ lệ sống sót (%) 100 Mật số vi khuẩn (tế bào/mL) 7,5x10 Tỉ lệ sống sót (%) 150 50 0,1 0 75 0,15 0 Nghiệm thức 75 0,15 Nghiệm thức 250 0,5 Không xác định 17 Không xác định 0,034 Nghiệm thức đối chứng Nghiệm thức Nghiệm thức 5x104 Ngày Nghiệm thức đối chứng bị nhiễm vi khuẩn với mật số khoảng 5x104 tế bào/mL Chúng có dạng que ngắn khơng di động dạng que dài có khả di động Hình 13: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Scenedesmus sp ngày 1/8 đĩa có mũi tên nghiệm đối chứng khơng pha lỗng Theo chiều kim đồng hồ nghiệm thức đối chứng pha loãng 10 lần; nghiệm thức đối chứng pha loãng 100 lần; nghiệm thức đối chứng pha loãng 1000 lần; nghiệm thức 1; nghiệm thức 2; nghiệm thức nghiệm thức Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 28 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Các dạng khuẩn lạc vi khuẩn tạp nhiễm (hình 14) bao gồm: - Dạng 1: Khuẩn lạc trong; bề mặt trơn láng; dạng nhơ; bìa cưa; kích thước khoảng 2,5 mm - Dạng 2: Khuẩn lạc trong; bề mặt trơn láng; dạng nhơ; bìa ngun; kích thước khoảng 2,5 mm - Dạng 3: Khuẩn lạc màu trắng đục; bề mặt khơ, nhám; dạng lõm; bìa ngun; kích thước khoảng 2,5 mm - Dạng 4: Khuẩn lạc màu trắng đục; bề mặt sần; dạng nhơ; bìa cưa; kích thước khoảng mm - Dạng 5: Khuẩn lạc màu vàng; bề mặt trơn láng; dạng nhô; bìa ngun; kích thước khoảng 0,8 mm - Dạng 6: Khuẩn lạc màu vàng; bề mặt trơn láng; dạng nhơ; bìa ngun; Hình 14: Các dạng khuẩn lạc kích thước khoảng 1,5 mm nghiệm thức đối chứng Nghiệm thức khuẩn lạc dạng khuẩn lạc có hình thái tương tự khuẩn lạc dạng kích thước khoảng 0,5 mm tồn Mật số vi khuẩn tạp nhiễm khoảng 50 tế bào/mL (hình 13 15) Nghiệm thức cịn tồn khuẩn lạc dạng với mật số vi khuẩn tạp nhiễm cao (75 tế bào/mL) (hình 13 15) Nghiệm thức có mật số vi khuẩn tạp nhiễm tương đương với nghiệm thức (75 tế bào/mL) tồn dạng khuẩn lạc (hình 13 15) Nghiệm thức 4, số lượng vi khuẩn cịn Hình 15: Các dạng khuẩn lạc nghiệm thức 1, 2, tồn nhiều (250 tế bào/mL) xuất dạng khuẩn lạc (hình 13 15) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 29 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Ngày thứ 14 Nghiệm thức đối chứng xuất dạng khuẩn lạc 1, 2, dạng khuẩn lạc có hình thái tương tự khuẩn lạc dạng kích thước khoảng 0,5 mm (hình 16) Hình 16: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Scenedesmus sp ngày 14 1/6 đĩa có mũi tên nghiệm đối chứng pha loãng 100 lần Theo chiều kim đồng hồ nghiệm thức đối chứng pha loãng 1000 lần; nghiệm thức 4; nghiệm thức 3; nghiệm thức nghiệm thức Trong nghiệm thức xử lý kháng sinh, có nghiệm thức cịn xuất khuẩn lạc dạng Trong đó, nghiệm thức bị nhiễm khuẩn nặng Do mật số vi khuẩn cao mà khơng pha lỗng nên khơng thể xác định mật số vi khuẩn (hình 17) Hình 17: Khuẩn lạc nghiệm thức (mũi tên) nghiệm thức bị nhiễm vi khuẩn với mật số cao Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 30 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT  Sự phát triển tảo Scenedesmus sp sau xử lý kháng sinh Hỗn hợp chất kháng sinh sử dụng có ảnh hưởng tiêu cực lên tảo Nhất nồng độ cao (bảng 7) Bảng 7: Ảnh hưởng kháng sinh lên phát triển tảo Scenedesmus sp Mật số tảo (tế bào/mL) Chưa xử lý 14 ngày sau xử lý Tế bào Tế bào bị Tổng số bình thường biến dạng tế bào Nghiệm thức đối chứng 299.167 299.167 Nghiệm thức 98.333 98.333 38.750 163.750 202.500 Nghiệm thức 50.833 55.417 106.250 Nghiệm thức 276.250 10.625 286.875 Nghiệm thức 46.875 Sau 14 ngày, mật số tảo tất nghiệm thức gia tăng Nghiệm thức mật số tảo tăng khoảng lần so với ban đầu, nghiệm thức tăng lần nghiệm M ật số tả o (tế b /m L ) thức tăng lần (hình 18) 350000 300000 250000 Mật số tảo ban đầu 200000 150000 100000 Mật số tảo sau 14 ngày 50000 NT NT NT NT NT đối chứng Hình 18: Biểu đồ biểu diễn gia tăng mật số tảo Scenedesmus sp ngày thứ 14 sau xử lý kháng sinh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 31 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Tốc độ gia tăng mật số tảo Scenedesmus sp tỉ lệ nghịch với nồng độ chất kháng sinh Nồng độ kháng sinh cao tốc độ sinh trưởng giảm Nguyên nhân chất kháng sinh dihydrostreptomycin neomycin thuộc nhóm aminoglycosides Nhóm kháng sinh tiêu diệt vi khuẩn cách liên kết với ribosome vi khuẩn, làm ức chế trình tổng hợp protein cần thiết cho phát triển chúng Tuy nhiên, trình tổng hợp protein lục lạp tương tự vi khuẩn Do đó, nồng độ kháng sinh cao phá hủy lục lạp lớn Điều ảnh hưởng trực tiếp đến trình quang hợp tảo, làm giảm sức sống khả sinh trưởng tảo Ở nghiệm thức 3, mật số tảo thấp (khoảng 106.250 tế bào/mL), không tuân theo quy luật Nguyên nhân nghiệm thức bị nhiễm vi sinh vật Thêm vào đó, tảo bị ảnh hưởng bất lợi kháng sinh nên sức sống khả cạnh tranh so với vi sinh vật tạp nhiễm Kháng sinh gây phát triển không bình thường dịng tảo Scenedesmus sp Những biến đổi quan sát bao gồm: biến dạng tế bào, gai tế bào đầu tộc đồn phân hủy lục lạp (hình 19) a b Hình 19: Sự biến dạng tảo Scenedesmus sp kháng sinh (a) tế bào tảo bình thường (b) tế bào tảo bị biến dạng (chụp vật kính E100) Chun ngành Cơng nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 32 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 100% Tỉ lệ (%) 80% 96 100 52 81 60% 100 Tế bào bị biến dạng Tế bào bình thường 40% 48 20% 19 0% NT NT NT NT đối chứng NT Hình 20: Biểu đồ so sánh tỉ lệ biến dạng tảo Scenedesmus sp xử lý với nồng độ kháng sinh khác Nồng độ kháng sinh cao tỉ lệ biến dạng lớn Ở nghiệm thức 1, tất tế bào tảo bị biến dạng Tỉ lệ giảm xuống 81% 52% nghiệm thức Ở nghiệm thức 4, có 4% tế bào bị biến dạng (hình 20) 4.3.2 Kết xử lý kháng sinh mẫu tảo Pediastrum sp  Mức độ sống sót vi khuẩn tạp nhiễm sau xử lý kháng sinh Hỗn hợp kháng sinh cho kết tốt nghiệm thức Kiểm tra diện vi khuẩn ngày ngày 14 cho kết tế bào/mL (bảng 8) Bảng 8: Mức độ sống sót vi khuẩn tạp nhiễm mẫu tảo Pediastrum sp sau xử lý kháng sinh ngày ngày 14 Mật số vi khuẩn ban Ngày thứ 14 Ngày (tế bào/mL) 3,4x10 Tỉ lệ sống sót (%) 100 (tế bào/mL) 4,8x106 Tỉ lệ sống sót (%) 141 0 0 0 0 Nghiệm thức 0 0 Nghiệm thức 0 0 đầu (tế bào/mL) Nghiệm thức đối chứng Mật số vi khuẩn Nghiệm thức Nghiệm thức 3,4x106 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Mật số vi khuẩn Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 33 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Ngày Mẫu đối chứng bị nhiễm vi khuẩn nặng (3,4x10 tế bào/mL) (hình 21) Chỉ có dạng khuẩn lạc xuất hiện: Hình 21: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Pediastrum sp ngày 1/8 đĩa có mũi tên nghiệm đối chứng khơng pha loãng Theo chiều kim đồng hồ nghiệm thức đối chứng pha loãng 100 lần; nghiệm thức đối chứng pha loãng 1000 lần; nghiệm thức đối chứng pha loãng 10000 lần; nghiệm thức 1; nghiệm thức 2; nghiệm thức nghiệm thức - Dạng 1: Khuẩn lạc màu trắng đục; bề mặt trơn láng; dạng nhô; bìa ngun; kích thước khoảng 1,3 mm - Dạng 2: Khuẩn lạc màu trắng đục; bề mặt trơn láng; dạng nhơ; bìa ngun; kích thước khoảng 0,5 mm (hình 22) Tất mẫu xử lý kháng sinh không thấy diện vi khuẩn tạp nhiễm Hình 22: Các dạng khuẩn lạc nghiệm thức đối chứng ngày Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 34 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Ngày 14 Mật số vi khuẩn mẫu đối chứng có gia tăng (4,8x106 tế bào/mL) Hình thái khuẩn lạc giống mẫu đối chứng ngày kích thước khuẩn lạc nhỏ (hình 23) Hình 23: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn mẫu tảo Pediastrum sp ngày 14 1/6 đĩa có mũi tên nghiệm đối chứng pha loãng 1.000 lần Theo chiều kim đồng hồ nghiệm thức đối chứng pha loãng 10.000 lần; nghiệm thức 1; nghiệm thức 2; nghiệm thức nghiệm thức - Dạng 1: Khuẩn lạc màu trắng đục; bề mặt trơn láng; dạng nhơ; bìa nguyên; kích thước khoảng 0,5 mm - Dạng 2: Khuẩn lạc màu trắng đục; bề mặt trơn láng; dạng nhô; bìa ngun; kích thước khoảng 0,2 mm (hình 24) Tất mẫu xử lý kháng sinh không thấy diện vi sinh vật tạp nhiễm Hình 24: Các dạng khuẩn lạc nghiệm thức đối chứng ngày 14  Sự phát triển tảo Pediastrum sp sau xử lý kháng sinh Ở tất nồng độ kháng sinh, tỉ lệ tảo Pediastrum sp biến dạng mức 100% Các biến đổi bao gồm: phân hủy lục lạp, số tế bào tộc đoàn nhỏ lại liên kết tế bào (hình 25) Có thể dịng Pediastrum sp phân lập nhạy cảm với chất kháng sinh, neomycin có tác động mạnh lên tổng hợp protein ribosome 70S Kết phù hợp với nghiên cứu Jone et al (1973) cho thấy nồng độ neomycin 20 µg/mL làm chết tảo Pediastrum Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 35 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT boryanum (Turp.) Menegh var boryanum Cũng nghiên cứu này, hỗn hợp kháng sinh benzyl-penicillin-SO4, tetracycline, chloramphenicol aureomycin với nồng độ 1.000:250:30:25 µg/mL cho kết tốt, khơng có ảnh hưởng đáng kể lên tảo P boryanum Có thể áp dụng hỗn hợp kháng sinh thử nghiệm lại dòng tảo Pediastrum sp a b Hình 25: Sự biến dạng tảo Pediastrum sp kháng sinh (a) tế bào tảo bình thường (b) tế bào tảo bị biến dạng (chụp vật kính E100) Chun ngành Cơng nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 36 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - - 5.1 Kết luận Qua nghiên cứu phân lập phân loại đến chi dòng vi tảo thuộc lớp Chlorophyceae, chi khác Trong đó, Scenedesmus sp., Pediastrum sp., Actinastrum sp., Crucigenia sp., Ankistrodesmus sp thuộc Chlorococcales dòng tảo Chlamydomonas sp thuộc Volvocales Sử dụng hỗn hợp kháng sinh: penicillin G, dihydrostreptomycin neomycin với nồng độ tương ứng 62,5; 31,25 31,25 µg/mL xử lý vi khuẩn tạp nhiễm dòng tảo Scenedesmus sp từ 5x104 tế bào/mL xuống 17 tế bào/mL sau tuần xử lý Nồng độ gây biến dạng tế bào tảo mức 4% Tuy nhiên, hỗn hợp kháng sinh khơng phù hợp với dịng tảo Pediastrum sp Ở nồng độ thí nghiệm, tỉ lệ tế bào biến dạng 100% 5.2 Đề nghị Do thời gian hạn chế nên đề tài cịn nhiều thiếu sót Vì vậy, đề nghị tiến hành thêm số nghiên cứu tương lai nhằm đạt kết tốt Áp dụng kỹ thuật PCR để định danh xác dòng tảo Lục phân lập Xử lý vi khuẩn tạp nhiễm dòng tảo lại hỗn hợp kháng sinh nồng độ trên; tìm nồng độ thích hợp để ức chế vi khuẩn tạp nhiễm mà không ảnh hưởng nhiều đến tảo Tiếp tục kiểm tra mức độ nhiễm vi khuẩn dòng tảo Scenedesmus sp xử lý để có biện pháp can thiệp kịp thời mật số vi khuẩn tăng trở lại Thử nghiệm xử lý vi sinh vật tạp nhiễm hỗn hợp kháng sinh khác cho dòng Pediastrum sp hay áp dụng phương pháp khác (lọc, chiếu tia cực tím ) Chun ngành Cơng nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 37 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Dương Đức Tiến Võ Hành 1997 Tảo nước Việt Nam - Phân loại Tảo lục Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Đặng Minh Quân 2007 Phân loại học thực vật, tập - Thực vật bậc thấp Trường ĐH Cần Thơ Đặng Thị Sy 2005 Tảo học Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, Dương Đức Tiến Mai Đình Yên 2002 Thủy sinh học thủy vực nước nội địa Việt Nam Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hoàng Thị Sản 1999 Phân loại học thực vật Nhà xuất giáo dục Phạm Hoàng Hộ 1967 Tảo học Nhà xuất giáo dục Tiếng Anh Abedin, R.M.A and H.M Taha 2008 Antibacterial and Antifungal Activity of Cyanobacteria and Green Microalgae, Evaluation of Medium Components by Plackett-Burman Design for Antimicrobial Activity of Spirulina platensis Biotechnology & Biochemistry (1), pp 22-31 Andersen, R.A 2005 Algal Culturing Techniques Phycological society of America, pp 83 - 101, 117 – 133 Barsanti, L and P Gualtieri 2006 Algae: Anatomy, Biochemistry, and Biotechnology Taylor & Francis Group, Boca Raton, page 213, 214 Borowitzka, M.A and L.J Borowitzka, 1992 Microalgal Biotechnology Cambridge University Press USA Chisti, Y 2008 Biodiesel from microalgae beats bioethanol School of Engineering, Massey University, New Zealand Trends in Biotechnology, Vol.26 No.3, pp 126 – 131 Darzins, A and R Garofalo 2009 Algal biofuels: What is the real potential ? Biofuels Bioproducts & Biorefining Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 38 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Jones, K., M.E Rhodes and S.C Evans 1973 The use of antibiotics to obtain axenic cultures of algae European Journal of Phycology, 8: 2, pp 185 – 196 Jorgensen, E.G 1962 Antibiotic substances from cells and culture solutions of unicellular algae with special reference to some chlorophyll derivatives Physiol Plant Pienkos, P.T., and A Darzins 2009 The promise and challenges of microalgalderived biofuels Biofuels Bioproducts and Biorefining: vol 3, pp 431 - 440 Probert, I and C Klaas 1999 Microalgal culturing Based on a short course held in Caen, France Rodolfi, L., G.C Zittelli, N Bassi, G Padovani, N Biondi, G Bonini, M.R.Tredici 2008 Microalgae for Oil: Strain Selection, Induction of Lipid Synthesis and Outdoor Mass Cultivation in a Low-Cost Photobioreactor Biotechnology and Bioengineering, Vol 102, No Sheehan, J., T Dunahay, J Benemann and P Roessler 1998 A Look Back at the U.S Department of Energy’s Aquatic Species National Renewable Energy Laboratory 1617 Cole Boulevard Golden, Colorado Singh, M.I., M.C and F Bux 2008 The potential of microalgae isolated from wastewater treatment plants to be used a feestock for biodiesel production Durban University of Technology South Africa Stein, J.R 1973 Handbook of phycological methods Culture Methods and growth measurements Cambridge at the University Press, London, New York, pp 448 Website: www.algaebase.org (ngày 08/05/2010) www.keweenawalgae.mtu.edu (ngày 08/05/2010) www.soystats.com (ngày 15/12/2009) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 39 ... Do đó, thực đề tài ? ?Phân lập số dòng tảo Lục địa bàn thành phố Cần Thơ? ?? nhằm giải vấn đề 1.2 Mục tiêu Phân lập, mơ tả định danh số dịng tảo Lục Xử lý kháng sinh để thu mẫu tảo thuần, hạn chế vi... tính cách tiếp hợp tế bào tảo 2.1.4 Sự phân bố Tảo Lục phân bố rộng khắp từ nước nghèo dinh dưỡng đến nước lợ nước biển Một số tảo Lục sống biển Một số sống vật ẩm hay sống mặt đất Ở Việt Nam phát... thu Trung tâm học liệu 4.2 Phân lập tảo phương pháp hút tế bào Đã phân lập dòng vi tảo thuộc chi khác tảo Lục Tất dòng thuộc lớp Chlorophyceae (lớp phong phú ngành tảo Lục) Trong Chuyên ngành Công