Bước 1: Nuôi tăng sinh tảo trong môi trường BBM cải tiến Mục đích
Làm cho tảo thích nghi dần với môi trường.
Thành phần Khối lượng (g) Tryptone Yeast extract NaCl Agar 10 5 10 20
Lựa chọn được những loài tảo thích hợp với môi trường BBM cải tiến.
Pha loãng và làm sạch mẫu, giảm bụi và các hạt lơ lửng, giảm lượng chất hữu cơ hòa tan cũng như các vi sinh vật tạp nhiễm (vi khuẩn, nấm men...).
Tiến hành
Đầu tiên, mẫu được lắc đều. Sau đó, hút 20 mL mẫu cho vào bình tam giác chứa 80 mL môi trường BBM cải tiến đã khử trùng. Đậy bình tam giác bằng bọc nilon. Tránh đậy bằng nút gòn vì thời gian ủ tảo tương đối dài nên trên nút gòn thường có nấm phát triển, tạo thành bào tử rơi xuống mẫu gây khó khăn cho việc làm sạch tảo sau này. Bình tam giác được ủ ở nhiệt độ phòng, cách đèn huỳnh quang khoảng 50 cm, chu kỳ sáng tối là 12:12. Lắc đều mẫu mỗi ngày 1 lần.
Sau 1-2 tuần, mẫu tảo trong bình được sử dụng để làm ròng trong bước tiếp theo.
Bước 2: Phân lập tảo bằng phương pháp hút tế bào Mục tiêu
Thu được dòng tảo thuần, không có lẫn các tảo khác và động vật nguyên sinh nhưng cho phép nhiễm các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc).
Tiến hành
Thao tác chuẩn bị Pasteur pipette như sau: Một tay cầm pipette và tay kia cầm
kẹp giữ đầu còn lại của pipette. Xoay tròn pipette trên ngọn lửa để pipette nóng đều và trở nên mềm. Khi đầu pipette đủ mềm, di
chuyển pipette ra khỏi ngọn lửa, đồng thời kéo
pipette thành một ống có đường kính nhỏ. Nếu
kéo pipette quá nhanh hoặc trong ngọn lửa thì
đầu pipette bị gãy hoặc cháy làm cho pipette
không đạt yêu cầu. Sau đó, dùng kẹp bẻ gãy pipette ở vùng kéo dài ra. Yêu cầu là phải bẻ
gãy pipette tạo ra một đầu bằng phẳng và tròn. Nếu đầu pipette bị mẻ sẽ gây khó khăn trong
việc hút tế bào (hình 2).
Hình 2: Các bước chuẩn bị
Đầu tiên, nhỏ một giọt mẫu từ bình tam giác nuôi tăng sinh lên lame. Chuẩn bị
một lame khác và nhỏ lên vài giọt nước để rửa mẫu. Nước rửa mẫu là môi trường
BBM cải tiến được pha loãng 2 lần bằng nước cất (môi trường và nước cất đều phải được khử trùng). Tiếp theo, đưa giọt mẫu lên kính hiển vi, quan sát và sử dụng
micropipette hút một tế bào hay một tản tảo (đối với tảo cộng đơn bào và đa bào)
chuyển qua giọt nước rửa. Tiếp tục quan sát, hút và chuyển sang giọt nước rửa tiếp
theo. Quy trình được lặp lại cho đến khi sạch các tế bào tảo khác và nguyên sinh động
vật thì tế bào tảo cần hút được chuyển vào ống nghiệm chứa 1mL môi trường BBM
cải tiến. Ghi nhận thời gian và mô tả mẫu tảo hút được. Các ống nghiệm được ủ với cùng điều kiện như nuôi tăng sinh và được voltex nhẹ 2 ngày 1 lần.
Sau thời gian từ 1 đến 4 tuần, những ống nghiệm nào xuất hiện màu xanh được
kiểm tra độ ròng bằng kính hiển vi. Chụp hình (với độ phóng đại 40, 100, 400 và 1000 lần) và định danh đến mức độ chi của những dòng tảo đã ròng dựa vào các nguồn tài liệu sau:
- Dương Đức Tiến và Võ hành. 1997. Tảo nước ngọt Việt Nam. Phân loại bộ tảo lục. NXB nông nghiệp Hà Nội.
- Hình ảnh trên website: www.algaebase.org và www.keweenawalgae.mtu.edu
Thêm vào những ống nghiệm đã ròng 2 mL môi trường BBM cải tiến và đem ủ tăng sinh để có đủ lượng mẫu cho bước xử lý tiếp theo.
Bước 3: Xử lý vi khuẩn tạp nhiễm bằng chất kháng sinh Mục tiêu
Thu được mẫu thuần, hạn chế vi khuẩn tạp nhiễm.
Tiến hành
Chuẩn bị chất kháng sinh: penicillin G và dihydrostreptomycin thành phẩm có dạng bột, mỗi lọ đều chứa 1 g kháng sinh. Dùng kim tiêm vô trùng bơm 2 mL và 4 mL nước cất khử trùng lần lượt vào lọ penicillin G và dihydrostreptomycin. Lắc đều. Chuyển qua tuýp 2 mL để tiện sử dụng. Tất cả thao tác đều phải thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Neomycin được sử dụng dưới dạng thuốc nhỏ mắt, chai 5 mL chứa 25 mg neomycin. Các dung dịch kháng sinh được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng.
Các dòng tảo đã ròng ở bước 2 được chọn để tiến hành xử lý vi khuẩn tạp nhiễm. Trước tiên, mẫu tảo được đếm mật số. Phương pháp đếm mật số như sau:
- Đối với tảo đơn bào và đa bào kích thước nhỏ, mẫu sẽ được đếm bằng buồng đếm hồng cầu. Làm đều mẫu bằng voltex, dùng micropipette hút 20 µL mẫu cho vào buồng đếm. Đếm tổng số tế bào (đếm từng tế bào đối với tảo đa bào) trong 8 ô vuông lớn. Đếm 3 lần và lấy trung bình. Sau đó, áp dụng công thức
Tổng số tế bào đếm trong 8 ô
8
- Đối với tảo đa bào kích thước lớn, voltex, hút 10 µL mẫu và nhỏ lên lame thành 3 giọt. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính E4. Đếm tất cả tế bào trong 3 giọt mẫu. Đếm 3 lần và lấy trung bình. Áp dụng công thức
Tổng số tế bào/mL = Tổng số đếm trong 3 giọt mẫu x 100
Sau đó, mỗi dòng tảo được xử lý với hỗn hợp 3 chất kháng sinh: penicillin G, dihydrostreptomycin và neomycin ở 4 nồng độ như bảng 5.
Bảng 5: Các nghiệm thức xử lý kháng sinh với các nồng độ khác nhau
Nồng độ kháng sinh Penicillin G (µg/mL) Dihydrostreptomycin (µg/mL) Neomycin (µg/mL) Nghiệm thức đối chứng 0 0 0 Nghiệm thức 1 500 250 250 Nghiệm thức 2 250 125 125 Nghiệm thức 3 125 62,5 62,5 Nghiệm thức 4 62,5 31,25 31,25
Dùng micropipette hút 20 µL penicillin G, 20 µL dihydrostreptomycin (đã pha ở trên) và 1000 µL neomycin cho vào 9060 µL môi trường BBM đã khử trùng, voltex cho đều; ta được dung dịch A. Hút 500 µL dung dịch A cho vào tuýp 2 mL thứ nhất, thêm vào 500 µL mẫu tảo, được nghiệm thức 1. Tiếp tục hút 500 µL dung dịch A cho vào tuýp thứ 2, thêm vào 500 µL môi trường BBM, voltex, hút 500 µL chuyển sang tuýp thứ 3 và thay thế bằng 500 µL mẫu tảo; được nghiệm thức 2. Hút 500 µL môi trường BBM cho vào tuýp thứ 3, voltex, chuyển 500 µL sang tuýp thứ 4 và thay thế bằng 500 µL mẫu tảo; được nghiệm thức 3. Cho 500 µL môi trường BBM vào tuýp 4,
voltex và hút bỏ 500 µL, cho vào 500 µL mẫu tảo; được nghiệm thức 4. Hút 500 µL và 500 µL môi trường BBM cải tiến cho vào ống nghiệm làm nghiệm thức đối chứng. Các tuýp 2 mL và nghiệm thức đối chứng được ủ với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và chu kỳ sáng tối như trên trong 24 giờ.
Sau 24 giờ, các tuýp được ly tâm 1000 vòng trong 10 phút để loại bỏ kháng sinh và một phần vi khuẩn. Mẫu tảo lắng đáy được chuyển vào ống nghiệm tương ứng chứa 1 mL môi trường BBM. Kiểm tra vi khuẩn tạp nhiễm còn lại trong các nghiệm thức đã xử lý kháng sinh và nghiệm thức đối chứng bằng môi trường LB-agar. Cách tiến hành như sau: Voltex cho đều mẫu và hút 20 µL nhỏ thành 6 giọt trên bề mặt agar ở những vị trí đã đánh dấu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 24 giờ ủ ở 35 oC, đếm số khuẩn lạc, chia trung bình và áp dụng công thức sau:
Số tế bào/mL = Số khuẩn lạc trung bình x 50
Các nghiệm thức (xử lý kháng sinh và đối chứng) được ủ tiếp 14 ngày. Sau đó, các nghiệm thức được đếm mật số tảo (đếm số tế bào bình thường và biến dạng do kháng sinh) và kiểm tra vi khuẩn tạp nhiễm giống như trên.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
------
4.1 Thu mẫu và kiểm tra mẫu 4.1.1 Kết quả thu mẫu 4.1.1 Kết quả thu mẫu
Mẫu tảo được thu ở 3 địa điểm
Mẫu 1: Con mương phía trước khu Hiệu bộ, trường Đại học Cần Thơ. Mương đất, có nhiều loài cá sống tự nhiên, xung quanh có nhiều cỏ và cây cối lớn nên che phủ phần lớn diện tích ao. Nước ao có màu vàng, hơi xanh (Hình 3).
Mẫu 2: Ao nuôi cá trong Trại thực nghiệm, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. Ao đất, nuôi nhiều loại cá: cá chép, cá sặc, cá rô, cá lóc... Xung quanh có nhiều cỏ và cây cối nhỏ, không che khuất được ao nên lượng ánh sáng khá dồi dào. Nước ao có màu xanh đậm (Hình 4).
Mẫu 3: Hồ nước phía sau Trung tâm học liệu, trường Đại học Cần Thơ. Hồ bằng xi măng, ở giữa có trồng sen và thả cá rô phi, xung quanh khá trống trải nên lượng ánh sáng đầy đủ. Nước hồ có màu xanh (Hình 5).
Hình 4: Ao nuôi cá Trại thực nghiệm
Hình 3: Thu mẫu ở khu Hiệu bộ.
4.1.2 Kiểm tra mẫu
Mẫu tảo thu ở khu Hiệu bộ có màu xanh vàng (hình 6a). Đây là mẫu có mật số tảo thấp nhất và thành phần loài lại đa dạng nhất. Trong đó, tảo Silic và tảo Lục chiếm ưu thế. Tảo Silic chủ yếu là các chi thuộc bộ Coscinodiscales còn tảo Lục có các chi: Scenedesmus, Micractinium, Ankistrodesmus
Mẫu tảo thu ở ao cá Trại thực nghiệm có màu xanh đậm hơn (hình 6b). Quan sát dưới kính hiển vi thấy mẫu có mật số tảo rất cao và thành phần loài không đa dạng. Trong đó, tảo Lam chiếm ưu thế, chủ yếu là chi Oscillatoria. Sự ưu thế của tảo Lam chứng tỏ nước ao có hàm lượng N cao, có thể do lượng thức ăn dư thừa và các chất thải từ cá nuôi.
Mẫu tảo thu ở hồ nước Trung tâm học liệu có màu xanh rất nhạt (hình 6c). Quan sát dưới kính hiển vi thì thấy mẫu có thành phần loài khá đa dạng. Trong đó, tảo Lục chiếm đa số; ưu thế nhất là chi Pediastrum, kế đến là chi Scenedesmus. Ngoài ra, các chi Chlamydomonas, Actinastrum, Crucigenia cũng có xuất hiện nhưng mật số rất thấp.
4.2 Phân lập tảo bằng phương pháp hút tế bào
Đã phân lập được 6 dòng vi tảo thuộc 6 chi khác nhau của tảo Lục. Tất cả 6 dòng này đều thuộc lớp Chlorophyceae (lớp phong phú nhất trong ngành tảo Lục). Trong
Hình 6: Mẫu tảo thu ở 3 địa điểm.
(a) mẫu thu ở khu Hiệu bộ. (b) mẫu thu ở trại
Thực nghiệm. (c) mẫu thu ở Trung tâm học liệu.
đó, có 5 dòng thuộc bộ Chlorococcales và 1 dòng thuộc bộ Volvocales. Sau đây là mô tả và phân loại của 6 dòng tảo phân lập được.
4.2.1 Scenedesmus sp. Ngành: Chlorophyta Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Scenedesmaceae
Mô tả: Tản dạng tộc đoàn gồm 2 hay 4 tế bào xếp thẳng hàng. Các tế bào liên kết chặt; vị trí liên kết là ở giữa tế bào. Tế bào có dạng hình elip kéo dài. Hai tế bào ở đầu của tộc đoàn đều có gai dài (tương đương chiều dài tế bào), mỗi tế bào có 4 gai. Mỗi tế bào có một hạch lạp hình tròn, khá to, thường nằm gần sát vách và ở giữa tế bào (hình 7).
Hình 7: Scenedesmus sp. (a) Scenedesmus sp. dạng 2 tế bào chụp ở vật kính
E40. (b) Scenedesmus sp. dạng 4 tế bào chụp ở vật kính E40. (c) Scenedesmus sp. với
hạch lạp (mũi tên) khá rõ chụp ở vật kính E100. (d) Mẫu tảo Scenedesmus sp. nuôi trong
ống nghiệm (bên trái) và mẫu nước cất đối chứng (bên phải).
a
c
b
4.2.2 Pediastrum sp. Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Hydrodictyaceae
Mô tả: Tản dạng tộc đoàn gồm 8 hay 16 tế bào xếp trên một mặt phẳng. Tản có hình tròn hay hình ovan. Các tế bào liên kết chặt với nhau bằng toàn bộ vách tế bào. Đối với tản 8 tế bào, có 1 tế bào ở giữa và 7 tế bào còn lại bao xung quanh. Đối với tản 16 tế bào, các tế bào xếp thành các vòng tròn đồng tâm với tâm là 1 tế bào giữa, kế đến là 1 vòng gồm 5 tế bào, ngoài cùng là vòng tròn gồm 10 tế bào. Các tế bào bên trong có hình đa diện (thường có 6 cạnh). Các tế bào bên ngoài có 2 góc kéo dài ra và tận cùng là 2 gai nhọn. Hạch lạp hình tròn, khá to, thường nằm sát vách tế bào (hình 8).
Hình 8: Pediastrum sp. (a) và (b) Pediastrum sp. chụp ở vật kính E10 và E40. (c)
Pediastrum sp. dạng 8 (mũi tên) chụp ở vật kính E40. (d) Pediastrum sp. dạng 16 tế bào với
các hạch lạp rất rõ (mũi tên) chụp ở vật kính E100. (e) Mẫu tảo Pediastrum sp. nuôi trong ống
a b
4.2.3 Actinastrum sp. Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Senedesmaceae
Mô tả: Tản dạng tộc đoàn gồm 4 tế bào, mỗi tế bào đều có khả năng sống đơn độc. Các tế bào dính nhau ở một đầu còn đầu kia tỏa ra theo nhiều hướng. Sự liên kết giữa các tế bào rất lỏng lẽo. Tế bào kéo dài và nhọn ra ở một đầu (hình 9).
4.2.4 Chlamydomonas sp. Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Monadophycidae Bộ: Volvocales Họ: Chlamydomonadaceae
Hình 9: Actinastrum sp. (a) Mẫu tảo Actinastrum sp. nuôi trong ống nghiệm
(bên trái) và mẫu nước cất làm đối chứng (bên phải). (b) Actinastrum sp. chụp ở vật
kính E40
Mô tả: Tản đơn bào, có hình tròn. Tế bào có 2 roi ở đầu với kích thước bằng nhau nên tảo có khả năng bơi lội khá nhanh trong nước. Hạch lạp tròn, khá nhỏ (hình 10). 4.2.5 Crucigenia sp. Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Scenedesmaceae
Mô tả: Tản dạng tộc đoàn với 4 tế bào xếp trên cùng một mặt phẳng. Liên kết với nhau bằng vách tế bào và có chừa một khoảng trống ở trung tâm. Tế bào có hình tròn (Hình 11).
Hình 11: Crucigenia sp. (a) và (b) Crucigenia sp. chụp ở vật kính E40 và E100. (c) Mẫu
tảo Crucigenia sp. nuôi trong ống nghiệm (bên trái) và mẫu nước cất làm đối chứng (bên phải).
a b c
Hình 10: Chlamydomonas sp. chụp ở vật kính E40 (a)
và E100 (b)
4.2.6 Ankistrodesmus sp. Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Lớp phụ: Coccophycidae Bộ: Chlorococcales Họ: Ankistrodesmaceae
Mô tả: Tản dạng đơn bào. Tế bào kéo dài với 2 đầu nhọn, dạng thẳng. Các tế bào không có roi nên không có khả năng di động (Hình 12).
4.3 Xử lý vi khuẩn tạp nhiễm bằng chất kháng sinh
Hai dòng tảo được lựa chọn để xử lý kháng sinh là Scenedesmus sp. và
Pediastrum sp.
4.3.1 Kết quả xử lý kháng sinh của mẫu tảo Scenedesmus sp.
Mức độ sống sót của vi khuẩn tạp nhiễm sau khi xử lý kháng sinh
Mật số vi khuẩn sau khi xử lý kháng sinh 24 giờ còn khá cao. Tuy nhiên, qua 14 ngày, mật số của các vi khuẩn tạp nhiễm ở các nghiệm thức có xử lý kháng sinh (ngoại trừ nghiệm thức 3 bị nhiễm vi khuẩn trở lại) đều giảm rõ rệt (bảng 6). Nguyên nhân có thể do khả năng sản sinh ra chất diệt khuẩn của tảo (antibacterial compound). Nhiều loài tảo có khả năng tổng hợp chất kháng sinh. Dịch trích tế bào hay dịch trích từ môi trường nuôi cấy của nhiều loài tảo đơn bào như (Chlorella vulgaris, Chlamydomonas pyrenoidosa) có hoạt tính kháng khuẩn, có tác dụng trên cả vi khuẩn G+ và G-. Cũng có báo cáo cho thấy dịch trích từ tảo Lục, tảo Silic và tảo Giáp có hoạt tính kháng nấm
Hình 12: Ankistrodesmus sp. (a) và (b) Ankistrodesmus sp. chụp ở
vật kính E40 và E100. Mẫu tảo Ankistrodesmus sp. nuôi trong ống nghiệm (bên trái) và mẫu nước cất làm đối chứng (bên phải).
(antifungal activities) (Borowitzka, 1992). Theo Jorgensen (1962) dẫn xuất của chlorophyll được ly trích từ 3 loài tảo Lục (Chlamydomonas reinhardi, Chlorella vulgaris, Scendesmus quadricauda) có hoạt tính kháng lại vi khuẩn G+, ví dụ như
Bacillus subtilis. Trong nghiên cứu của Abedin và Taha (2008) cũng cho thấy dịch
trích của tảo Scendesmus quadricauda có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis
và Staphyllococcus aureus. Sau khi xử lý kháng sinh, những vi khuẩn còn tồn tại cũng trở nên yếu đi. Thêm vào đó, mật số của chúng lúc này khá thấp. Do đó, chúng trở nên rất nhạy cảm với chất kháng sinh do tảo tạo ra.
Bảng 6: Mức độ sống sót của vi khuẩn tạp nhiễm trong tảo Scenedesmus sp.
sau khi xử lý kháng sinh ở ngày 0 và ngày 14
Ngày 0
Nghiệm thức đối chứng bị nhiễm vi khuẩn với mật số khoảng 5x104 tế bào/mL. Chúng có dạng que ngắn không di động và dạng que dài có khả năng di động. Ngày 0 Ngày thứ 14 Mật số vi khuẩn ban đầu (tế bào/mL) Mật số vi khuẩn (tế bào/mL) Tỉ lệ sống sót (%) Mật số vi khuẩn (tế bào/mL) Tỉ lệ sống sót (%) Nghiệm thức đối chứng 5x104 100 7,5x104 150 Nghiệm thức 1 50 0,1 0 0 Nghiệm thức 2 75 0,15 0 0 Nghiệm thức 3 75 0,15 Không xác định Không xác định Nghiệm thức 4 5x104 250 0,5 17 0,034
Hình 13: Đĩa cấy kiểm tra vi khuẩn trong mẫu tảo Scenedesmus sp. ở ngày